張 瑋，李海松

(河南省中研醫(yī)藥科技有限公司，河南 鄭州 450004)

滋陰熄暈丸為臨床經(jīng)驗(yàn)方，由熟地黃、酒萸肉、山藥、赤芍、茯苓、牡丹皮、澤瀉、菊花、天麻、枸杞子、鉤藤十一味中藥組成，具有滋腎養(yǎng)肝、息暈止眩的功效，可用于肝腎陰虛所致眩暈、頭痛、視物昏花、雙目干澀、腰膝酸軟、失眠多夢(mèng)、心煩口干等的治療，擬將其開發(fā)成醫(yī)院制劑投入臨床應(yīng)用。根據(jù)方中藥物的有效成分理化性質(zhì)，采取部分藥材提取精制，部分藥材粉碎后直接入藥。方中酒萸肉中含有馬錢苷等苷類成分[1-2]，赤芍中含有皂苷類成分[3]，具有較好的水溶性，可采用加水煎煮提取。據(jù)報(bào)道，山茱萸中馬錢苷等環(huán)烯醚萜苷類成分[4-5]具有抑制神經(jīng)退行性病變(抑制Ca2+失衡、抗氧化應(yīng)激的損傷、神經(jīng)保護(hù)作用、抑制細(xì)胞凋亡、抗炎)、抗血栓等作用[6]，芍藥苷具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、保肝、保護(hù)神經(jīng)、調(diào)節(jié)免疫、鎮(zhèn)靜催眠等多種藥理作用[7]?！吨袊?guó)藥典》2015版一部山茱萸和赤芍藥材分別測(cè)定了馬錢苷和芍藥苷的含量，在實(shí)驗(yàn)中采用正交實(shí)驗(yàn)法，選取酒萸肉中的馬錢苷、赤芍中的芍藥苷作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)選提取工藝。

1 藥品、試劑與儀器

滋陰熄暈丸處方組成：熟地黃、酒萸肉、山藥、赤芍、茯苓、牡丹皮、澤瀉、菊花、天麻、枸杞子、鉤藤。藥材由亳州市康博中藥飲片有限公司提供，經(jīng)河南省中醫(yī)藥研究院中藥所馬開副研究員鑒定為正品。馬錢苷對(duì)照品(批號(hào)111640-201303)、芍藥苷(批號(hào)110754-201621)，均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。色譜用甲醇、乙腈，德國(guó)Merck公司產(chǎn)品；水為重蒸水；其他試劑為分析純。Waters高效液相色譜儀，配有2695分離單元、2996二極管陣列檢測(cè)器和Empower Ⅱ色譜工作站軟件，美國(guó)Waters公司產(chǎn)品；LIBROR-160DPT萬(wàn)分之一分析天平，日本島津公司產(chǎn)品；AE240十萬(wàn)分之一分析天平，瑞士METTLER公司產(chǎn)品；GT-350W超聲波提取器，濟(jì)寧科技超聲電子有限公司產(chǎn)品；DLSB低溫冷卻循環(huán)泵，鄭州凱鵬實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵， 鞏義市英峪儀器廠產(chǎn)品；恒溫水浴鍋，北京中興偉業(yè)儀器有限公司產(chǎn)品。

2 方法和結(jié)果

2.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用正交試驗(yàn)法，對(duì)煎煮的主要影響因素和水平進(jìn)行篩選，以煎煮次數(shù) (A)、 煎煮時(shí)間(B)和加水量(C)為考察因素，確定的因素水平表見表1。

表1 因素水平表

按處方比例平行稱取熟地黃、酒萸肉、澤瀉、枸杞子、赤芍和茯苓，共9份，按表1設(shè)定的因素水平表中參數(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將提取液濾過濃縮后，定容至100 mL，搖勻，作為正交試驗(yàn)樣品溶液。

2.2 馬錢苷的測(cè)定

參考《中國(guó)藥典》2010版一部山茱萸藥材項(xiàng)下有關(guān)含量測(cè)定方法[8-10]，采用高效液相色譜(HPLC)法對(duì)正交試驗(yàn)樣品溶液中馬錢苷的含量進(jìn)行測(cè)定。

2.2.1 色譜條件

色譜條件：色譜柱為Aligent Zobax C18柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm )，流動(dòng)相為乙腈-體積分?jǐn)?shù)3 mL /L磷酸溶液(12 ∶ 88)，體積流量1 mL/min，柱溫35 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)240 nm。

2.2.2 溶液的制備

對(duì)照品溶液：精密稱取馬錢苷對(duì)照品1.30 mg，置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.052 g/L的馬錢苷對(duì)照品溶液。

供試品溶液：取2.1項(xiàng)下正交試驗(yàn)1～9號(hào)樣品溶液各2 mL，分別置25 mL量瓶中，緩緩滴加乙醇，振搖后定容至刻度，靜置過夜，濾過，取續(xù)濾液即得。

2.2.3 測(cè)定方法

分別精密吸取對(duì)照品溶液2，5，10，20，25 μL，正交試驗(yàn)供試品溶液各10 μL注入液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定。

2.2.4 結(jié) 果

波長(zhǎng)的選擇：按上述色譜條件分別進(jìn)樣馬錢苷對(duì)照品溶液10 μL和正交試驗(yàn)供試品溶液10 μL，對(duì)色譜中馬錢苷色譜峰在210～400 nm 進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果在238～239 nm處有強(qiáng)吸收，且供試品和對(duì)照品色譜中馬錢苷峰的紫外吸收光譜基本一致。參照《中國(guó)藥典》2015版一部山茱萸[11]27項(xiàng)下含量測(cè)定，將測(cè)定波長(zhǎng)選擇為240 nm。

陰性對(duì)照試驗(yàn):按比例稱取除酒萸肉外的其他藥物，加水浸泡后煎煮3次，每次1 h，合并煎液，濃縮至100 mL，作為缺酒萸肉陰性對(duì)照藥。按2.2.2項(xiàng)下方法制備缺酒萸肉陰性供試品溶液，精密吸取對(duì)照品溶液10 μL、正交試驗(yàn)供試品溶液3 μL和缺酒萸肉陰性供試品溶液3～5 μL，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件分析，結(jié)果:供試品溶液在與馬錢苷對(duì)照品色譜相對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間有相對(duì)應(yīng)的色譜峰，而缺酒萸肉陰性對(duì)照品色譜則在相對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間無吸收峰檢出。結(jié)果提示：處方中除酒萸肉外的其他藥物對(duì)測(cè)定無干擾。見圖1。

A.對(duì)照品；B.正交試驗(yàn)供試品； C. 缺酒萸肉陰性對(duì)照品 圖1 馬錢苷測(cè)定的HPLC色譜圖

線性關(guān)系考察：馬錢苷對(duì)照品溶液進(jìn)樣2，5，10，20，25 μL，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Y=1.70×106X-1.74×104，r=0.999 9。結(jié)果表明：馬錢苷在0.104～1.300 μg范圍內(nèi)，進(jìn)樣量與峰面積呈較好的線性關(guān)系。

精密度試驗(yàn)：取同一份正交試驗(yàn)樣品的供試品溶液10 μL，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定馬錢苷吸收峰的峰面積積分值。 結(jié)果RSD為0.83%，表明本法精密度較好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一正交試驗(yàn)樣品，按2.2.2項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，精密吸取10 μL，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定馬錢苷吸收峰的峰面積積分值，計(jì)算供試品中馬錢苷的濃度。 結(jié)果RSD為0.79%，表明本法重復(fù)性較好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一正交試驗(yàn)樣品的供試品溶液10 μL，于制備完成分別放置0，1，2，4，6 h，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣測(cè)定馬錢苷吸收峰的峰面積積分值。 結(jié)果RSD為0.89%，表明供試品溶液放置6 h基本穩(wěn)定。

加樣回收率試驗(yàn):精密吸取已知馬錢苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.615 g/L的正交試驗(yàn)樣品6份，每份1 mL，置25 mL量瓶中，精密加入用乙醇配制的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.650 g/L的馬錢苷對(duì)照品溶液1 mL，以下按2.2.2項(xiàng)下方法操作制備加樣回收供試品。按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算供試品溶液中馬錢苷的總量和馬錢苷的加樣回收率。結(jié)果：馬錢苷的平均加樣回收率為96.28%，RSD=1.53%，n=6。

2.3 芍藥苷的測(cè)定

參照《中國(guó)藥典》2015版一部赤芍[11]158項(xiàng)下有關(guān)含量測(cè)定方法，采用HPLC法對(duì)正交試驗(yàn)樣品溶液中芍藥苷的含量進(jìn)行測(cè)定。

2.3.1 色譜條件

色譜條件：色譜柱為Aligent Zobax C18柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm )；流動(dòng)相為乙腈-水(14 ∶ 86)，體積流量1 mL/min，柱溫35 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm。

2.3.2 溶液的制備

對(duì)照品溶液：精密稱取芍藥苷對(duì)照品5.25 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.052 5 g/L的芍藥苷對(duì)照品溶液。

供試品溶液：同2.2.2項(xiàng)下供試品溶液的制備。

2.3.3 測(cè)定方法

分別精密吸取對(duì)照品溶液2，5，10，15，20，25 μL，正交試驗(yàn)供試品溶液各3 μL注入高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定。

2.3.4 結(jié) 果

測(cè)定波長(zhǎng)的選擇：按上述2.3.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣芍藥苷對(duì)照品溶液10 μL和正交試驗(yàn)供試品溶液3 μL，對(duì)色譜中芍藥苷色譜峰在210～400 nm 進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果均在231～232 nm處有強(qiáng)吸收。參照《中國(guó)藥典》2015版赤芍項(xiàng)下含量測(cè)定，將測(cè)定波長(zhǎng)選擇為230 nm。

陰性對(duì)照試驗(yàn)：按比例稱取除赤芍外的其他藥物，加水浸泡后煎煮3次，每次1 h，合并煎液，濃縮至100 mL，作為缺赤芍陰性對(duì)照藥。按2.2.2項(xiàng)下方法制備缺赤芍陰性供試品溶液。精密吸取對(duì)照品溶液10 μL、正交試驗(yàn)供試品溶液3 μL和缺赤芍陰性供試品溶液3～5 μL，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析。結(jié)果：供試品溶液在與芍藥苷對(duì)照品色譜相對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間有相對(duì)應(yīng)的色譜峰，而缺赤芍陰性對(duì)照品色譜則在相對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間無吸收峰檢出。結(jié)果表明：處方中除赤芍外的其他藥物對(duì)測(cè)定無干擾。見圖2。

線性關(guān)系考察：芍藥苷對(duì)照品溶液進(jìn)樣2，5，10，15，20，25 μL，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=1.70×106X-2.69×103，r=0.999 1。結(jié)果表明：芍藥苷在0.105 0～1.312 5 μg范圍內(nèi)，進(jìn)樣量與峰面積呈較好的線性關(guān)系。

精密度試驗(yàn)：取同一份正交試驗(yàn)樣品的供試品溶液3 μL，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣7次，測(cè)定芍藥苷吸收峰的峰面積積分值。結(jié)果RSD為2.07%，表明本法精密度較好。

A．對(duì)照品；B．正交試驗(yàn)供試品； C．缺赤芍陰性對(duì)照品 圖2 芍藥苷測(cè)定的HPLC色譜圖

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一正交試驗(yàn)樣品，按2.3.2項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，精密吸取3 μL，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定芍藥苷吸收峰的峰面積積分值，計(jì)算供試品中芍藥苷的濃度。結(jié)果RSD為1.44%，表明本法重復(fù)性較好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一份正交試驗(yàn)樣品的供試品溶液3 μL，分別放置0，1，2，4，6 h，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,測(cè)定芍藥苷吸收峰的峰面積積分值。結(jié)果RSD為1.51%，表明供試品溶液放置6 h基本穩(wěn)定。

加樣回收率試驗(yàn):精密吸取已知芍藥苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.208 5 g/L的正交試驗(yàn)樣品6份，每份1 mL，置于25 mL量瓶中，精密加入用乙醇配制的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.782 g/L的芍藥苷對(duì)照品溶液1 mL，以下按2.3.2項(xiàng)下方法操作制備加樣回收供試品。按2.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行3 μL測(cè)定，計(jì)算供試品溶液中芍藥苷的總量和芍藥苷的加樣回收率。計(jì)算出的平均回收率為98.74%，RSD=1.18%，n=6。

正交試驗(yàn)結(jié)果:1～9號(hào)供試品溶液進(jìn)樣10 μL，按上述2.2和2.3項(xiàng)下色譜條件和供試品溶液制備方法，分別測(cè)定正交試驗(yàn)供試品溶液中馬錢苷和芍藥苷的峰面積和濃度，計(jì)算正交試驗(yàn)樣品供試品溶液中馬錢苷和芍藥苷的總量，結(jié)果見表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

以空白列D列作為誤差列，用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)A、B、C列進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)，各因素統(tǒng)計(jì)處理分析結(jié)果見表3。

表3 馬錢苷正交試驗(yàn)數(shù)理統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

對(duì)馬錢苷和芍藥苷各因素的不同水平測(cè)定結(jié)果進(jìn)行兩兩比較，結(jié)果：以馬錢苷為指標(biāo)，因素A的一水平與二、三水平間有顯著性差異，二、三水平間有顯著性差異。以芍藥苷為指標(biāo)，因素A的一水平與二、三水平間有顯著性差異，二、三水平間無顯著性差異。

分別以馬錢苷和芍藥苷為指標(biāo)，因素B的一水平與二水平間有顯著性差異，一水平與三水平之間、二水平與三水平間均無顯著性差異。

以馬錢苷為指標(biāo)，因素C的一、二、三水平間均有顯著性差異。

以芍藥苷為指標(biāo)，因素A的一水平與三水平間，二水平與三水平間有顯著性差異，一水平與二水平間無顯著性差異。

2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果的綜合分析

綜合上述2.2和2.3項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以馬錢苷為指標(biāo)優(yōu)選出的最佳工藝條件為A3B2C3，以芍藥苷為指標(biāo)優(yōu)選出的最佳的工藝條件均為A3B2C3，兩者一致，即熟地黃、酒萸肉、澤瀉、枸杞子、赤芍和茯苓的最佳工藝條件是：藥材加水浸泡2 h后煎煮3次，每次1 h，加水量分別為10倍、8倍和8倍。

2.5 正交試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證

按2.4優(yōu)選出的最佳煎煮工藝條件，稱取2份熟地黃20 g、酒萸肉10 g、澤瀉10 g、枸杞子10 g、赤芍10 g和茯苓10 g，加水浸泡2 h，煎煮3次，每次1 h，加水量分別為10倍、8倍和8倍，合并煎液，濾過，濃縮濾液至100 mL，得到工藝驗(yàn)證用樣品溶液。精密吸取該溶液2 mL，分別置25 mL量瓶中，緩緩滴加乙醇，振搖后定容至刻度，靜置過夜，濾過，取續(xù)濾液，得到工藝驗(yàn)證用供試品溶液。按上述正交試驗(yàn)測(cè)定方法，分別測(cè)定供試品溶液中馬錢苷和芍藥苷的含量，計(jì)算供試品溶液中馬錢苷和芍藥苷的總量。結(jié)果見表4。結(jié)果表明，按優(yōu)選出的最佳煎煮條件制備的供試品溶液中馬錢苷和芍藥苷的測(cè)得量接近或超過了正交試驗(yàn)的最佳結(jié)果，較為理想。

表4 工藝驗(yàn)證結(jié)果

3 小 結(jié)

本研究采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用HPLC法測(cè)定正交試驗(yàn)樣品中馬錢苷和芍藥苷的含量，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，綜合分析，篩選出了滋陰熄暈丸的最佳制備工藝。經(jīng)工藝驗(yàn)證，本研究所制定的制備工藝適合工業(yè)化生產(chǎn)，工藝穩(wěn)定性較好。