何 靖，黎耀和*，余 瑩，古學(xué)奎

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510405）

隨著腫瘤發(fā)病率的日益遞增，化療已經(jīng)成為了抗腫瘤不可或缺的治療方案之一。然而，常用化療藥物如阿霉素、氟尿嘧啶、紫杉醇等，均對(duì)患者心肌細(xì)胞產(chǎn)生了一定毒害作用，導(dǎo)致心肌損傷、心功能受損，出現(xiàn)胸悶、心悸、呼吸困難、心肌酶改變，甚則心衰等系列臨床表現(xiàn)。Kilickap等［1］研究發(fā)現(xiàn)，高達(dá)65%患者在蒽環(huán)類(lèi)藥物治療后出現(xiàn)了心率失常等心臟毒性的表現(xiàn)，且隨著藥物應(yīng)用劑量增加，其對(duì)心臟的累積毒性作用也越來(lái)越大［2］。藥物導(dǎo)致的心臟毒性極大地限制了其臨床應(yīng)用，因此，臨床診療工作中，預(yù)防如蒽環(huán)類(lèi)等抗腫瘤藥物所致的心臟毒性尤為重要。中醫(yī)藥憑借其固本祛邪、安全低毒等特點(diǎn)，在改善化療藥物不良反應(yīng)上顯現(xiàn)著巨大優(yōu)勢(shì)。其中，由黨參和黃芪為主方的參芪扶正注射液，具有益氣扶正固本的功效，能很好地改善患者因正氣虛弱而出現(xiàn)的心悸、氣短、乏力等心氣虛表現(xiàn)，恰體現(xiàn)中醫(yī) “虛則補(bǔ)之”的治療原則。臨床觀察［3-5］表明該藥有改善心肌供血、保護(hù)心臟等功效，可防治及減輕對(duì)心臟毒性，使得其在臨床中應(yīng)用愈加廣泛，然其具體作用機(jī)制尚無(wú)報(bào)道。本研究試通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究參芪扶正注射液防治心臟毒性的作用機(jī)理，以期為臨床醫(yī)生在工作中防治心臟毒性和改善患者預(yù)后提供臨床用藥及實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證的依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 化學(xué)成分構(gòu)建及篩選 在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)（TCMSP）（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）檢索參芪扶正注射液的組成中藥黨參、黃芪的所有化學(xué)成分，共搜集了221 個(gè)化合物，其中黨參134 個(gè)、黃芪87 個(gè)。為更好的篩選藥對(duì)中的有效化合物，本研究聯(lián)合口服利用度（OB）、類(lèi)藥性（DL）與CaCo-2 細(xì)胞滲透性進(jìn)行中藥活性成分的篩選。其中OB 反映的是藥物被機(jī)體吸收進(jìn)入循環(huán)的百分比；DL 代表類(lèi)藥性，能夠反映化合物中特定的功能基團(tuán)與大多數(shù)藥物相同或相似的物理特征；CaCo-2 細(xì)胞滲透性則可反映小腸上皮細(xì)胞對(duì)藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)效率?；诖耍瑢B≥30%、DL≥0.18、CaCo-2 細(xì)胞滲透性≥0 作為化合物分子的篩選標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)，結(jié)合手動(dòng)查閱及檢索結(jié)果，以確保最大程度納入藥物的活性成分。

1.2 藥物靶點(diǎn)篩選 在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)中查找與篩選出的藥對(duì)活性分子相對(duì)應(yīng)的蛋白靶點(diǎn)；同時(shí)利用UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.uniprot.org/），查詢(xún)靶點(diǎn)蛋白對(duì)應(yīng)的人類(lèi)基因名稱(chēng)，進(jìn)行名稱(chēng)標(biāo)準(zhǔn)化處理后錄入Excel 表格。

1.3 疾病靶點(diǎn)篩選 以“cardiotoxicity”“cardiac toxicity”為關(guān)鍵詞，檢索人類(lèi)孟德?tīng)栠z傳數(shù)據(jù)庫(kù)（OMIM，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/omim）與GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.genecards.org/），查找與心臟毒性相關(guān)的靶基因，合并2 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的搜索結(jié)果，去除重復(fù)和假陽(yáng)性的基因，以score＞5 作為疾病靶點(diǎn)篩選的標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 運(yùn)用UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)，查詢(xún)參芪扶正注射液中活性分子的相關(guān)靶點(diǎn)，將藥物作用靶點(diǎn)與疾病相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行映射，從而獲取共同靶點(diǎn)，使用Cytoscape 3.7.1 軟件構(gòu)建中藥活性成分-疾病靶點(diǎn)相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖。并運(yùn)用String 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//string-db.org/cgi/input.pl），對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行蛋白質(zhì)互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。

1.5 GO 富集和KEGG 通路富集 為了闡明參芪扶正注射液防治心臟毒性的作用機(jī)制，將網(wǎng)絡(luò)中的靶蛋白投射到DAVID 6.8（https：//david.ncifcrf.gov/），進(jìn)行GO 功能富集和KEGG 通路富集，從生物過(guò)程及信號(hào)通路程角度分析具體作用機(jī)制，繼而繪制靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 藥物篩選結(jié)果 研究結(jié)果表明，參芪注射液組方中有34 個(gè)活性成分滿(mǎn)足OB、DL、CaCo-2 細(xì)胞滲透性的要求，其中黨參含有19 個(gè)活性成分，黃芪含有15 個(gè)活性成分，通過(guò)分析相關(guān)文獻(xiàn)及結(jié)合現(xiàn)代藥理學(xué)研究結(jié)果，證實(shí)黃芪多糖及黃芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ均為黃芪的活性成分，故該5 個(gè)成分亦納入本藥物成分篩選結(jié)果，得到黃芪活性成分共20 個(gè)。表1 為39 個(gè)活性化合物基本信息。

2.2 靶點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果 在TCMSP 數(shù)據(jù)平臺(tái)上檢索出藥物活性成分所對(duì)應(yīng)的蛋白靶點(diǎn)，再利用UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)，檢索與之對(duì)應(yīng)的人類(lèi)基因名稱(chēng)，最終得到529 個(gè)靶點(diǎn)基因。檢索Genecards 及OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)，分別得到靶基因6237、113 個(gè)，合并去重后得到6 341 個(gè)。將參芪注射液組方中藥的529 個(gè)靶基因與心臟毒性疾病相關(guān)基因6 341 個(gè)進(jìn)行映射，得到共同靶基因105 個(gè)。此105 個(gè)靶基因可視為參芪扶正注射液防治藥物心臟毒性的有效活性成分作用靶點(diǎn)，由此建立參芪扶正注射液藥物-活性成分-心疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖（見(jiàn)圖1），其中，矩形代表疾病靶基因，橢圓形代表藥物活性成分。

圖1 藥物-活性成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

表1 黨參、黃芪活性成分

2.3 蛋白相互作用圖構(gòu)建 將得到的活性成分作用靶點(diǎn)導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建（見(jiàn)圖2）。圖中共有102 個(gè)節(jié)點(diǎn)，671 條邊，其中Degree 較大者為IL6、TNF、JUN、AR、RELA、CCND1（Degree 分別為46、42、42、34、33），提示這些蛋白是參芪扶正注射液防治藥物心臟毒性的關(guān)鍵蛋白靶點(diǎn)。

2.4 GO 功能富集分析 借助于DAVID 軟件對(duì)參芪扶正注射液防治心臟毒性所涉及的105 個(gè)靶蛋白進(jìn)行GO 功能富集分析。以P＜0.001 為篩選條件，確定出24 個(gè)條目。在GO 功能富集包含的3 個(gè)子類(lèi)中，生物過(guò)程（biological process，BP）類(lèi)條目有15 個(gè)、細(xì)胞組分（cellular component，CC）類(lèi)條目有3 個(gè)、分子功能（molecular function，MF）類(lèi)條目有6 個(gè)。主要涉及“positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter”、“transcription，DNA-templated”、“extracellular space”、“cell junction”、“steroid hormone receptor activity”等生物學(xué)過(guò)程（見(jiàn)圖3）。

2.5 KEGG 通路富集分析 在DAVID 軟件中對(duì)105 個(gè)靶蛋白進(jìn)行KEGG 通路富集分析。以P＜0.001 為篩選條件，并排除如“Small cell lung cancer”“Influenza A”等與心臟毒性不相關(guān)的通路，最后確定出13 條KEGG 通路（見(jiàn)表2），并做出KEGG 通路富集分析圖（見(jiàn)圖4）。

圖3 基因本體論（GO）功能富集

表2 KEGG 通路富集

圖4 KEGG 通路富集

根據(jù)靶點(diǎn)與信號(hào)通路之間的聯(lián)系，建立靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖（見(jiàn)圖5），其中藍(lán)色、綠色菱形表示疾病靶點(diǎn)，紅色橢圓形表示信號(hào)通路。

3 討論

自1973 年，Lefrak 首次報(bào)道蒽環(huán)類(lèi)藥物誘發(fā)心臟毒性以來(lái)，心臟毒性一詞引起了醫(yī)學(xué)界尤其是腫瘤科醫(yī)師的廣泛關(guān)注。心臟毒性可概況為在一定使用劑量、治療時(shí)間內(nèi)，由藥物本身導(dǎo)致的急慢性心肌細(xì)胞損害，出現(xiàn)心律失常、射血功能降低等心臟功能受損表現(xiàn)［6］。其導(dǎo)致心臟毒性的機(jī)制尚不明確，可能的機(jī)制為鈣超載、鐵離子代謝紊亂、氧化應(yīng)激產(chǎn)物的形成、細(xì)胞凋亡程序的啟動(dòng)、自由基的作用［7-8］?；熕幬锏睦鄯e劑量被認(rèn)為是導(dǎo)致心臟毒性最重要的影響因素，隨著累積劑量的不斷增加，心衰的發(fā)生的可能性也逐步增加。因此，加強(qiáng)對(duì)心臟毒性的早期診斷，及時(shí)給予治療干預(yù)措施，對(duì)患者的生活質(zhì)量及預(yù)后意義重大。右丙亞胺作為目前唯一被FDA 批準(zhǔn)的用于心臟毒性的防治藥物［9］，它可迅速、完全地結(jié)合鐵離子，甚至置換出部分化療藥與鐵復(fù)合物中的鐵，并與藥物螯合，減少自由基的形成，從而發(fā)揮心臟保護(hù)作用［2、10］，然而，其昂貴的價(jià)格限制了臨床的廣泛應(yīng)用［11］。此時(shí)，中醫(yī)藥在防治心臟毒性上凸顯出獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，其不僅被靈活運(yùn)用于扶助機(jī)體正氣、增強(qiáng)對(duì)化療藥物的耐受性上，亦可增效減毒，在減輕心臟毒性中發(fā)揮著重要作用［12-13］。

從中醫(yī)角度觀之，心臟毒性的對(duì)應(yīng)于“心悸病”范疇，臨床表現(xiàn)以心悸、胸悶、胸痛、氣短為多見(jiàn)，后期尚見(jiàn)疲倦乏力、少氣懶言、自汗、失眠等癥，舌多暗淡，脈多沉細(xì)澀，辨證當(dāng)以“心氣虛證”居多。緣素體先天稟賦不足，正氣受損，加上藥物的“藥毒”之邪，直中心臟，故治療當(dāng)以益氣扶正為法。參芪扶正注射液功專(zhuān)扶正固本、補(bǔ)益正氣。臨床病例研究表明，參芪扶正注射液有助于減輕心肌損傷及抑制心肌纖維化進(jìn)程［14］，可通過(guò)改善心率、心輸出量、左室射血分?jǐn)?shù)以治療心衰［15］，且能改善患者體虛、心悸、氣短、乏力等癥狀；藥理研究推測(cè)，參芪扶正注射液通過(guò)上調(diào)某些蛋白表達(dá)、保護(hù)線粒體、溶酶體等，起到抑制缺血再灌注心肌細(xì)胞凋亡、保護(hù)心肌細(xì)胞［16］。

圖5 靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖

現(xiàn)階段，盡管愈來(lái)愈多的研究者將目光轉(zhuǎn)向?qū)④畏稣⑸湟悍乐涡呐K毒性的研究上，但是，檢索國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，目前尚無(wú)對(duì)其發(fā)揮作用的有效化學(xué)成分、作用靶點(diǎn)、信號(hào)通路及生物學(xué)途徑等機(jī)制的研究。因此，借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)平臺(tái)明確其發(fā)揮臨床療效的活性成分及作用靶點(diǎn)成為了現(xiàn)代中醫(yī)藥研究的新方向。通過(guò)分析本研究結(jié)果，得出以下結(jié)論：首先，參芪扶正注射液所含藥物的活性成分在心臟毒性防治上存在多成分、多靶點(diǎn)、多向作用的特點(diǎn)，中藥成分“一對(duì)多”發(fā)揮多靶點(diǎn)調(diào)控的作用，這恰體現(xiàn)出中醫(yī)整體治療作用的優(yōu)勢(shì)。其次，通過(guò)整合分析得出，其發(fā)揮療效的關(guān)鍵靶點(diǎn)為IL-6、TNF、JUN、AR、RELA、CCND1 等。目前已有研究證實(shí)，IL-6、TNF、JUN、AR 與心肌損傷關(guān)系密切，心力衰竭患者常伴有細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子TNF-α、IL-6 的分泌增加，同時(shí)，IL-6、TNF 尚能直接或間接激活MAPK、PI3K-Akt、m TOR 信號(hào)通路加重心肌損傷［17］。JUN 作為一種原癌基因，其編碼的c-jun 蛋白是轉(zhuǎn)錄因子AP-1 家族的組成成員，在調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、侵襲和凋亡方面起關(guān)鍵作用［18-19］，JUN 參與心肌缺血再灌注損傷，并通過(guò)激活JNK-MAPK 等信號(hào)通路誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，研究發(fā)現(xiàn)心源性猝死者心肌細(xì)胞中C-JUN 高表達(dá)［20］。心臟損害被認(rèn)為是從機(jī)體交感神經(jīng)系統(tǒng)的腎上腺素信號(hào)激活開(kāi)始的，β-腎上腺素能系統(tǒng)在心血管系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能調(diào)控中意義重大［21］。腎上腺受體（Adrenergic Receptor，AR）作為該信號(hào)通路的關(guān)鍵組成部分，包括如β1-AR、β2-AR、β3-AR、α2C-AR 等多種亞型，AR 被激活后，刺激腎上腺素系統(tǒng)釋放更多的腎上腺素，加重心功能衰竭［22］。例如，β3-AR 作為近年發(fā)現(xiàn)的β-AR 的亞型，與心肌細(xì)胞興奮-收縮耦聯(lián)功能相關(guān)［23］。β3-AR 激動(dòng)劑可以使心室肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度下調(diào)，而在心力衰竭的心肌細(xì)胞中，鈣濃度下調(diào)程度較輕［24］。RELA 與CCND1 在心臟疾病中的報(bào)道較少，而本研究提示，其在參芪扶正注射液防治心臟毒性中亦是重要的疾病靶點(diǎn)，這或許可為后續(xù)研究提供一定線索。RELA 作為NF-κB 家族的成員之一，其翻譯后經(jīng)過(guò)磷酸化、乙酰化、甲基化等修飾，可以精準(zhǔn)調(diào)控NF-κB 的轉(zhuǎn)錄及激活，NF-κB 參與調(diào)控心肌細(xì)胞的增殖、凋亡，并在炎癥以及免疫應(yīng)答等重要的生命活動(dòng)中發(fā)揮作用［25-26］，這或許是其對(duì)心臟發(fā)揮保護(hù)作用的途徑。目前對(duì)于CCND1 的研究焦點(diǎn)多集中在腫瘤性疾病中，它作為原癌基因，在多種實(shí)體腫瘤中都有表達(dá)，CCND1 基因編碼的產(chǎn)物Cyclin D1 是調(diào)控細(xì)胞周期G1 期的關(guān)鍵蛋白，主要功能是促進(jìn)細(xì)胞增殖，推動(dòng)細(xì)胞周期由G1 期進(jìn)入S 期［27-28］，而在心臟損害中，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提示，Ccnd1 基因表達(dá)下調(diào)后，大鼠心臟成纖維細(xì)胞增殖受到抑制［29］。

本研究中KEGG 通路富集分析表明，參芪扶正注射液防治心臟毒性的主要作用途徑為鈣信號(hào)通路、PI3K-Akt 信號(hào)通路、神經(jīng)活性配體通路、T 細(xì)胞受體信號(hào)通路、cGMPPKG 信號(hào)通路、cAMP 信號(hào)通路等，具體生物學(xué)功能表現(xiàn)在對(duì)RNA 聚合酶II 啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)控、DNA 轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞外間隙及細(xì)胞連接的調(diào)控、類(lèi)固醇激素受體活性的調(diào)節(jié)。心臟是循環(huán)系統(tǒng)的動(dòng)力泵，心肌細(xì)胞的節(jié)律性收縮舒張，使得其本身就是一個(gè)高耗能的器官，而肌漿網(wǎng)上的Ca2+泵為心肌細(xì)胞的收縮提供了30% -40%能量［30］。鈣信號(hào)通路對(duì)心臟功能的調(diào)節(jié)、維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、提供能量均發(fā)揮了重要的作用。在鈣信號(hào)通路的調(diào)控下，外鈣誘導(dǎo)內(nèi)鈣釋放引起心肌細(xì)胞收縮，再由肌漿網(wǎng)鈣ATP 酶介導(dǎo)鈣離子的重?cái)z，引起心肌細(xì)胞的舒張［31-32］。PI3K/Akt 通路作為細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，與心肌損傷、缺血、衰竭關(guān)系密切［33-35］，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)推測(cè)，藥物可通過(guò)干預(yù)PI3K/Akt 信號(hào)通路減輕心臟移植心肌冷缺血再灌注損傷［36］；另有研究提示中藥干預(yù)PI3K-Akt 通路可視為藥物發(fā)揮減輕心肌細(xì)胞損傷、抗心肌纖維化、逆轉(zhuǎn)心衰、改善心功能、抑制心室重構(gòu)的作用機(jī)制［37-38］，此皆提示PI3K/Akt 通路與心臟關(guān)系密切。存在于質(zhì)膜上的多種不同類(lèi)型的受體及配體組成了神經(jīng)活性配體通路的重要部分，在神經(jīng)活性配體信號(hào)通路的調(diào)控下，神經(jīng)組織的刺激分子與對(duì)應(yīng)的受體結(jié)合后，發(fā)揮對(duì)生理節(jié)律、內(nèi)分泌等不同生物功能的調(diào)節(jié)［39］，其中對(duì)心血管系統(tǒng)的調(diào)控使之成為參芪扶正注射液防治心臟毒性的作用途徑，藥物活性成分對(duì)該信號(hào)通路的干預(yù)，引起心肌節(jié)律、心臟功能的變化。T 細(xì)胞受體信號(hào)通路是將抗原信號(hào)傳遞至細(xì)胞內(nèi)的重要途徑，MHC 分子將抗原遞呈，抗原與T 細(xì)胞受體（T-cell receptor，TCR）結(jié)合，從而啟動(dòng)TCR信號(hào)通路。該通路激活使得下游機(jī)體T 細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答，繼而抗體異常生成，導(dǎo)致免疫性疾病的發(fā)生，機(jī)體在清除抗原的免疫應(yīng)答過(guò)程中，易誘發(fā)自身免疫性疾病、炎性疾病，對(duì)心肌細(xì)胞產(chǎn)生損傷［40］，有研究發(fā)現(xiàn)，異常的TCR信號(hào)通路在自身免疫性擴(kuò)張型心肌病中起著重要作用［41］。cGMP-PKG 與cAMP 信號(hào)通路在心臟疾病中發(fā)揮了重要作用，二者作用相反，共同調(diào)節(jié)心臟活動(dòng)。作為衡量心臟功能的敏感指標(biāo)，cAMP 對(duì)心臟具有正性肌力作用，能增強(qiáng)心肌收縮力，減少外周阻力，增加泵血量；cGMP 則與之相反，其發(fā)揮的生理效應(yīng)與心臟功能負(fù)相關(guān)［42］。實(shí)驗(yàn)表明，血清cAMP、cGMP 含量、cAMP/cGMP 比值可以反映充血性心力衰竭動(dòng)物模型的病變程度［43］。

總之，參芪扶正注射液在對(duì)心臟毒性的臨床防治中應(yīng)用廣泛，然而其實(shí)驗(yàn)機(jī)制研究甚少。基于此，課題組從作用機(jī)制切入，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，進(jìn)一步探討其參芪扶正注射液防治心臟毒性的有效活性成分、關(guān)鍵靶點(diǎn)、生物學(xué)功能以及信號(hào)通路，根據(jù)本研究結(jié)果，我們后期將開(kāi)展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)行機(jī)制驗(yàn)證，以期為臨床應(yīng)用提供更充足的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論支撐。同時(shí)，翼對(duì)今后挖掘其它防治化療藥物心臟毒性的中藥、讓中醫(yī)藥更好服務(wù)于臨床提供一定研究思路。