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        UPLC-MSMS法同時測定炎可寧片中5種成分的含量

        2020-10-15 06:07:40丹,岳
        中醫(yī)研究 2020年11期

        張 丹,岳 磊

        (鄭州市食品藥品檢驗所,河南 鄭州 450006)

        炎可寧片由黃柏、大黃、黃芩、板藍根、黃連5味中藥組成,具有清熱瀉火、消炎止痢的功效,用于急性扁桃體炎、細菌性肺炎等[1]。目前,炎可寧片的質(zhì)量標準較多,但鑒別專屬性較差,無含量測定;或僅有針對個別藥味的鑒別和含量測定,未包含所有藥味。炎可寧片中含有多個藥味,每個藥味又含有多種化學成分[2-6],藥品質(zhì)量需要全面控制。采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)法來控制中成藥質(zhì)量,可同時測定多種成分,可不要求被測成分完全分離,且具有更高的專屬性和靈敏度[7-9]。本研究采用UPLC-MS/MS法對炎可寧片中黃芩苷、鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿、腺苷、大黃素的含量測定方法進行考察和優(yōu)化,大大提高了檢測效率和準確度,為炎可寧片質(zhì)量標準的完善提供了有力支撐。

        1 藥品、試劑與儀器

        炎可寧片為吉林吉春制藥股份有限公司產(chǎn)品(批號150703,161001,161002)、四川省三星堆制藥有限公司產(chǎn)品(批號160909,170207,170211)、四川省旺林堂藥業(yè)有限公司產(chǎn)品(批號161202,170201)、太極集團四川綿陽制藥有限公司產(chǎn)品(批號1609003)、遼寧金丹藥業(yè)有限公司產(chǎn)品(批號20160401)。黃芩苷對照品(純度93.5%,批號110715-201619,)、鹽酸小檗堿對照品(純度86.7%,批號110713-201814)、鹽酸黃柏堿對照品(純度93.9%,批號111895-201202)、腺苷對照品 (純度100%,批號110879-200202)、大黃素對照品(純度98.7%,批號110756-201512),均購自中國食品藥品檢定研究院;乙腈、甲醇為色譜純,均為德國默克公司產(chǎn)品;甲酸為質(zhì)譜純,美國Fisher公司產(chǎn)品;水為純凈水。ACQUITY UPLC 超高效液相色譜儀,美國Waters公司產(chǎn)品;4000 QTrap 質(zhì)譜分析儀,美國Absciex公司產(chǎn)品;XS205DU電子分析天平,瑞士Mettler Toledo公司產(chǎn)品;KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 色譜與質(zhì)譜條件

        2.1.1 色譜條件

        色譜柱為ACQUITY UPLC BEN C18(2.1 mm×50 mm,1.7 μm),流動相為乙腈(A)-體積分數(shù)1 mL /L甲酸溶液(B),體積流量0.3 mL/min,柱溫30 ℃,進樣量1 μL。梯度洗脫程序:0-3 min,20%→90%A;3-4 min,90%A;4-4.5 min,90%→20%A。

        2.1.2 質(zhì)譜條件

        電噴霧離子源(ESI),正、負離子切換模式掃描,多重反應監(jiān)測模式(MRM),源噴射電壓:5 500 V(正離子模式),-4 500 V(負離子模式);源溫度550 ℃;霧化氣(GAS1,GAS2)壓力50 psi,氣簾氣壓力(CAD)20 psi,碰撞反應氣為氮氣。5個待測成分的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

        表1 黃芩苷、鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿、腺苷和大黃素的質(zhì)譜參數(shù)

        2.2 混合對照品溶液制備

        精密稱取黃芩苷、鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿、腺苷、大黃素對照品適量,分別置于適合的量瓶中;取適量體積置同一個10 mL量瓶中,加甲醇制成混合對照品貯備溶液。精密量取上述混合對照品貯備溶液1 mL,置于10 mL量瓶中,加甲醇定容,制成混合對照品溶液,質(zhì)量分數(shù)分別為19.578 9,2.049 6,0.245 3,0.050 9 ,0.050 9 mg/L。

        2.3 供試品溶液制備

        取本品10片,除去包衣,研細,取約0. 1 g,精密稱定,置錐形瓶中,精密加入體積分數(shù)700 mL/L甲醇50 mL,稱定質(zhì)量,超聲30 min,放至室溫,再稱定質(zhì)量,用700 mL/L 甲醇補足減失的質(zhì)量,搖勻,用0.22 μm微孔濾膜濾過,得到供試品溶液。

        2.4 陰性對照溶液制備

        將空白輔料,按炎可寧片的處方比例混合,按照炎可寧片的制備工藝制得陰性對照樣品,按2.3項下的方法制備陰性對照溶液。

        2.5 專屬性試驗

        按2.1項下的色譜與質(zhì)譜條件,分別精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液及陰性對照溶液各1 μL,進樣測定,結(jié)果見圖1。結(jié)果顯示:陰性對照溶液在各成分提取離子流圖的相應位置上沒有干擾,專屬性強。

        1.腺苷;2.鹽酸黃柏堿;3.黃芩苷; 4.鹽酸小檗堿; 5.大黃素 A.對照品溶液; B.供試品溶液;C .陰性對照溶液 圖1 5種成分的提取離子流圖

        2.6 線性關(guān)系考察

        精密量取2.2項下的混合對照品貯備溶液0.1,0.5,1,5 mL,分別置10 mL量瓶中,加甲醇定容,制成系列濃度對照品溶液,進樣分析。以對照品質(zhì)量分數(shù)為橫坐標(X),以峰面積為縱坐標(Y)進行回歸,再分別以信噪比S/n=3、S/n=10時的質(zhì)量分數(shù)作為檢測限和定量限,結(jié)果見表2。結(jié)果表明:各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

        2.7 精密度試驗

        取2.2項下的混合對照品溶液,連續(xù)進樣6次。結(jié)果:黃芩苷、鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿、腺苷、大黃素峰面積的RSD分別為1.37%、2.21%、2.42%、4.59%、4.33%。結(jié)果表明:該方法的精密度符合要求。

        表2 線性關(guān)系、檢測限和定量限

        2.8 重復性試驗

        取批號為150703的炎可寧片細粉各6分,平行制備6份供試品溶液,進樣測定。結(jié)果測得黃芩苷、鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿、腺苷、大黃素的平均含量依次為1.080,1.800,0.342,0.0091,0.048 mg/片,其RSD依次為2.12%、2.38%、2.58%、4.87%、3.66%。結(jié)果表明:本方法重復性符合要求。

        2.9 穩(wěn)定性試驗

        取同一份批號為150703的供試品溶液,在室溫下放置0,2,4,6,8,10,12 h后測定。結(jié)果:黃芩苷、鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿、腺苷、大黃素峰面積的RSD依次為2.30%、2.62%、2.76%、4.03%、2.59%。結(jié)果表明:該供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

        2.10 加樣回收率試驗

        取同一批炎可寧片(批號150703),分別精密稱取6份0.05 g細粉,分別精密加入混合對照品貯備溶液適量,平行制備6份加標供試品溶液,計算加樣回收率。結(jié)果:黃芩苷、鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿、腺苷、大黃素的平均加樣回收率依次為96.63%、96.70%、93.16%、87.58%、90.27%,其RSD依次為2.42%、2.56%、3.12%、2.95%、2.84% 。

        2.11 供試品含量測定

        分別取10批炎可寧片,按照2.3項下方法制備供試品溶液,進樣分析,通過回歸方程計算含量,結(jié)果見表3。

        表3 供試品中黃芩苷、鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿、 腺苷、大黃素含量的測定結(jié)果n=6,mg·片-1

        3 討 論

        3.1 目標化合物的選擇

        炎可寧片現(xiàn)行的質(zhì)量標準較多,但在鑒別和含量測定中均未涉及板藍根中的化學成分,即未對炎可寧中板藍根這一藥味進行質(zhì)量控制。本試驗考察了板藍根中的多個指標性成分?!吨袊幍洹?015版一部中含有板藍根的中成藥將(R,S)-告依春作為指標性成分,但炎可寧片中(R,S)-告依春的含量非常小。靛玉紅是板藍根中的主要成分,但水溶性較差,在炎可寧片中的含量也極低。腺苷等核苷類成分在板藍根中的含量比較高,對板藍根及其制劑的品質(zhì)影響較大,因此選取了腺苷作為指標性成分。本實驗從炎可寧片每一味中藥中選取了一種指標選成分,這5種化合物包含了黃酮、生物堿、核苷和蒽醌類4種結(jié)構(gòu)類型,對炎可寧片進行較全面的質(zhì)量控制研究。

        3.2 供試品提取方法的考察

        本研究分別對提取方式、提取溶劑、提取時間進行研究和優(yōu)化。對于提取方式,筆者分別考察了超聲和回流,鑒于兩者的提取率差異不大,超聲提取的操作較簡便,故選擇超聲的提取方式。對于提取溶劑,筆者分別考察了甲醇、500 mL/L甲醇、700 mL/L甲醇、900 mL/L甲醇,結(jié)果以700 mL/L甲醇的提取率較高。對于提取時間,筆者分別考察了20 min、30 min、40 min,結(jié)果顯示30 min的提取率明顯高于20 min,但與40 min的無明顯差異。為了節(jié)省時間,筆者選擇提取時間為30 min。最終確定供試品提取方法是700 mL/L 甲醇超聲提取30 min。

        3.3 色譜條件的優(yōu)化

        對于流動相,筆者分別采用相同比例的甲醇-水、甲醇-1 mL/L甲酸、乙腈-水、乙腈-1 mL/L甲酸進行試驗。結(jié)果顯示,乙腈比甲醇的洗脫能力更強,各化合物的保留時間較合適。與純水相比,一定體積分數(shù)的甲酸溶液可使這5種化合物的信號響應明顯增強,且使峰形更加對稱。對甲酸的體積分數(shù)進行優(yōu)化時,顯示:當體積分數(shù)為1 mL/L時,流動相的洗脫能力更強,信號響應更高。采用梯度洗脫方式是考慮到其可有效提高洗脫能力和分離效率,縮短分析時間。因此,選擇乙腈-1 mL/L甲酸作為流動相,采用梯度洗脫方式進行試驗。

        綜上所述,本研究建立了UPLC-MS/MS同時測定炎可寧片中5個成分含量的方法。該方法靈敏度高,重復性好,專屬性強,測定迅速,結(jié)果準確。與現(xiàn)行質(zhì)量標準相比,該方法能提高檢測效率和準確度,可為炎可寧片質(zhì)量標準的進一步完善提供可靠依據(jù)。

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