張 瑋,李海松
(河南省中研醫(yī)藥科技有限公司,河南 鄭州 450004)
滋陰熄暈丸為臨床經(jīng)驗(yàn)方,由熟地黃、酒萸肉、山藥、赤芍、茯苓、牡丹皮、澤瀉、菊花、天麻、枸杞子、鉤藤十一味中藥組成,具有滋腎養(yǎng)肝、息暈止眩的功效,可用于肝腎陰虛所致眩暈、頭痛、視物昏花、雙目干澀、腰膝酸軟、失眠多夢(mèng)、心煩口干等的治療,擬將其開發(fā)成醫(yī)院制劑投入臨床應(yīng)用。根據(jù)方中藥物的有效成分理化性質(zhì),采取部分藥材提取精制,部分藥材粉碎后直接入藥。方中酒萸肉中含有馬錢苷等苷類成分[1-2],赤芍中含有皂苷類成分[3],具有較好的水溶性,可采用加水煎煮提取。據(jù)報(bào)道,山茱萸中馬錢苷等環(huán)烯醚萜苷類成分[4-5]具有抑制神經(jīng)退行性病變(抑制Ca2+失衡、抗氧化應(yīng)激的損傷、神經(jīng)保護(hù)作用、抑制細(xì)胞凋亡、抗炎)、抗血栓等作用[6],芍藥苷具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、保肝、保護(hù)神經(jīng)、調(diào)節(jié)免疫、鎮(zhèn)靜催眠等多種藥理作用[7]?!吨袊?guó)藥典》2015版一部山茱萸和赤芍藥材分別測(cè)定了馬錢苷和芍藥苷的含量,在實(shí)驗(yàn)中采用正交實(shí)驗(yàn)法,選取酒萸肉中的馬錢苷、赤芍中的芍藥苷作為評(píng)價(jià)指標(biāo),優(yōu)選提取工藝。
滋陰熄暈丸處方組成:熟地黃、酒萸肉、山藥、赤芍、茯苓、牡丹皮、澤瀉、菊花、天麻、枸杞子、鉤藤。藥材由亳州市康博中藥飲片有限公司提供,經(jīng)河南省中醫(yī)藥研究院中藥所馬開副研究員鑒定為正品。馬錢苷對(duì)照品(批號(hào)111640-201303)、芍藥苷(批號(hào)110754-201621),均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。色譜用甲醇、乙腈,德國(guó)Merck公司產(chǎn)品;水為重蒸水;其他試劑為分析純。Waters高效液相色譜儀,配有2695分離單元、2996二極管陣列檢測(cè)器和Empower Ⅱ色譜工作站軟件,美國(guó)Waters公司產(chǎn)品;LIBROR-160DPT萬(wàn)分之一分析天平,日本島津公司產(chǎn)品;AE240十萬(wàn)分之一分析天平,瑞士METTLER公司產(chǎn)品;GT-350W超聲波提取器,濟(jì)寧科技超聲電子有限公司產(chǎn)品;DLSB低溫冷卻循環(huán)泵,鄭州凱鵬實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品;SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵, 鞏義市英峪儀器廠產(chǎn)品;恒溫水浴鍋,北京中興偉業(yè)儀器有限公司產(chǎn)品。
采用正交試驗(yàn)法,對(duì)煎煮的主要影響因素和水平進(jìn)行篩選,以煎煮次數(shù) (A)、 煎煮時(shí)間(B)和加水量(C)為考察因素,確定的因素水平表見表1。
表1 因素水平表
按處方比例平行稱取熟地黃、酒萸肉、澤瀉、枸杞子、赤芍和茯苓,共9份,按表1設(shè)定的因素水平表中參數(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn),將提取液濾過濃縮后,定容至100 mL,搖勻,作為正交試驗(yàn)樣品溶液。
參考《中國(guó)藥典》2010版一部山茱萸藥材項(xiàng)下有關(guān)含量測(cè)定方法[8-10],采用高效液相色譜(HPLC)法對(duì)正交試驗(yàn)樣品溶液中馬錢苷的含量進(jìn)行測(cè)定。
2.2.1 色譜條件
色譜條件:色譜柱為Aligent Zobax C18柱(4.6 mm × 250 mm,5 μm ),流動(dòng)相為乙腈-體積分?jǐn)?shù)3 mL /L磷酸溶液(12 ∶ 88),體積流量1 mL/min,柱溫35 ℃,檢測(cè)波長(zhǎng)240 nm。
2.2.2 溶液的制備
對(duì)照品溶液:精密稱取馬錢苷對(duì)照品1.30 mg,置于25 mL量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,即為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.052 g/L的馬錢苷對(duì)照品溶液。
供試品溶液:取2.1項(xiàng)下正交試驗(yàn)1~9號(hào)樣品溶液各2 mL,分別置25 mL量瓶中,緩緩滴加乙醇,振搖后定容至刻度,靜置過夜,濾過,取續(xù)濾液即得。
2.2.3 測(cè)定方法
分別精密吸取對(duì)照品溶液2,5,10,20,25 μL,正交試驗(yàn)供試品溶液各10 μL注入液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定。
2.2.4 結(jié) 果
波長(zhǎng)的選擇:按上述色譜條件分別進(jìn)樣馬錢苷對(duì)照品溶液10 μL和正交試驗(yàn)供試品溶液10 μL,對(duì)色譜中馬錢苷色譜峰在210~400 nm 進(jìn)行光譜掃描,結(jié)果在238~239 nm處有強(qiáng)吸收,且供試品和對(duì)照品色譜中馬錢苷峰的紫外吸收光譜基本一致。參照《中國(guó)藥典》2015版一部山茱萸[11]27項(xiàng)下含量測(cè)定,將測(cè)定波長(zhǎng)選擇為240 nm。
陰性對(duì)照試驗(yàn):按比例稱取除酒萸肉外的其他藥物,加水浸泡后煎煮3次,每次1 h,合并煎液,濃縮至100 mL,作為缺酒萸肉陰性對(duì)照藥。按2.2.2項(xiàng)下方法制備缺酒萸肉陰性供試品溶液,精密吸取對(duì)照品溶液10 μL、正交試驗(yàn)供試品溶液3 μL和缺酒萸肉陰性供試品溶液3~5 μL,按2.2.1項(xiàng)下色譜條件分析,結(jié)果:供試品溶液在與馬錢苷對(duì)照品色譜相對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間有相對(duì)應(yīng)的色譜峰,而缺酒萸肉陰性對(duì)照品色譜則在相對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間無吸收峰檢出。結(jié)果提示:處方中除酒萸肉外的其他藥物對(duì)測(cè)定無干擾。見圖1。
A.對(duì)照品;B.正交試驗(yàn)供試品; C. 缺酒萸肉陰性對(duì)照品 圖1 馬錢苷測(cè)定的HPLC色譜圖
線性關(guān)系考察:馬錢苷對(duì)照品溶液進(jìn)樣2,5,10,20,25 μL,以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X),峰面積為縱坐標(biāo)(Y),繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線為:Y=1.70×106X-1.74×104,r=0.999 9。結(jié)果表明:馬錢苷在0.104~1.300 μg范圍內(nèi),進(jìn)樣量與峰面積呈較好的線性關(guān)系。
精密度試驗(yàn):取同一份正交試驗(yàn)樣品的供試品溶液10 μL,按2.2.1項(xiàng)下色譜條件,連續(xù)進(jìn)樣6次,測(cè)定馬錢苷吸收峰的峰面積積分值。 結(jié)果RSD為0.83%,表明本法精密度較好。
重復(fù)性試驗(yàn):取同一正交試驗(yàn)樣品,按2.2.2項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液,精密吸取10 μL,按2.2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定馬錢苷吸收峰的峰面積積分值,計(jì)算供試品中馬錢苷的濃度。 結(jié)果RSD為0.79%,表明本法重復(fù)性較好。
穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一正交試驗(yàn)樣品的供試品溶液10 μL,于制備完成分別放置0,1,2,4,6 h,按2.2.1項(xiàng)下色譜條件,進(jìn)樣測(cè)定馬錢苷吸收峰的峰面積積分值。 結(jié)果RSD為0.89%,表明供試品溶液放置6 h基本穩(wěn)定。
加樣回收率試驗(yàn):精密吸取已知馬錢苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.615 g/L的正交試驗(yàn)樣品6份,每份1 mL,置25 mL量瓶中,精密加入用乙醇配制的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.650 g/L的馬錢苷對(duì)照品溶液1 mL,以下按2.2.2項(xiàng)下方法操作制備加樣回收供試品。按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算供試品溶液中馬錢苷的總量和馬錢苷的加樣回收率。結(jié)果:馬錢苷的平均加樣回收率為96.28%,RSD=1.53%,n=6。
參照《中國(guó)藥典》2015版一部赤芍[11]158項(xiàng)下有關(guān)含量測(cè)定方法,采用HPLC法對(duì)正交試驗(yàn)樣品溶液中芍藥苷的含量進(jìn)行測(cè)定。
2.3.1 色譜條件
色譜條件:色譜柱為Aligent Zobax C18柱(4.6 mm ×250 mm,5 μm );流動(dòng)相為乙腈-水(14 ∶ 86),體積流量1 mL/min,柱溫35 ℃,檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm。
2.3.2 溶液的制備
對(duì)照品溶液:精密稱取芍藥苷對(duì)照品5.25 mg,置100 mL量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.052 5 g/L的芍藥苷對(duì)照品溶液。
供試品溶液:同2.2.2項(xiàng)下供試品溶液的制備。
2.3.3 測(cè)定方法
分別精密吸取對(duì)照品溶液2,5,10,15,20,25 μL,正交試驗(yàn)供試品溶液各3 μL注入高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定。
2.3.4 結(jié) 果
測(cè)定波長(zhǎng)的選擇:按上述2.3.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣芍藥苷對(duì)照品溶液10 μL和正交試驗(yàn)供試品溶液3 μL,對(duì)色譜中芍藥苷色譜峰在210~400 nm 進(jìn)行光譜掃描,結(jié)果均在231~232 nm處有強(qiáng)吸收。參照《中國(guó)藥典》2015版赤芍項(xiàng)下含量測(cè)定,將測(cè)定波長(zhǎng)選擇為230 nm。
陰性對(duì)照試驗(yàn):按比例稱取除赤芍外的其他藥物,加水浸泡后煎煮3次,每次1 h,合并煎液,濃縮至100 mL,作為缺赤芍陰性對(duì)照藥。按2.2.2項(xiàng)下方法制備缺赤芍陰性供試品溶液。精密吸取對(duì)照品溶液10 μL、正交試驗(yàn)供試品溶液3 μL和缺赤芍陰性供試品溶液3~5 μL,按2.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析。結(jié)果:供試品溶液在與芍藥苷對(duì)照品色譜相對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間有相對(duì)應(yīng)的色譜峰,而缺赤芍陰性對(duì)照品色譜則在相對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間無吸收峰檢出。結(jié)果表明:處方中除赤芍外的其他藥物對(duì)測(cè)定無干擾。見圖2。
線性關(guān)系考察:芍藥苷對(duì)照品溶液進(jìn)樣2,5,10,15,20,25 μL,以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X),峰面積為縱坐標(biāo)(Y),得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=1.70×106X-2.69×103,r=0.999 1。結(jié)果表明:芍藥苷在0.105 0~1.312 5 μg范圍內(nèi),進(jìn)樣量與峰面積呈較好的線性關(guān)系。
精密度試驗(yàn):取同一份正交試驗(yàn)樣品的供試品溶液3 μL,按2.3.1項(xiàng)下色譜條件,連續(xù)進(jìn)樣7次,測(cè)定芍藥苷吸收峰的峰面積積分值。結(jié)果RSD為2.07%,表明本法精密度較好。
A.對(duì)照品;B.正交試驗(yàn)供試品; C.缺赤芍陰性對(duì)照品 圖2 芍藥苷測(cè)定的HPLC色譜圖
重復(fù)性試驗(yàn):取同一正交試驗(yàn)樣品,按2.3.2項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液,精密吸取3 μL,按2.3.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定芍藥苷吸收峰的峰面積積分值,計(jì)算供試品中芍藥苷的濃度。結(jié)果RSD為1.44%,表明本法重復(fù)性較好。
穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一份正交試驗(yàn)樣品的供試品溶液3 μL,分別放置0,1,2,4,6 h,按2.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,測(cè)定芍藥苷吸收峰的峰面積積分值。結(jié)果RSD為1.51%,表明供試品溶液放置6 h基本穩(wěn)定。
加樣回收率試驗(yàn):精密吸取已知芍藥苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.208 5 g/L的正交試驗(yàn)樣品6份,每份1 mL,置于25 mL量瓶中,精密加入用乙醇配制的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.782 g/L的芍藥苷對(duì)照品溶液1 mL,以下按2.3.2項(xiàng)下方法操作制備加樣回收供試品。按2.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行3 μL測(cè)定,計(jì)算供試品溶液中芍藥苷的總量和芍藥苷的加樣回收率。計(jì)算出的平均回收率為98.74%,RSD=1.18%,n=6。
正交試驗(yàn)結(jié)果:1~9號(hào)供試品溶液進(jìn)樣10 μL,按上述2.2和2.3項(xiàng)下色譜條件和供試品溶液制備方法,分別測(cè)定正交試驗(yàn)供試品溶液中馬錢苷和芍藥苷的峰面積和濃度,計(jì)算正交試驗(yàn)樣品供試品溶液中馬錢苷和芍藥苷的總量,結(jié)果見表2。
表2 正交試驗(yàn)結(jié)果
以空白列D列作為誤差列,用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)A、B、C列進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn),各因素統(tǒng)計(jì)處理分析結(jié)果見表3。
表3 馬錢苷正交試驗(yàn)數(shù)理統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果
對(duì)馬錢苷和芍藥苷各因素的不同水平測(cè)定結(jié)果進(jìn)行兩兩比較,結(jié)果:以馬錢苷為指標(biāo),因素A的一水平與二、三水平間有顯著性差異,二、三水平間有顯著性差異。以芍藥苷為指標(biāo),因素A的一水平與二、三水平間有顯著性差異,二、三水平間無顯著性差異。
分別以馬錢苷和芍藥苷為指標(biāo),因素B的一水平與二水平間有顯著性差異,一水平與三水平之間、二水平與三水平間均無顯著性差異。
以馬錢苷為指標(biāo),因素C的一、二、三水平間均有顯著性差異。
以芍藥苷為指標(biāo),因素A的一水平與三水平間,二水平與三水平間有顯著性差異,一水平與二水平間無顯著性差異。
綜合上述2.2和2.3項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)結(jié)果,以馬錢苷為指標(biāo)優(yōu)選出的最佳工藝條件為A3B2C3,以芍藥苷為指標(biāo)優(yōu)選出的最佳的工藝條件均為A3B2C3,兩者一致,即熟地黃、酒萸肉、澤瀉、枸杞子、赤芍和茯苓的最佳工藝條件是:藥材加水浸泡2 h后煎煮3次,每次1 h,加水量分別為10倍、8倍和8倍。
按2.4優(yōu)選出的最佳煎煮工藝條件,稱取2份熟地黃20 g、酒萸肉10 g、澤瀉10 g、枸杞子10 g、赤芍10 g和茯苓10 g,加水浸泡2 h,煎煮3次,每次1 h,加水量分別為10倍、8倍和8倍,合并煎液,濾過,濃縮濾液至100 mL,得到工藝驗(yàn)證用樣品溶液。精密吸取該溶液2 mL,分別置25 mL量瓶中,緩緩滴加乙醇,振搖后定容至刻度,靜置過夜,濾過,取續(xù)濾液,得到工藝驗(yàn)證用供試品溶液。按上述正交試驗(yàn)測(cè)定方法,分別測(cè)定供試品溶液中馬錢苷和芍藥苷的含量,計(jì)算供試品溶液中馬錢苷和芍藥苷的總量。結(jié)果見表4。結(jié)果表明,按優(yōu)選出的最佳煎煮條件制備的供試品溶液中馬錢苷和芍藥苷的測(cè)得量接近或超過了正交試驗(yàn)的最佳結(jié)果,較為理想。
表4 工藝驗(yàn)證結(jié)果
本研究采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì),采用HPLC法測(cè)定正交試驗(yàn)樣品中馬錢苷和芍藥苷的含量,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,綜合分析,篩選出了滋陰熄暈丸的最佳制備工藝。經(jīng)工藝驗(yàn)證,本研究所制定的制備工藝適合工業(yè)化生產(chǎn),工藝穩(wěn)定性較好。