陳靜華 余樹培

（鹽城市畜牧獸醫(yī)站，江蘇鹽城 224002）

鴨大腸桿菌病是由某些致病性或條件性致病性大腸桿菌引起的不同疾病的總稱，是生產(chǎn)中較為常見的細菌性疾病。鴨發(fā)病后常表現(xiàn)出精神沉郁、食欲不振，嗜睡，有時伴有下痢，同時伴有心包炎、肝周炎、氣囊炎、腹膜炎和輸卵管炎等一系列病變[1]，已成為危害鴨養(yǎng)殖業(yè)的一個重要疾病。鴨大腸桿菌病臨床上主要依靠抗生素進行治療，但大腸桿菌易產(chǎn)生耐藥性，加上抗生素被長期大量、不合理的濫用，導(dǎo)致大腸桿菌的耐藥菌越來越嚴重，臨床治療效果不佳。本研究選擇鹽城濱海地區(qū)疑似大腸桿菌病的病死鴨進行大腸桿菌的分離鑒定與耐藥性試驗，為濱海地區(qū)有效選擇抗菌藥物提供參考。

1 材料

1.1 病料

鹽城市濱海地區(qū)養(yǎng)鴨場的疑似病例，通過無菌操作采集病死鴨的腦、肝臟以及心臟等器官。

1.2 主要試劑

LB肉湯、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基購自上海博微生物科技有限公司，瓊脂糖購于上海玉博生物科技有限公司，引物由上海生工生物技術(shù)公司合成，十片裝藥敏試紙（氨芐西林、青霉素、環(huán)丙沙星、丁胺卡那、慶大霉素、紅霉素、頭孢唑林、氯霉素、諾氟沙星、復(fù)方新諾明）、革蘭氏染色液購自杭州微生物試劑有限公司，50×TAE緩沖液購自碧云天生物技術(shù)公司，4S GelRED核酸染料購自BBI生命科學(xué)有限公司。

2 實驗方法

2.1 細菌分離與純化

無菌采集病死鴨的肝臟組織，用接種環(huán)無菌挑取少量樣品組織接種于麥康凱培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后挑取單個菌落較大、表面平整，邊緣沒有凸起的單個紫紅色菌落接種于LB液體培養(yǎng)基上，放至37℃恒溫培養(yǎng)箱24h后進行革蘭氏染色、PCR鑒定。

2.2 革蘭氏染色觀察

在載玻片上滴一滴分離純化好的疑似大腸桿菌菌液，然后讓菌膜朝上，火焰固定，自然干燥，通過初染、媒染、脫色、復(fù)染，進行油鏡觀察。

2.3 PCR檢測

以分離純化獲得的菌液作為模板，進行菌液PCR檢測，同時設(shè)置陽性大腸桿菌對照和不加模板的陰性對照。

2.4 藥敏試驗

用槍頭從麥康凱培養(yǎng)基上挑取分離純化的大腸桿菌菌落數(shù)個，接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)12h。用移液器吸取200μL純化的大腸桿菌菌液打到麥康凱平板上，用滅菌涂布棒逆時針均勻涂抹。靜置2min左右，用無菌鑷子將藥敏試紙貼附在平板上。本次試驗共做三組，每組兩個平板，每個平板上貼5張藥敏紙片呈五角星形狀，共10張紙片。倒置在37℃恒溫箱中培養(yǎng)1d左右。觀察并記錄抑菌圈的直徑（mm）。

3 結(jié)果

3.1 分離純化

從病鴨組織中分離出三株大腸桿菌，每株大腸桿菌分別在麥康凱培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)24h后，長出紫紅色菌落，中心呈深桃紅色、圓形、扁平、邊緣整齊、表面光滑、濕潤的疑似大腸桿菌菌落。接種LB液體培養(yǎng)基試管中輕微搖晃混勻后在37℃，160 r/min的振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。次日觀察菌液呈混濁狀態(tài)，試管底部出現(xiàn)絮狀沉淀。

3.2 革蘭氏染色結(jié)果

挑取疑似大腸桿菌純培養(yǎng)物進行革蘭氏染色后，可見紫紅色的短小桿狀顆粒（如圖1），可知所提取菌均為G-菌。

圖1 鏡檢圖

3.3 PCR檢測結(jié)果

將3株疑似菌液進行菌落PCR檢測，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示如圖2，陽性大腸桿菌對照和3株分離菌都出現(xiàn)了預(yù)期大小（256bp）的目的條帶，而陰性對照未出現(xiàn)目的條帶。

從右向左依次為：菌株1、菌株2、菌株3，陽性大腸桿菌對照，陰性對照

3.4 藥敏試驗結(jié)果

將純化培養(yǎng)的3株大腸桿菌菌液分別涂布在麥康凱培養(yǎng)基上，用10種藥敏試紙進行藥敏性檢測。結(jié)果如圖3所示，三株細菌對不同抗生素的敏感程度均不同。

圖2 分離菌的PCR擴增結(jié)果

圖3 藥敏試驗

利用游標卡尺測量抑菌圈直徑（表1），結(jié)果顯示（表2）：該3株菌對氯霉素、紅霉素、青霉素全部耐藥。有2株菌對氨芐西林耐藥，1株中度敏感；2株對環(huán)丙沙星耐藥，1株中度敏感；1株菌對頭孢唑林耐藥，其余高度敏感；1株對諾氟沙星中度敏感，其余高度敏感；2株對復(fù)方新諾明耐藥，1株高度敏感；1株對丁胺卡那和慶大霉素高度敏感，其余中度敏感。菌株1和菌株3均對10種抗生素中的6種產(chǎn)生耐藥性。菌株2耐藥情況不太嚴重，但也對4種抗生素產(chǎn)生耐藥性并且對5種抗生素有耐藥的趨勢，僅對頭孢唑林高度敏感。

4 討論

本次試驗從濱海地區(qū)多個養(yǎng)鴨場采集病料，分離得到3株分離菌，在麥康凱培養(yǎng)基上長出紫紅色光滑菌落，染色鏡檢可見短小的粉紅色桿菌，均符合大腸桿菌的形態(tài)特征[2-3]。再通過PCR技術(shù)鑒定可確定本次試驗分離的3株菌為大腸桿菌。

隨著養(yǎng)鴨業(yè)的發(fā)展，抗生素類藥物用于防治細菌性疾病頻率越來越高，但隨著抗生素類藥物的使用，各類細菌的耐藥性也不斷的增強，使得多重耐藥性的細菌逐漸增多[4]。針對本次結(jié)果，建議養(yǎng)鴨場應(yīng)以預(yù)防為主，治療為輔。平時加強飼養(yǎng)管理，提高飼料品質(zhì)，增強營養(yǎng)，提高肌體的抵抗力，同時做好飼養(yǎng)環(huán)境的消毒，定期清理糞便，做好水域和地面的消毒，減少大腸桿菌的發(fā)病誘因。進行藥物防治時，一定要針對不同養(yǎng)殖場檢測大腸桿菌對藥物的敏感性，篩選其中最為敏感、最為高效的藥物進行防治。只有科學(xué)的飼養(yǎng)、合理的使用抗生素，才能有效預(yù)防和治療大腸桿菌病，保證養(yǎng)鴨業(yè)的健康發(fā)展。

表1 藥敏試驗抑菌圈直徑

表2 藥敏試驗結(jié)果