侯惠靜，張曉燕，陳建波，柳昊杰，孟令莉，石振鵬，吳子健，*，趙偉

（1.天津天獅學(xué)院食品工程學(xué)院，天津 301700；2.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點實驗室，天津 300134；3.天津商業(yè)大學(xué)國有資產(chǎn)與實驗室管理處，天津300134；4.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫214122）

葉黃素（lutein）是已知的600種類胡蘿卜素物質(zhì)之一，廣泛存在于綠葉植物中，如菠菜、甘藍、黃胡蘿卜以及萬壽菊花瓣[1]。其主鏈含有胡蘿卜素物質(zhì)典型的9個共軛雙鍵，而其分子的兩端含有羥基[2-3]，因而也屬于胡蘿卜醇的一種[4]。葉黃素具有很好的抗氧化性能[5-6]；也是構(gòu)成人類視網(wǎng)膜的主要黃斑色素，其多烯鏈的共軛長度決定了其最大吸收峰波長在藍光波譜范圍內(nèi)[7-8]，使其能有效吸收和過濾高能量且損傷視網(wǎng)膜細胞的藍光，進而減少視網(wǎng)膜的光氧化損傷[9-10]，改善視覺功能；此外，它還具有比β-胡蘿卜素更強的抗癌活性（如乳腺癌、前列腺癌等）[11-12]。然而，葉黃素分子結(jié)構(gòu)中的多不飽和雙鍵導(dǎo)致其在光照、氧氣、高溫等作用下易發(fā)生降解和異構(gòu)化，并且其水溶性也較差，因而其在人體中的生物利用率低[13]，這些都極大地限制了葉黃素在食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用。葉黃素的分子結(jié)構(gòu)[14]如圖1所示。

圖1 葉黃素的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Molecular structure of lutein

納米顆粒因其能夠通過囊封作用提高小分子活性物質(zhì)的化學(xué)穩(wěn)定性、水溶度以及生物利用率，被廣泛用于食品及醫(yī)藥工業(yè)中[15]。美拉德反應(yīng)將蛋白與糖共價結(jié)合形成的接枝產(chǎn)物可成為納米顆粒的壁材，用于活性物質(zhì)的包埋，進而提高活性物質(zhì)的理化穩(wěn)定性和水溶性[16]。Fan Y等[17]利用干熱法制備得到的BSA-葡聚糖共聚物，通過自組裝可與姜黃素形成納米顆粒，進而明顯提高姜黃素的化學(xué)穩(wěn)定性及細胞抗氧化活性；宋江峰等[18]使用辛烯基琥珀酸酯化淀粉和蔗糖為壁材，并通過單因素試驗和正交試驗優(yōu)化了包埋葉黃素的工藝；曾治平等[19]以明膠和阿拉伯膠為壁材，采用復(fù)凝聚法制備葉黃素納米顆粒，對葉黃素納米顆粒的制備工藝、理化性質(zhì)以及貯藏穩(wěn)定性進行了研究，徐建中等[20]優(yōu)化了葉黃素納米顆粒的工藝條件，解決了葉黃素在高含量條件下的穩(wěn)定性問題。

本研究擬通過制備牛血清白蛋白V與葡聚糖共聚物對葉黃素進行包埋形成納米顆粒。測定葉黃素納米顆粒的包封率，粒徑及Zeta電勢，分析納米顆粒的穩(wěn)定性；同時也檢測了葉黃素納米顆粒的體外及細胞抗氧化性能。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葉黃素（純度≥90%）：上海源葉生物科技有限公司；葡聚糖（分子量20 kDa）：MACKLIN公司；過硫酸鉀（純度99.5%）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；牛血清白蛋白Ⅴ（分子量 68 kDa）、2'，7'-二氯二氫熒 光 素 二 乙 酯 （2'，7'-dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA）、2，2'-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽（2，2'-azobis[2-methylpropionamidine]dihydrochloride ，ABAP）、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）：Sigma-Aldrich公司；平衡鹽溶液、胎牛血清等：賽默飛世爾科技；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

R-200旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、NTS-4000C恒溫振蕩水浴搖床：日本EYELA公司；Zetasizer Nano-ZS 90型納米粒度分析儀：英國Malvern公司；Apreo掃描電鏡：美國FEI公司；HERAcell vios 160i CO2培養(yǎng)箱、VARIOSKAN LUX微孔板檢測器：美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 牛血清白蛋白-葡聚糖共聚物的制備

采用濕法美拉德反應(yīng)制備牛血清白蛋白與葡聚糖共聚物[21]，具體步驟為：先將牛血清白蛋白V與葡聚糖按摩爾質(zhì)量比7∶1溶于磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L，pH=8.50）中，蛋白濃度為2.80 mg/mL，95℃下磁力攪拌2.3 h后，迅速冷卻并離心（6 000 r/min，4℃，15 min），取上清液并于4℃下透析24 h，分子截留量（20±0.2）kDa后，凍干即得牛血清白蛋白-葡聚糖共聚物（dextran-bovine serum albumin-lutein，DBSA）。

1.3.2 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳

參考王帥等[22]方法，具體參數(shù)：10%分離膠、4%濃縮膠、7.0 μL蛋白樣品上樣量、蛋白質(zhì)濃度1.0 mg/mL、電壓200 V。

1.3.3 傅里葉變換紅外光譜的測定

參考Cheng Z J等[23]的方法，并做出調(diào)整：稱取適量的樣品，加入一定量的溴化鉀（樣品與溴化鉀的質(zhì)量比為1∶100），研磨成均勻的粉末并壓成薄片，用傅里葉變換紅外譜儀作全波段（4 000 cm-1～400 cm-1）掃描，掃描16次，掃描前用溴化鉀薄片扣除背景。

1.3.4 葉黃素納米顆粒的制備

根據(jù)張雅婷等[24]的方法制備葉黃素納米顆粒，稍作修改，具體步驟為：將BSA和DBSA分別溶于去離子水中，蛋白濃度為2 mg/mL；葉黃素溶于一定濃度乙醇溶液，然后將葉黃素乙醇溶液分別加入蛋白溶液中，至每100 mL蛋白溶液中含葉黃素2.0 mg，混合后繼續(xù)在25℃下攪拌1.0 h；混勻溶液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)（溫度55℃下）除去乙醇后迅速冷卻，并調(diào)節(jié)溶液pH值至4.70，經(jīng)高壓均質(zhì)處理（作用壓力為85 MPa，循環(huán)3次）后再在4℃下靜置過夜，最后冷凍干燥，就可以得到兩種不同包埋材料的葉黃素納米顆粒，分別為BSA-lutein和DBSA-lutein。未進行高壓均質(zhì)處理的BSA與lutein混合物以及DBSA與lutein混合物經(jīng)干燥混合分別為Mix-BSA-lutein和Mix-DBSA-lutein。

1.3.5 納米顆粒包封率的測定

根據(jù)Muhoza等[25]的方法，測定游離葉黃素的含量，稍作修改。分別準(zhǔn)確量取0.5 mL的BSA-lutein和DBSA-lutein混合液，再加入2.0 mL正己烷，使它們充分混合后，將其離心（7 000 r/min，5 min），收集上層有機相，重復(fù)2次上述操作，將有機相合并，并在448 nm處測定其吸光值。配置不同濃度的葉黃素，按照上述方法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（y=0.822x+0.016，R2=0.99），以便計算游離葉黃素的含量。

總?cè)~黃素的含量。參照Muhoza等[25]的方法測定，稍作調(diào)整。取0.5 mL葉黃素納米顆粒，加入SDS調(diào)節(jié)終濃度為0.3 mol/L，充分振蕩混合后，置于30℃孵育5 min，測定448 nm處的吸光值，以不同濃度葉黃素做標(biāo)準(zhǔn)曲線（y=28.89x-0.013，R2=0.99）計算納米顆粒中葉黃素的總含量。

葉黃素納米顆粒的包封率按照如下公式（1）進行計算：

1.3.6 納米顆粒粒徑的測定

采用動態(tài)激光光散射法（dynamic light scattering，DLS）測定葉黃素納米顆粒的Zeta電位和粒徑分布[26]。設(shè)定散射角為90°，折光指數(shù)1.33，測定溫度25℃，保溫3.0 min。將待測樣品分別裝入聚苯乙烯比色皿和電解池中測定平均粒徑和Zeta電位。

1.3.7 掃描電子顯微鏡（scanning electronic microscope，SEM）

參考曹靜等[27]的方法，稍作調(diào)整：將樣品均勻黏附于掃描電鏡的樣品臺上進行噴金。對薄片進行掃描拍照，參數(shù)電壓為10 kV，放大倍數(shù)為100 000倍。

1.3.8 pH值對納米顆粒穩(wěn)定性的影響

用不同pH（2.00～7.00）的0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液溶解樣品（BSA-lutein或DBSA-lutein），25℃靜置1.0 h，按1.3.4中的方法測定納米顆粒粒徑和Zeta電位。

1.3.9 DPPH自由基清除率的測定

DPPH自由基清除率的測定參考Alam等[28]的方法。

1.3.10 ABTS+自由基清除率的測定

ABTS+自由基清除率的測定參考Seeram等[29]的方法。

1.3.11 羥基自由基清除率的測定

羥基自由基清除率的測定參考楊云舒等[30]的方法。

1.3.12 還原力的測定

還原力的測定參考張澤生等[31]的方法。

1.3.13 噻唑蘭（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）染色法

HepG2細胞于細胞培養(yǎng)瓶（25 cm2，康寧）中，置于37℃下、5% CO2和95%的相對濕度的培養(yǎng)箱中活化培養(yǎng)，期間需每兩天換一次培養(yǎng)基，細胞長滿培養(yǎng)瓶的90%時，取15代～30代細胞用于本研究。

根據(jù)Abbes等[32]的MTT法對葉黃素納米顆粒樣品（葉黃素濃度分別為 5、10、15、25、30 μg/mL）進行細胞毒性試驗，得到細胞抗氧化試驗的細胞安全濃度范圍。

以葉黃素純品為空白對照組，對數(shù)生長期的HepG2細胞接種于96孔板中，每孔接種100 μL；置于37℃、5% CO2、90%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，細胞完全貼壁。移去培養(yǎng)基后，用PBS緩沖液（pH=7.2）清洗2遍，加入樣品溶液，再于37℃下孵育24 h。移去培養(yǎng)基，加入 100 μL 的 MTT 溶液（5 μg/mL），再于 37℃培養(yǎng)箱中孵育2 h，除去上清液后，每孔再加入100 μL的DMSO溶劑，振蕩10 min，并于490 nm下檢測孔中的細胞OD值，按公式（2）計算HepG2細胞的存活率：

1.3.14 細胞抗氧化試驗

細胞抗氧化試驗參考Wolfe等[33]的方法，具體操作如下：選取對數(shù)期生長的HepG2細胞液（細胞密度為 6×104個/mL），黑邊黑底 96 孔板中每孔加入 100 μL HepG2細胞液，培養(yǎng)24h后，棄上清液，用100μL的PBS緩沖液洗滌孔板；將樣品溶液和DCFH-DA（25μmol/L）按照1∶1（體積比）添加100 μL至96孔板內(nèi)，孵育1 h后棄上清液，用PBS緩沖液洗滌孔板2遍；每孔再加入 100 μL ABAP（600 μmol/L），立刻將 96 孔板放入酶標(biāo)儀中，測定參數(shù)為37℃、發(fā)射波長535 nm、激發(fā)波長485 nm、每隔5 min讀數(shù)一次，持續(xù)1 h。對照組為DCFH-DA和ABAP混合液，空白組為DCFH-DA溶液。樣品空白組為BSA與DCFH和ABAP；DBSA與DCFH和ABAP。所得熒光讀數(shù)扣除空白之后，按照公式（3）計算細胞抗氧化活性（cellular antioxidant activity，CAA）值，繪制熒光值-時間的曲線：

式中：∫SA和∫CA分別為樣品和對照組熒光曲線的積分面積；EC50值（半數(shù)有效濃度）是由 log（fa/fu）對log（does）的中效曲線得出；其中fa和fu分別為受到樣品影響和未受到樣品影響的曲線面積；log（does）為樣品濃度的對數(shù)，當(dāng)log（fa/fu）=log 1=0時，所得濃度即為EC50。

1.3.15 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

使用96孔板進行的試驗均設(shè)置6組平行，其余試驗均重復(fù)3次，結(jié)果以均質(zhì)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)結(jié)果采用SPSS 17.0進行顯著性分析，顯著水平設(shè)定為p＜0.05，并使用origin 8.0進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉黃素納米顆粒分析結(jié)果

經(jīng)過方法1.3.1制備的DBSA-lutein和BSA-lutein納米顆粒凍干粉末如圖2所示。

圖2 蛋白-葉黃素納米顆粒凍干粉末及其復(fù)溶溶液的照片F(xiàn)ig.2 Photos of BSA-lutein and DBSA-lutein nanoparticle solution

DBSA-lutein的凍干粉末的顏色比BSA-lutein的深；二者分別復(fù)溶后，DBSA-lutein的復(fù)溶液顏色也較BSA-lutein的復(fù)溶液深一點，一般蛋白和糖經(jīng)過美拉德反應(yīng)，顏色都會加深，同時發(fā)現(xiàn)二者在水中的溶解度明顯提高，顏色清澈無懸浮物。溶液放置一周后，BSA-lutein溶液底部出現(xiàn)沉淀，是由于BSA-lutein納米顆粒會發(fā)生聚集而產(chǎn)生沉淀，而DBSA-lutein溶液仍能保持均勻，說明DBSA-lutein提高了葉黃素納米乳液的穩(wěn)定性，通常牛血清白蛋白等蛋白質(zhì)經(jīng)美拉德反應(yīng)后，可以與葡聚糖等非離子型多糖形成“蛋白-多糖”接枝物，此“蛋白-多糖”接枝物所形成的納米顆粒的穩(wěn)定性能有效提高，糖基化蛋白中蛋白部分通過疏水相互作用與所包埋的疏水性分子進行有效吸附，而葡聚糖可以為納米顆粒提供較強的空間位阻，進而穩(wěn)定“蛋白-多糖-疏水性功能分子”納米顆粒[34]。BSADextran共聚物的電泳圖見圖3。

圖3 牛血清白蛋白-葡聚糖接枝產(chǎn)物的SDS-PAGE圖片F(xiàn)ig.3 SDS-PAGE image of BSA-Dextran

如圖3所示，隨著美拉德反應(yīng)時間增加，牛血清白蛋白V的條帶逐漸變淺，同時電泳膠的上端出現(xiàn)較明顯的蛋白條帶，且條帶越來越深，表明有較大分子量的蛋白生成，且反應(yīng)時間的提高，更多的BSA參與了和Dextran反應(yīng)生成共聚物，且形成的共聚物分子量也不斷增加。通過傅里葉變換紅外光譜法進一步分析BSA與Dextran是否發(fā)生了接枝聚合反應(yīng)，通常當(dāng)分子中有-OH基團的引入，其紅外光譜上在3 700 cm-1～3200cm-1波數(shù)范圍內(nèi)的伸縮振動會變寬[35]；另外當(dāng)Dextran分子接枝到BSA分子上后會引起N-H鍵的伸縮振動[36]，其紅外光譜圖上表現(xiàn)為3 311 cm-1處（酰胺A帶N-H的伸縮振動）和3050 cm-1處（酰胺B帶N-H的伸縮振動）吸收峰增強[37]；同時葡聚糖接枝到蛋白上也引入了新的C-O鍵，紅外光譜圖上表現(xiàn)為1 000 cm-1處出現(xiàn)新吸收峰，即C-O鍵的吸收峰[38]。應(yīng)該是BSA和Dextran反應(yīng)生成了糖蛋白，如圖4所示。

圖4 樣品傅里葉變換紅外光譜圖Fig.4 FT-IR diagram of samples

表1對比了兩種葉黃素納米顆粒（BSA-lutein和DBSA-lutein）的包封率、平均粒徑、聚合物分散性指數(shù)以及納米顆粒的Zeta電位。

表1 兩種葉黃素納米顆粒的特征指標(biāo)對比Table 1 Characteristic index comparison of two kinds of encapsulation particles loaded lutein

包封率（encapsulation efficiency）是納米乳液穩(wěn)定性的重要指標(biāo)之一，通常是指被包裹親油性分子（如類胡蘿卜素物質(zhì)）在脂質(zhì)體懸液中占所有親油性分子物質(zhì)的百分比[39]；另外，平均粒徑、大小分布以及ζ-電位也都是納米乳液的重要指標(biāo)，平均粒徑小的納米顆粒的熱穩(wěn)定性高，且在水中的分散性能好[40]，聚合物分散性指數(shù)差異性較小說明所形成的乳液滴大小之間的差別不大，形成的乳液體系性能好，不會發(fā)生部分絮凝，此外一般形成的乳液滴的ζ-電位≥30 mV，乳液的穩(wěn)定性能很好，能夠有效防止乳液滴的聚集，降低乳液滴的絮凝[41]。如表1所示，DBSA對葉黃素的包封率為（95.86±0.83）%，高于BSA對葉黃素的包封率（77.82±1.58）%；DBSA-lutein和 BSA-lutein的平均粒徑分別為（176.8±6.5）nm 和（166.7±8.6）nm；另外 DBSA-lutein與BSA-lutein的聚合物分散性指數(shù)分別為0.176±0.07 和 0.276±0.05，均小于 0.3，同時說明分散體系穩(wěn)定性良好。產(chǎn)生這種現(xiàn)象可能的原因是：接枝后的蛋白分子量更大，使其粒徑較大，增加了載體疏水內(nèi)核的大小，提高了DBSA對葉黃素的包封率，DBSA-lutein的ζ-電位的絕對值也高于BSA-lutein，這也進一步說明DBSA-lutein比BSA-lutein的穩(wěn)定性更好。兩種葉黃素納米顆粒樣品的掃描電鏡圖如圖5所示。

圖5 葉黃素納米顆粒的掃描電鏡圖Fig.5 SEM images of encapsulation particles

從圖5中可知，BSA-lutein及DBSA-lutein納米顆粒的形態(tài)均為球形。根據(jù)標(biāo)尺可以估算出這兩種納米顆粒的粒徑也相似，約為200 nm。

2.2 葉黃素納米顆粒的pH值穩(wěn)定性

乳液的pH值對納米顆粒粒徑以及ζ-電位的影響可以判斷其對納米顆粒穩(wěn)定性的影響。不同pH值條件下兩種葉黃素納米顆粒穩(wěn)定性的變化如圖6所示。

圖6 pH值對兩種葉黃素納米顆粒平均粒徑與ζ-電位的影響Fig.6 Effects of pH on the Z-average diameter and Zeta potentialof protein-lutein nanoparticels

由圖 6（a）可得：在 BSA 蛋白的等電點（pH 4.00～5.00）附近，二者的粒徑均達到了最小值，而當(dāng)pH值變小或變大時，粒徑均會有一定的增大，但仍在200 nm以下；在pH值相同的情況下，DBSA-lutein的粒徑較BSA-lutein而言略大，這與糖蛋白載體大小相關(guān)。

通常較高的表面電荷使得納米顆粒間具有較強的相互斥力，進而使得納米顆粒在溶液中的溶解穩(wěn)定性較高[42]。由圖 6（b）可知：BSA-lutein 在 pH2.00～pH7.00范內(nèi)其ζ-電位的絕對值均小于20.0 mV，說明在BSA-lutein納米顆粒在此pH值范圍內(nèi)，穩(wěn)定性較差，這與之前復(fù)溶的BSA-lutein在一段時間后會有沉淀產(chǎn)生的結(jié)果一致；而對于DBSA-lutein納米顆粒而言，在pH 2.00～pH5.00范圍，其ζ-電位的絕對值小于20.0 mV，而在pH6.00和pH7.00時，其ζ-電位的絕對值分別是大于20.0 mV和30.0mV，DBSA-lutein納米顆粒的溶解穩(wěn)定性較好。

2.3 體外抗氧化性能

以維生素E（Trolox）為標(biāo)品，測定其不同濃度（0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/mL）下的抗氧化能力，并繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。4種化學(xué)抗氧化法（即DPPH自由基清除率、ABTS+自由基清除率、羥基自由基清除率、還原力）的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為：y1=631x+3.972，R2=0.991；y2=718.2x-2.163，R2=0.996；y3=477.5x+25.55，R2=0.991；y4=3.958x+0.046，R2=0.992。以維生素E當(dāng)量（mg/mg）表示各樣品之間的抗氧化性能，其結(jié)果如表2所示。

表2 葉黃素及其納米顆粒體外抗氧化性的比較Table 2 Antioxidant activity in vitro of lutein and nanoparticles

由表2可知，與lutein相比，BSA-lutein納米顆粒清除DPPH自由基的能力提高了0.7倍，清除ABTS+自由基的能力提高了2.2倍，清除羥基自由基的能力提高了0.2倍，還原力提升了0.3倍；而DBSA-lutein相應(yīng)的抗氧化能力則分別提升了1.6倍、2.5倍、1.2倍和0.5倍。表明葉黃素的抗氧化性能在經(jīng)過蛋白質(zhì)包埋后有了提升，但經(jīng)糖蛋白包埋后的提升效果更加明顯。Chen Tan等[43]研究得到經(jīng)糖蛋白包埋姜黃素后的抗氧化活性明顯提高，鄧楚君[44]利用葡聚糖-乳鐵蛋白復(fù)合物包埋姜黃素后，這些試驗都得出了相類似的結(jié)果?？赡艿脑蚴荄BSA、BSA、葡聚糖-乳鐵蛋白復(fù)合物以及其他的糖蛋白等微顆?；蚣{米顆粒的包材可以有效提高葉黃素等被包埋物質(zhì)的水溶性，而DPPH自由基清除率、ABTS+自由基清除率和羥基自由基清除率的測定以及還原力的測定，這些反應(yīng)都是在水溶液的環(huán)境中進行的，因此經(jīng)過包埋后疏水性物質(zhì)的相應(yīng)能力會有顯著提高。

lutein清除自由基的能力當(dāng)量均大于1，效果高于維生素E，而還原力當(dāng)量為0.962，與維生素E效果相近；Mix-BSA-lutein及Mix-DBSA-lutein的抗氧化能力較葉黃素強，這是由于牛血清白蛋白自身具有一定的抗氧化性能，但是只有在清除人工合成的自由基時，二者與葉黃素的差異性顯著，而清除羥基自由基和還原能力與葉黃素相比差異不顯著，可見蛋白與葉黃素單純混合對抗氧化能力的影響并沒有明顯的變化；BSA-lutein和DBSA-lutein納米顆粒的抗氧化性能高于混合物及葉黃素，且差異顯著，說明納米顆粒的形成能夠很好地增加葉黃素的抗氧化性能；DBSA-lutein比BSA-lutein的抗氧化能力強，在清除自由基方面差異顯著，而還原力差異不顯著，說明經(jīng)接枝改性后與葉黃素形成的納米顆粒能夠進一步提高葉黃素清除自由基的能力。

2.4 細胞抗氧化性

2.4.1 細胞存活率

據(jù)資料[45]顯示，難以被細胞吸收的化合物有以下特征：分子量>500，擁有5個及以上氫鍵供體，10個及以上氫鍵受體，而葉黃素正是這類化合物之一，其由于自身的結(jié)構(gòu)而導(dǎo)致化學(xué)性質(zhì)極其不穩(wěn)定，這些都限制了葉黃素在生活中的應(yīng)用。而通過納米顆粒包埋技術(shù)可以有效提高葉黃素在消化道內(nèi)的穩(wěn)定性和被細胞吸收的能力，從而改善葉黃素的功能特性。細胞毒性試驗的結(jié)果如圖7所示。

圖7 不同樣品對HepG2細胞的抑制作用Fig.7 Inhibition effects of different samples（lutein，BSA-lutein and DBSA-lutein）on HepG2 cells

樣品對HepG2細胞有一定的抑制作用，經(jīng)過包埋后，隨著葉黃素濃度的增加，抑制作用越明顯。當(dāng)葉黃素濃度低于15 μg/mL，不同樣品作用下HepG2的存活率均高于90%，即對HepG2無產(chǎn)生明顯的毒性，故在之后的細胞抗氧化試驗中，試驗樣品中葉黃素的濃度梯度設(shè)置上限不高于15 μg/mL。

2.4.2 細胞抗氧化試驗

不同樣品的細胞抗氧化性能檢測的試驗結(jié)果如圖8所示。

隨著葉黃素濃度的升高，樣品的CAA值都有不同程度的提高，說明葉黃素及納米顆粒都能夠進入到細胞內(nèi)并發(fā)揮其抗氧化活性的作用；此外，同一濃度條件下，3種樣品的CAA值由大到小依次為DBSA-lutein、BSA-lutein、lutein，表明包埋后的葉黃素納米顆粒確實可以提高葉黃素的細胞抗氧化活性。

以 log（does）值為 x 軸，樣品不同濃度下 log（fa/fu）值為y軸，得到不同樣品的中效曲線方程為lutein（y=1.391x-1.561，R2=0.993），BSA-lutein（y=1.585x-1.438，R2=0.989），DBSA-lutein（y=1.479x-1.076，R2=0.980）。當(dāng)log（fa/fu）=0（即 y=0）時，得到各樣品 EC50值分別為13.250、8.077、5.340 μg/mL，EC50值越低，表明樣品的抗氧化活性越好，由此可知DBSA-lutein的抗氧化活性比BSA-lutein提高了0.5倍，比lutein提高了1.5倍。

圖8 不同樣品的細胞抗氧化活性CAA值變化Fig.8 Changes of CAA values of cellular antioxidant activitiy in differents samples（lutein，BSA-lutein and DBSA-lutein）

3 結(jié)論

高壓均質(zhì)法所制備的BSA-lutein和DBSA-lutein納米顆粒，二者粒徑分別為（166.7±8.6）nm（PDI=0.276±0.05）和（176.8±6.5）nm（PDI=0.176±0.07），pH 值會影響納米顆粒的粒徑和Zeta電位，pH=4.00～5.00時，粒徑最小，其中pH=7.00時，納米顆粒最穩(wěn)定，DBSA-lutein粒徑較大、包封率＞95%，葉黃素納米顆粒也更加穩(wěn)定；與lutein相比，BSA-lutein和DBSA-lutein納米顆粒清除DPPH自由基能力分別提高了0.7倍和1.6倍，清除ABTS+自由基的能力分別提高了2.2倍和2.5倍，清除羥基自由基的能力分別提高了0.2倍和1.2倍，還原力分別提升了0.3倍和0.5倍；DBSA-lutein納米顆粒與BSA-lutein納米顆粒相比，除還原力差異不顯著外，其他3種體外抗氧化試驗均存在顯著差異。DBSA-lutein具有更好的細胞內(nèi)抗氧化活性。