李 嘉， 付婷婷， 張光峰， 劉向前， 陳 民△

（廣東省人民醫(yī)院 1正骨科，2中醫(yī)科，3風濕科，廣東廣州510080）

類風濕關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性自身免疫病，以滑膜異常增生、滑膜炎和關節(jié)外病變?yōu)橹饕卣?，成纖維細胞樣滑膜細胞（fibroblastlike synoviocytes，F(xiàn)LS）的過度增殖和凋亡不足是導致滑膜炎和骨破壞的重要原因［1］。因此，抑制滑膜細胞增殖、誘導滑膜細胞凋亡是治療RA的重要途徑之一。研究發(fā)現(xiàn)中藥及其有效成分可影響類風濕關節(jié)炎滑膜細胞增殖和凋亡，可為治療RA提供新途徑［2］。

青藤堿（sinomenine，SIN）是從傳統(tǒng)中藥青風藤中提取的堿類單體，具有免疫抑制和抗炎作用，治療RA效果較好［3］。SIN可通過降低關節(jié)滑漠中炎癥因子的表達改善RA發(fā)病進展和患者生存質(zhì)量［4］。SIN可防止軟骨和軟骨下骨破壞造成的關節(jié)畸形［5］。SIN還能抑制滑膜細胞異常增殖，誘導其凋亡［6］。然而SIN對RA FLS增殖和凋亡的分子機制尚不清楚。

微小RNA-23b-3p（microRNA-23b-3p，miR-23b-3p）通過靶向X連鎖凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP）可抑制RA FLS增殖，促進其凋亡［7］。miR-23b可抑制與白細胞介素17（interleukin-17，IL-17）相關的自身免疫炎癥［8］。成纖維細胞生長因子9（fibroblast growth factor 9，F(xiàn)GF9）是成纖維細胞生長因子家族的成員之一，可促進破骨前體細胞向破骨細胞的分化，影響骨質(zhì)疏松［9］。FGF9是成纖維細胞生長因子受體3（fibroblast growth factor receptor 3，F(xiàn)GFR3）的特異性配體，可激活激活FGFR3；而FGFR3信號的激活可減緩骨性關節(jié)炎中關節(jié)軟骨損傷的進程［10］。本實驗旨在研究SIN對RA FLS增殖和凋亡的影響及其分子機制是否與miR-23b-3p和FGF9有關。

材料和方法

1 滑膜標本采集

本實驗用滑膜標本取自本院2017年1月～2019年1月行關節(jié)鏡滑膜切除的RA患者關節(jié)內(nèi)滑膜組織，患者診斷癥狀符合美國風濕協(xié)會1987年類風濕關節(jié)炎的診斷標準；所取關節(jié)內(nèi)滑膜組織的患者均同意取其滑膜組織，且同意用于本研究，并簽署了知情同意書。

2 主要試劑與藥品

SIN（純度≥98%）購自上海源葉生物科技有限公司；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）購自上海如吉生物科技發(fā)展有限公司；胎牛血清和DMEM高糖培養(yǎng)基購自HyClone；CCK-8、凋亡檢測試劑盒和雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京索萊寶公司；抗FGF9、cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2及β-actin單抗購自上海煊翎生物科技有限公司；羊抗兔IgG-HRP購自上海恒斐生物科技有限公司；Trizol試劑和熒光定量試劑盒購自上海百研生物科技有限公司。

3 主要儀器

CO2細胞培養(yǎng)箱（Precision Scientific）；LightCycler 480熒光定量PCR儀（Roche）；酶標儀（Thermo）；FACSCalibur流式細胞儀、PowerPac蛋白電泳儀及Gel Doc XR+凝膠顯示系統(tǒng)（Bio-Rad）。

4 方法

4.1 人RA FLS的分離培養(yǎng)與鑒定 無菌條件下將類風濕關節(jié)炎滑膜組織除去多余組織，磷酸鹽沖洗后剪碎，用胰酶和膠原酶消化后在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中進行傳代培養(yǎng)，取第3代細胞進行鑒定，將RA FLS接種在6孔細胞板，細胞生長至80%左右時用4%多聚甲醛固定，再用0.5%Triton X-100室溫通透20 min，封閉液封閉1 h，加入I抗4℃孵育過夜，加入II抗孵育1 h。DAPI染色后封片，干燥后顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，細胞呈長梭形，胞核卵圓居中，符合FLS形態(tài)。取4～6代細胞用于后續(xù)實驗。

4.2 細胞處理與分組 用100 mg/L的LPS處理RA FLS記為LPS組；3.2 mmol/L SIN和100 mg/L LPS共同處理細胞，記為LPS+SIN組；不作任何處理的細胞作為空白（blank）組。將miR-con、miR-23b-3p、si-con和si-FGF9轉(zhuǎn)染至RA FLS中再用100 mg/L LPS處理，分別記為LPS+miR-con組、LPS+miR-23b-3p組、LPS+si-con組和LPS+si-FGF9組；將anti-miR-con、anti-miR-23b-3p、pcDNA和 pcDNA-FGF9轉(zhuǎn)染至 RA FLS中，再用3.2 mmol/L SIN和100 mg/L LPS共同處理，分別記為LPS+SIN+anti-miR-con組、LPS+SIN+anti-miR-23b-3p組、LPS+SIN+pcDNA組和LPS+SIN+pcDNA-FGF9組。

4.3 CCK-8法檢測細胞活力 選擇各組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h的細胞，每孔中加入10μL CCK-8試劑，孵育2 h后，酶標儀檢測490 nm處吸光度（A）值。細胞相對活力（%）=實驗組A值/空白對照組A值×100%。實驗重復3次。

4.4 集落形成實驗 取對數(shù)生長期細胞，制成1×107/L細胞懸液，以每孔100個細胞接種于6孔板中，每組設3個復孔，培養(yǎng)2周出現(xiàn)肉眼可見細胞集落時終止培養(yǎng)，PBS清洗2遍，甲醇固定15 min，吉姆薩染色30 min，在低倍光學顯微鏡下計數(shù)＞50個細胞的集落。

4.5 Western blot法檢測 FGF9、cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2的蛋白水平 各組細胞培養(yǎng)48 h后提取總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，再分別加入I抗（1∶1 000），4℃孵育過夜；加入II抗（1∶2 000）室溫孵育90 min，ECL發(fā)光液顯影，ChemiDoc XRS+系統(tǒng)成像，用Quantity One凝膠分析軟件測定蛋白條帶灰度值。蛋白相對表達水平=目的條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。每個蛋白樣品設3個重復。

4.6 流式細胞術檢測細胞凋亡 各組細胞培養(yǎng)48 h后用預冷的PBS漂洗2次，與500μL的結(jié)合緩沖液混勻。先加入10μL的annexin V-FITC，再加入5μL的PI，混勻后避光孵育10 min。用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。每組設3個復孔，實驗重復3次。

4.7 RT-qPCR檢測miR-23b-3p和FGF9 mRNA的表達水平 各組細胞培養(yǎng)48 h后提取細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，miR-23b-3p和FGF9分別以U6和GAPDH為內(nèi)參照進行PCR擴增，每個樣品重復3次。循環(huán)條件為95℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s，共40個循環(huán)；60℃延長5 min。miR-23b-3p的上游引物序列為5'-CACAAAGGCATCTCTACGCCCATC-3'，下游引物序列為5'-TGTAGCTGCC TCGCCAGAGGC-3'；U6的上游引物序列為5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物序列為5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；FGF9的上游引物序列為5'-AAGGACTGCGGCCTGATG-3'，下游引物序列為5'-TTTGCTTTAAGTTCA CTGCGATG-3'；GAPDH的上游引物序列為5'-TTAGCACCCCTGGCCAAGG-3'，下游引物序列為5'-CTTACTCCTTGGAGGCCATG-3'。目的基因的相對表達量采用 2-ΔΔCt法計算。

4.8 雙螢光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-23b-3p和FGF9的靶向關系 構(gòu)建包含miR-23b-3p結(jié)合位點的FGF9 3'UTR野生型和突變型螢光素酶載體（WTFGF9和 MUT-FGF9），將其與 miR-con、miR-23b-3p、anti-miR-con或anti-miR-23b-3p共轉(zhuǎn)染至RA FLS中，轉(zhuǎn)染48 h后，檢測螢光素酶相對活性。

5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料用均數(shù)±標準差（mean±SD）表示，兩組比較行t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 SIN抑制LPS誘導的人類風濕關節(jié)炎成纖維細胞樣滑膜細胞增殖

與空白組相比，LPS組的細胞活力升高，細胞集落形成數(shù)增多（P＜0.05）；與LPS組相比，LPS+SIN組細胞活力降低，細胞集落形成數(shù)減少（P＜0.05），見表1。

表1 青藤堿對LPS誘導的人類風濕關節(jié)炎成纖維細胞樣滑膜細胞活力和集落形成的影響Table 1.The effects of sinomenine（SIN）on the viability and colony formation of human rheumatoid arthritis fibroblastlike synoviocytes induced by LPS（Mean±SD.n=9）

2 SIN促進LPS誘導的人類風濕關節(jié)炎成纖維細胞樣滑膜細胞凋亡

與空白組相比，LPS組cleaved caspase-3和Bax蛋白水平降低，Bcl-2蛋白水平升高，細胞凋亡率降低（P＜0.05）；與LPS組相比，LPS+SIN組cleaved caspase-3和Bax蛋白水平升高，Bcl-2蛋白水平降低，細胞凋亡率升高（P＜0.05），見圖1。

3 SIN對LPS誘導的人類風濕關節(jié)炎成纖維細胞樣滑膜細胞miR-23b-3p和FGF9表達的影響

與空白組相比，LPS組miR-23b-3p的表達水平降低，F(xiàn)GF9的mRNA和蛋白表達水平升高（P＜0.05）；與LPS組相比，LPS+SIN組的miR-23b-3p表達水平升高，F(xiàn)GF9的mRNA和蛋白表達水平降低（P＜0.05），見圖2。

Figure 1 The effects of sinomenine（SIN）on human rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocyte apoptosis and expression of cleaved caspase-3，Bax and Bcl-2 proteins induced by LPS.A：Western blot was used to determine the protein levels of cleaved caspase-3，Bax，and Bcl-2 in human rheumatoid arthritis fibroblast-like synovial cells；B：flow cytometry was used to analyze the apoptosis.Mean±SD.n=9.*P＜0.05 vs blank group；#P＜0.05 vs LPS group.圖1 青藤堿對LPS誘導人類風濕關節(jié)炎成纖維細胞樣滑膜細胞凋亡和cleaved caspase-3、Bax及Bcl-2蛋白表達的影響

Figure 2.The effects of sinomenine（SIN）on the expression of miR-23b-3p，F(xiàn)GF9 mRNA and FGF9 protein in human rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes induced by LPS.A，B：RT-qPCR was used to determine the expression of miR-23b-3p and FGF9 mRNA in human rheumatoid arthritis fibroblast-like synovial cells；C：Western blot was used to determine the protein level of FGF9 in human rheumatoid arthritis fibroblast-like synovial cells.Mean±SD.n=9.*P＜0.05 vs blank group；#P＜0.05 vs LPS group.圖2 青藤堿對LPS誘導人類風濕關節(jié)炎成纖維細胞樣滑膜細胞miR-23b-3p、FGF9 mRNA及FGF9蛋白表達的影響

4 miR-23b-3p靶向調(diào)控FGF9的表達

TargetScan預測顯示miR-23b-3p與FGF9存在結(jié)合位點（圖3A）。螢光素酶報告基因?qū)嶒烇@示，與miR-con組相比，miR-23b-3p組轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-FGF9載體的細胞螢光素酶活性顯著降低（P＜0.05）；與antimiR-con組相比，anti-miR-23b-3p組轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-FGF9載體的細胞螢光素酶活性顯著升高（P＜0.05）；各組轉(zhuǎn)染MUT-FGF9載體的細胞螢光素酶活性無顯著差異，見圖3B。與miR-con組相比，miR-23b-3p組FGF9表達水平顯著降低（P＜0.05）；與anti-miR-con組相比，anti-miR-23b-3p組FGF9表達水平顯著升高（P＜0.05），見圖3C。

5 轉(zhuǎn)染miR-23b-3p或沉默F(xiàn)GF9抑制LPS誘導的人類風濕關節(jié)炎成纖維細胞樣滑膜細胞增殖并促進凋亡

Figure 3.Targeted binding site of miR-23b-3p to FGF9 3'UTR（A），dual-luciferase reporter assay results（B）and Western blot to determine the protein expression of FGF9 in human rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes（C）.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs miR-con group；#P＜0.05 vs anti-miR-con group.圖3 miR-23b-3p與FGF9 3'UTR存在靶向結(jié)合位點、雙螢光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果和Western blot檢測人類風濕關節(jié)炎成纖維細胞樣滑膜細胞FGF9蛋白的表達

與LPS+miR-con組相比，LPS+miR-23b-3p組miR-23b-3p表達水平升高，F(xiàn)GF9表達水平降低，cleaved caspase-3和Bax蛋白水平升高，Bcl-2表達水平降低，細胞活力降低，細胞集落形成數(shù)減少，細胞凋亡率升高（P＜0.05）；與LPS+si-con組相比，LPS+si-FGF9組FGF9表達水平降低，cleaved caspase-3和Bax蛋白水平升高，Bcl-2表達水平降低，細胞活力降低，細胞集落形成數(shù)減少，細胞凋亡率升高（P＜0.05），見圖4。

6 干擾miR-23b-3p或過表達FGF9抑制LPS誘導的人類風濕關節(jié)炎成纖維細胞樣滑膜細胞增殖和促進凋亡

與LPS+SIN+anti-miR-con組相比，LPS+SIN+anti-miR-23b-3p組的miR-23b-3p表達水平降低，F(xiàn)GF9的表達水平升高，cleaved caspase-3和Bax蛋白水平降低，Bcl-2蛋白水平升高，細胞活力升高，細胞集落形成數(shù)升高，細胞凋亡率降低（P＜0.05）；與LPS+SIN+pcDNA組相比，LPS+SIN+pcDNA-FGF9組FGF9的表達水平升高，cleaved caspase-3和Bax蛋白表達水平降低，Bcl-2蛋白表達水平升高，細胞活力升高，細胞集落形成數(shù)升高，細胞凋亡率降低（P＜0.05），見圖5。

討 論

RA是一種常見的風濕性疾病，其致殘率高，嚴重影響患者生活質(zhì)量，中醫(yī)藥治療RA療效好，安全性高，具有一定優(yōu)勢［11］。RAFLS是滑膜細胞的主要組成成分，在RA的發(fā)生發(fā)展中起重要作用［12］。已有研究表明SIN可降低RA患者體內(nèi)炎癥因子，改善患者臨床癥狀，具有治療RA的作用［13］。SIN聯(lián)合甲氨蝶呤對RA FLS具有協(xié)同抑制作用，抑制RA骨破壞［14］。本實驗通過用LPS處理RA FLS模擬其在體內(nèi)環(huán)境，用SIN作用LPS處理的RA FLS，結(jié)果顯示，細胞活力降低，細胞集落形成數(shù)減少，cleaved caspase-3和Bax的蛋白水平升高，Bcl-2的蛋白水平降低，細胞凋亡率升高，表明SIN可抑制RA FLS增殖，并促進細胞凋亡。

miRNA是一類保守的非編碼單鏈小分子RNA，能夠在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)mRNA表達導致蛋白翻譯抑制或促進靶mRNA降解，miRNA與關節(jié)炎滑膜細胞異常增殖的發(fā)生發(fā)展過程相關［15］。研究報道m(xù)iR-23b-3p可抑制RAFLS增殖，促進其凋亡［7］。研究還發(fā)現(xiàn)抗腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）/疾病修飾抗風濕藥聯(lián)合治療RA患者血清中的miR-23-3p上調(diào)表達，其作為抗TNF-α治療的類風濕關節(jié)炎患者治療效果的潛在生物標志物［16］。miR-23b-3p下調(diào)通過增加Bax和caspase-3的表達顯著抑制白細胞介素 1β（interleukin-1β，IL-1β）誘導的CHON-001細胞凋亡［17］。miR-23b-3p在心房成纖維細胞通過靶向轉(zhuǎn)化生長因子β III型受體（transforming growth factor-beta III receptor，TGFBR3）增強與纖維化相關基因的表達［18］。本實驗結(jié)果顯示，過表達miR-23b-3p后，cleaved caspase-3和Bax表達水平升高，Bcl-2表達水平降低，細胞活力降低，細胞集落形成數(shù)降低，細胞凋亡率升高，說明過表達miR-23b-3p可抑制RAFLS增殖，促進LPS誘導的細胞凋亡。本研究還發(fā)現(xiàn)SIN處理的RA FLS中miR-23b-3p表達水平升高，說明SIN可上調(diào)miR-23b-3p表達。且干擾miR-23b-3p逆轉(zhuǎn)了SIN對LPS誘導的RA FLS增殖和凋亡的影響，提示，SIN可能通過上調(diào)miR-23b-3p影響RA FLS增殖和凋亡。

Figure 4.The effects of transfection with miR-23b-3p or silencing of FGF9 on LPS-induced human rheumatoid arthritis fibroblast-like synovial cell proliferation，apoptosis，and cleaved caspase-3，Bax and Bcl-2 protein levels.A：RT-qPCR was used to determine the expression level of miR-23b-3p in human rheumatoid arthritis fibroblast-like synovial cells；B：MTT detection of human rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocyte viability；C：colony formation test to detect the number of colonies；D：Western blot was used to determine the protein level of FGF9 in human rheumatoid arthritis fibroblast-like synovial cells；E，F(xiàn)：flow cytometry was used to analyze the apoptosis.Mean±SD.n=9.*P＜0.05 vs LPS+miR-con group；#P＜0.05 vs LPS+si-con group.圖4 轉(zhuǎn)染miR-23b-3p或沉默F(xiàn)GF9對LPS誘導的人類風濕關節(jié)炎成纖維細胞樣滑膜細胞增殖、凋亡及cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白水平的影響

研究報道FGF9在RA組織中高表達，參與RA關節(jié)破壞的發(fā)?。?9］。miR-4317通過靶向FGF9抑制非小細胞肺癌增殖和集落形成［20］。miR-372-3p通過靶向FGF9促進肺鱗狀細胞癌中的細胞生長和轉(zhuǎn)移［21］。本實驗結(jié)果顯示，沉默F(xiàn)GF9抑制LPS誘導的RA FLS增殖并增加細胞凋亡。SIN處理的RAFLS中FGF9下調(diào)表達，且過表達FGF9逆轉(zhuǎn)了SIN對LPS誘導的RA FLS增殖和凋亡的影響，說明SIN影響RA FLS增殖和凋亡可能與FGF9表達有關。且本實驗還發(fā)現(xiàn)miR-23b-3p靶向負調(diào)控FGF9，提示SIN可能通過調(diào)控miR-23b-3p影響FGF9的表達進而影響RA FLS的增殖和凋亡。

綜上所述，SIN可通過miR-23b-3p/FGF9信號通路促進LPS誘導的RA FLS凋亡，抑制細胞增殖。

Figure 5.The effects of transfection of miR-23b-3p or overexpression of FGF9 on LPS-induced human rheumatoid arthritis fibroblastlike synoviocyte proliferation，apoptosis，and cleaved caspase-3，Bax and Bcl-2 protein levels.A：RT-qPCR was used to determine the expression level of miR-23b-3p in human rheumatoid arthritis fibroblast-like synovial cells；B：MTT detection of human rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocyte viability；C：colony formation test to detect the number of colonies；D：Western blot was used to determine the protein level of FGF9 in human rheumatoid arthritis fibroblast-like synovial cells；E，F(xiàn)：flow cytometry was used to analyze the apoptosis.Mean±SD.n=9.*P＜0.05 vs LPS+SIN+anti-miR-con group；#P＜0.05 vs LPS+SIN+pcDNA group.圖5 轉(zhuǎn)染miR-23b-3p或過表達FGF9對LPS誘導的人類風濕關節(jié)炎成纖維細胞樣滑膜細胞增殖、凋亡及cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白水平的影響