董瑞珍，陳 垣，2*，郭鳳霞*，李 欠

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅省中藥材規(guī)范化生產(chǎn)技術(shù)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省藥用植物栽培育種工程研究中心，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅天士力中天藥業(yè)有限責(zé)任公司，甘肅省特色藥用植物資源保護(hù)與利用工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅省特色藥材規(guī)范化可追溯栽培工程技術(shù)研究中心，甘肅 定西 748100）

大黃為蓼科植物掌葉大黃、唐古特大黃或藥用大黃的干燥根和根莖，具有瀉下攻積、清熱瀉火、涼血解毒、逐瘀通經(jīng)、利濕退黃等功效。用于實(shí)熱積滯便秘、血熱吐衄、目赤咽腫、癰腫疔瘡、腸癰腹痛、瘀血經(jīng)閉、產(chǎn)后瘀阻、跌打損傷、濕熱痢疾、黃疸尿赤、淋證、水腫；外治燒燙傷［1］。大黃屬的不同種在我國分布地域性很強(qiáng)，藥用大黃主要分布在四川、云南、貴州等一帶高原山地地區(qū)；唐古特大黃主要分布在青藏高原一帶高寒陰濕地區(qū)；掌葉大黃主要分布在甘肅省禮縣一帶山地林緣半陰濕地帶。大黃野生資源已趨于瀕危，藥源主要為栽培品。甘肅省主要栽培唐古特大黃和掌葉大黃。甘南州一帶主產(chǎn)唐古特大黃，禮縣一帶是掌葉大黃的主要道地產(chǎn)區(qū)，禮縣大黃塊形大，質(zhì)地堅(jiān)實(shí)，藥理性能好，品質(zhì)優(yōu)良，有效成分含有量居中國掌葉大黃之首。

大黃是我國傳統(tǒng)大宗中藥材品種之一，具有重要的藥用價(jià)值。中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)是中藥研究和應(yīng)用領(lǐng)域的重點(diǎn)和難點(diǎn)［2］。目前，對(duì)大黃化學(xué)成分的研究主要集中在蒽酮衍生物類、蒽醌類、蒽酮類等。其中蒽醌類和蒽酮類是大黃的有效成分，是主要的蒽醌衍生物［3］?，F(xiàn)代藥理研究表明大黃中蒽醌類成分有抗菌［4-5］、抗病毒［6-10］、抗腫瘤［11-15］活性；蒽酮類成分具有瀉下作用［16］；而兒茶素和沒食子酸有止血作用［17］。但由于大黃存在品種來源不清、藥源混亂、生長地域差異性大、采收時(shí)間不當(dāng)和加工貯藏條件不同等因素，導(dǎo)致市售大多數(shù)大黃總蒽醌和游離蒽醌含有量達(dá)不到2015 年版《中國藥典》要求，嚴(yán)重影響大黃生產(chǎn)成效。對(duì)道地產(chǎn)區(qū)栽培大黃制定統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)顯得至關(guān)重要。指紋圖譜技術(shù)是國際公認(rèn)的控制中藥或天然藥物質(zhì)量的有效手段之一［18］，能夠反映出中藥中所共有的、具有特異性的某類或數(shù)類成分［19］。劉欣等［20］建立了12 批大黃樣品的HPLC 指紋圖譜；杜清濤等［21］通過不同品種不同產(chǎn)地大黃UPLC 指紋圖譜研究，發(fā)現(xiàn)3 個(gè)品種大黃對(duì)照藥材區(qū)別特征明顯；陳斌等［22］建立的不同產(chǎn)地掌葉大黃HPLC 指紋圖譜共有模式作為大黃藥材具有專屬性的指紋圖譜。本研究建立大黃HPLC 指紋圖譜，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行聚類分析和主成分分析，以期為大黃質(zhì)量監(jiān)控提供參考。

1 材料

1.1 儀器 LC-20AT 高效液相色譜儀（日本島津公司）；QE-200 高速粉碎機(jī)（浙江屹立工貿(mào)有限公司）；ME204/02型電子天平（十萬分之一，瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ2000VDE 型雙頻數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；SHB 循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城工貿(mào)有限公司）。

1.2 材料 沒食子酸（批號(hào)110831-201605，純度≥90.8%）、兒茶素（批號(hào)110877-201604，純度≥99.2%）、番瀉苷B（批號(hào)110825-201502，純度≥98.0%）、番瀉苷A（批號(hào)110824-201702，純度≥98.0%）、大黃素甲醚（批號(hào)110758-201415，純度≥99.1%）、大黃酸（批號(hào)110757-200206，純度100%）、蘆薈大黃素（批號(hào)110795-201308，純度≥97.8%）、大黃酚（批號(hào)110796-201520，純度≥99.2%）、大黃素（批號(hào)110756-201520，純度≥98.7%）、土大黃苷（批號(hào)110794，純度≥98.8%），均購自中國食品藥品檢定研究院。

13 批不同來源的大黃樣品，經(jīng)甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)陳垣教授鑒定其中12 批是掌葉大黃、1 批是唐古特大黃，見表1，均為2017 年采收的3 年生大黃，大黃在采挖后隨即切除側(cè)根，刮去外皮，切段或瓣，繩穿成串干燥或直接干燥和熏干。其中掌葉大黃隴南武都、宕昌和平?jīng)鋈A亭產(chǎn)區(qū)曬干，禮縣主要是熏干；而甘南州唐古特大黃曬干。

表1 樣品信息

2 方法

2.1 色譜條件 Kromasil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相甲醇（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～10 min，10%～20% A；10～30 min，20%～35% A；30～40 min，35%～40%A；40～50 min，40%～48%A；50～70 min，48%～55% A；70～80 min，55%～60% A；80～95 min，60%～90% A；95～100 min，90%～10% A；100～110 min，10%A）；體積流量0.8 mL/min；柱溫35 ℃；檢測波長280 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2.2 供試品溶液制備 精密稱定1.5 g 大黃樣品粉末（過4 號(hào)篩），置具塞錐形瓶中，加10 mL 0.1% NaHCO3水溶液，稱定質(zhì)量，超聲（30～40 ℃，700 W）處理20 min，再加入40 mL 甲醇，超聲處理50 min，取出，放冷，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量。經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液即得。

2.3 對(duì)照品溶液制備 精密稱定適量沒食子酸、兒茶素、番瀉苷A、番瀉苷B、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對(duì)照品，加甲醇分別制成質(zhì)量濃度分別為0.158 2、0.104 7、0.302 8、0.215 1、0.104 1、0.104 0、0.126 3、0.113 9、0.047 4 mg/mL 的溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次，測得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD 均小于3.0%，表明該儀器精密性良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱定S2 號(hào)大黃藥材粉末（過4號(hào)篩）1.5 g，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，分別于0、2、4、6、8、12、24、32、48 h 進(jìn)樣，測得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD 均小于3.0%，表明供試品溶液在48 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取S2 號(hào)大黃藥材粉末（過4號(hào)篩）6 份，每份1.5 g，，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，測得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD 均小于3.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

3 結(jié)果

3.1 指紋圖譜建立 取上述13 批大黃藥材，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，記錄大黃樣品在110 min 內(nèi)的色譜圖。用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004A 版）對(duì)其進(jìn)行處理，共標(biāo)定15個(gè)共有特征峰，作為判別大黃的群體特征峰［23］，見圖1。通過對(duì)比掌葉大黃藥材指紋圖譜、唐古特大黃藥材指紋圖譜，見圖2，發(fā)現(xiàn)唐古特大黃色譜峰在19～70 min 內(nèi)整體色譜峰高且多于掌葉大黃，（峰11～15）5 種蒽醌成分含有量唐古特大黃較為均衡，而掌葉大黃5 種蒽醌成分含有量差異較大。在與相同條件下生成的對(duì)照品色譜圖比對(duì)之后。確定1 號(hào)峰為沒食子酸、2 號(hào)峰為兒茶素、7 號(hào)峰為番瀉苷B、9 號(hào)峰為番瀉苷A、11～15 號(hào)峰依次為蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚。

圖1 13 批樣品HPLC 指紋圖譜

3.2 相似度分析 將13 批樣品圖譜導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004A 版）進(jìn)行分析處理，采用中位數(shù)法，以S1 號(hào)樣品色譜圖為參照?qǐng)D譜，隨后進(jìn)行多點(diǎn)校正和Mark 峰自動(dòng)匹配，生成大黃藥材對(duì)照?qǐng)D譜見圖3。與對(duì)照?qǐng)D譜進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，結(jié)果見表2。發(fā)現(xiàn)13 批樣品的相似度差異較大，其中12 批掌葉大黃圖譜相似度在0.598～0.987 之間，而唐古特大黃相似度為0.390。表明不同產(chǎn)地和不同品種大黃的出峰時(shí)間差異比較明顯。

圖2 各成分HPLC 色譜圖

圖3 大黃藥材對(duì)照?qǐng)D譜

表2 13 批樣品相似度

3.3 聚類分析 運(yùn)用SPSS 20.0 分析軟件對(duì)13 批樣品HPLC 指紋譜圖的15 個(gè)共有特征峰峰面積原始數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理后，以平方Euclidean 距離為度量標(biāo)準(zhǔn)，組間聯(lián)接的聚類方法進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果見圖4?？梢钥闯?，13 批樣品可分為6 類，其中甘南州卓尼縣扎古錄鎮(zhèn)（唐古特大黃）為第1 類；隴南市武都區(qū)池壩鄉(xiāng)、禮縣草坪鄉(xiāng)、禮縣白河鎮(zhèn)為第2 類；宕昌縣獅子鄉(xiāng)為第3 類；禮縣沙金鄉(xiāng)為第4 類；宕昌縣哈達(dá)鋪為第5 類；平?jīng)鍪腥A亭縣馬峽鎮(zhèn)、隴南市宕昌縣南陽鎮(zhèn)、禮縣銓水鄉(xiāng)、禮縣橋頭鎮(zhèn)、禮縣洮坪鄉(xiāng)、宕昌縣竹院鄉(xiāng)為第6 類。

圖4 13 批樣品聚類分析樹狀圖

3.4 主成分分析 利用SPSS 20.0 軟件中的因子分析對(duì)13批樣品的15 個(gè)共有特征峰峰面積數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，計(jì)算相關(guān)系數(shù)矩陣、主成分特征值和方差貢獻(xiàn)率。主成分特征值和方差貢獻(xiàn)率是選擇主成分的依據(jù)，載荷矩陣反映了各變量對(duì)主成分的重要程度［24］。由相關(guān)系數(shù)矩陣可以看出多數(shù)變量間存在相關(guān)關(guān)系，見表3，因此有必要進(jìn)行因子分析。經(jīng)因子分析所得的前5 個(gè)主成分特征值＞1，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為89.473%，它代表了13 批樣品圖譜中15 種成分的絕大多數(shù)信息，具有很好的代表性，可用于大黃藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)。結(jié)合主成分特征值和方差貢獻(xiàn)率、初始因子載荷矩陣、主成分三維圖，見表4～5、圖5。可知，第1 主成分的特征值為5.142，方差貢獻(xiàn)率為38.240%，載荷較高的峰有峰3～6、8，表明這5 個(gè)峰主要反映第1 主成分的信息；第2 主成分的特征值為3.319，方差貢獻(xiàn)率為22.125%，主要反映峰10、13～14 的信息；第3 主成分的特征值為2.294，方差貢獻(xiàn)率為15.293%，主要反映峰9、11 的信息；第4 主成分的特征值為1.639，方差貢獻(xiàn)率為10.929%，主要反映峰2、15 的信息；第5 主成分的特征值為1.027，方差貢獻(xiàn)率為6.846%，主要反映峰12 的信息。

表3 相關(guān)系數(shù)矩陣

表4 主成分初始特征值和貢獻(xiàn)率

表5 初始因子載荷矩陣矩陣

圖5 主成分三維折線圖

3.5 樣品含有量測定 按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，測定結(jié)果見表6。結(jié)果顯示，9 種成分總量S1、S2、S10、S11、S12 較好，S3、S5、S7 較差；游離蒽醌S2、S10、S12 較好，S3、S5、S7也較差；而沒食子酸、兒茶素、番瀉苷B 和番瀉苷A 總量S1、S4、S5、S10 較好，S3、S7、S11、S12 較差。

4 討論

4.1 條件優(yōu)化 研究表明大黃中成分在波長280 nm 下指紋圖譜峰容量較多，色譜信息豐富，基線平穩(wěn)；不同的提取方式對(duì)色譜峰的容量及峰面積影響不大，故以超聲為樣品處理方式［25-26］。本研究通過對(duì)同一樣品在相同色譜條件下比較254、260、280 nm 波長下的色譜圖，結(jié)果顯示280 nm較254、260 nm 下色譜峰數(shù)量多，峰面積大而且分離度好，因此選擇280 nm。最終確定 “2.1”項(xiàng)下色譜條件。

4.2 質(zhì)量評(píng)價(jià) HPLC 圖譜能夠反映樣品的整體性和特征性，是一種有效控制中藥成分復(fù)雜多樣質(zhì)量不一的方法。龔小紅等［27］通過對(duì)不同產(chǎn)地大黃13 種成分量進(jìn)行主成分比較研究發(fā)現(xiàn)，27 批樣品大黃的量存在較大的差異。王寧芳［28］對(duì)青海不同產(chǎn)區(qū)大黃的HPLC 指紋圖譜的對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)青海不同采集地唐古特大黃和掌葉大黃的平均相似度都在0.90 以上。本研究中13 批樣品的相似度有較大差異性，只有6 批相似度在0.90 以上，表明不同大黃品種間自然形成的本質(zhì)差異無法避免，但是藥材產(chǎn)地、海拔、采挖時(shí)間及干燥方法等客觀因素也可能導(dǎo)致大黃藥材之間存在較大差異。主成分分析、聚類分析表明大黃藥材的質(zhì)量與生長環(huán)境、產(chǎn)地加工方法有一定的相關(guān)性，但又沒有絕對(duì)的相關(guān)性。因此，建立全面系統(tǒng)的、可操作的大黃質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)顯得尤其重要。

4.3 結(jié)果分析 譚鵬等［29］研究結(jié)果表明唐古特大黃和掌葉大黃之間存在一定的質(zhì)量差異，主要為結(jié)合型蒽醌糖苷類的含有量差異，這也表明了定量測定大黃中的結(jié)合型蒽醌糖苷類成分對(duì)于評(píng)價(jià)不同來源的大黃藥材質(zhì)量差異具有重要意義。本研究結(jié)果表明9 種成分總含量產(chǎn)地為隴南市武都區(qū)池壩鄉(xiāng)、禮縣草坪鄉(xiāng)、禮縣沙金鄉(xiāng)、禮縣洮坪鄉(xiāng)、宕昌縣竹院鄉(xiāng)時(shí)較高，而產(chǎn)地為宕昌縣獅子鄉(xiāng)、哈達(dá)鋪鄉(xiāng)、南陽鎮(zhèn)時(shí)較少；游離蒽醌含有量禮縣草坪鄉(xiāng)、禮縣沙金鄉(xiāng)、宕昌縣竹院鄉(xiāng)較高，宕昌縣獅子鄉(xiāng)、哈達(dá)鋪鄉(xiāng)、南陽鎮(zhèn)較少；而沒食子酸、兒茶素、番瀉苷B 和番瀉苷A 總含量武都區(qū)池壩鄉(xiāng)、禮縣白河鎮(zhèn)和沙金鄉(xiāng)、宕昌縣哈達(dá)鋪鄉(xiāng)較高，宕昌縣獅子鄉(xiāng)、南陽鎮(zhèn)、竹院鄉(xiāng)、禮縣洮坪鄉(xiāng)較少。這進(jìn)一步表明產(chǎn)地和加工方法不能作為大黃質(zhì)量評(píng)價(jià)的唯一依據(jù)，應(yīng)綜合考慮產(chǎn)地、加工方法、土壤、海拔、氣候的影響。

表6 各成分含有量測定結(jié)果（%）

5 結(jié)論

大黃化學(xué)成分復(fù)雜多樣，單單憑借一種或幾種化學(xué)成分不足以表明大黃整體的質(zhì)量，而本研究所建立的方法，簡便、快捷，穩(wěn)定性、重現(xiàn)性良好，并通過含有量進(jìn)行定量分析，以期為大黃藥材質(zhì)量控制和品質(zhì)評(píng)價(jià)提供參考。