田陽陽，代敬文，姜 滔，賈文茜，帥 陳，劉珍妮，慈雷雷，呂雄文

（安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院 安徽省天然藥物活性研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 重大自身免疫性疾病安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230032）

中藥是指在中醫(yī)理論指導(dǎo)下，用于預(yù)防、治療、診斷疾病并具有康復(fù)保健作用的物質(zhì)［1］。我國的傳統(tǒng)中藥有丸、散、膏、丹等，解放以后又創(chuàng)制了不少新品種統(tǒng)稱之為中成藥以示與西成藥有所區(qū)別［2］。近代中醫(yī)張錫純應(yīng)用西藥與中藥配伍，用石膏阿司匹林湯，治療溫病周身壯熱證［3］。到現(xiàn)代，目前已上市中西藥復(fù)方制劑共648 個品種［4］。中西藥復(fù)方制劑在中成藥中所占比例大約為百分之十左右［5］。中西藥復(fù)方制劑是“中藥、化學(xué)藥品及天然藥物組成的復(fù)方制劑”［6］。在我國當(dāng)前的藥品注冊分類中“中藥、天然藥物和化學(xué)藥品組成的復(fù)方制劑”簡稱中西藥復(fù)方制劑［7-8］。中西藥復(fù)方制劑目的是提高療效，但由于缺乏基礎(chǔ)研究、臨床試驗(yàn)，說明書不完善等使得臨床上多次出現(xiàn)使用這類制劑的不良反應(yīng)［9］。近年來，在國家發(fā)布的76 期藥品不良反應(yīng)信息通報(bào)當(dāng)中，有四期與中西藥復(fù)方制劑有關(guān)，包括維C 銀翹片、感冒清片、珍菊降壓片、新復(fù)方大青葉片、腦絡(luò)通膠囊五種。藥源性疾病一般多發(fā)肝損傷，即藥物性肝損傷［10］。目前在美國、英國及歐洲，對乙酰氨基酚是導(dǎo)致急性肝功能衰竭的主要原因，在美國該比例為46%，在英國及歐洲該比例為40% -70%［11］。而維C 銀翹片、感冒清片、新復(fù)方大青葉片都含有對乙酰氨基酚成分，且通報(bào)當(dāng)中出現(xiàn)不同程度的肝毒性。并且，有研究表明［12］A1R、A2AR 共同參與了對乙酰氨基酚誘導(dǎo)的肝損傷。本研究擬通過對KM 小鼠不同給藥周期，從而探討藥物對肝臟的毒性及其可能存在的機(jī)制。

1 材料

1.1 動物 KM 種小白鼠，清潔級，雄性，體質(zhì)量18～22 g，購自濟(jì)南鵬悅實(shí)驗(yàn)動物繁育有限公司（生產(chǎn)許可證號SCXK（魯）2014-0007）。自由進(jìn)食及飲水，普通動物飼料喂養(yǎng)，模擬自然光照環(huán)境12 h 光照，12 h 黑夜中飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物與試劑 感冒清片（廣州白云山醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司，批號4180038）；腦絡(luò)通膠囊（廣州白云山光華制藥股份有限公司，批號c70040）；維C 銀翹片（貴州百靈企業(yè)集團(tuán)制藥股份有限公司，批號20180422）；新復(fù)方大青葉片［榮昌制藥（淄博）有限公司，批號180201078］；珍菊降壓片（陜西東泰制藥有限公司，批號71010720067）；腺苷A1R（S/N3329326）、A2AR（S/N3507839）抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；β-actin 一抗（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號AH01032107）；AST（批號20180307）、ALT（批號 20180306）、TBA（批號20180425）、AKP（批號20180416）試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

2 方法

2.1 中西藥復(fù)方藥物性肝損傷模型的建立 將180 只18～22 g 昆明小鼠隨機(jī)分為空白組、感冒清片組、腦絡(luò)通膠囊組、維C 銀翹片組、新復(fù)方大青葉片組以及珍菊降壓片組，每組30 只。給藥組每天按照體質(zhì)量給人用劑量的9.1倍［13］的每日用藥量，維C 銀翹片460 mg/kg；感冒清片400 mg/kg；新復(fù)方大青葉片388 mg/kg；腦絡(luò)通膠囊460 mg/kg；珍菊降壓片114 mg/kg，空白組給予等量的生理鹽水，每組都為單次灌胃給藥。每兩天記錄1 次小鼠體質(zhì)量，根據(jù)體質(zhì)量計(jì)算給藥濃度。分別在給藥7、15、30 d后每組隨機(jī)取10 只鼠眼眶取血后剖腹取肝，稱定肝質(zhì)量。留取血液樣本測定肝功能指標(biāo)，肝組織部分-80 ℃保存，部分4%多聚甲醛固定。

2.2 小鼠體質(zhì)量和肝指數(shù) 根據(jù)每次記錄的小鼠體質(zhì)量，計(jì)算每組小鼠平均體質(zhì)量，分別對比給藥7、15、30 d 后給藥組和空白組體質(zhì)量變化。計(jì)算每組小鼠肝指數(shù)，分別對比給藥7、15、30 d 后給藥組和空白組肝指數(shù)變化。

2.3 肝功能生化指標(biāo)的檢測 取血液于1.5 mL 離心管室溫放置4～6 h，能看到明顯的血清分離后；于4 ℃下，4 000 r/min離心10 min 得血清，利用相應(yīng)試劑盒酶標(biāo)儀法測小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（AKP）、總膽汁酸（TBA）水平。

2.4 肝臟組織病理學(xué) 采用HE 染色法。通用型4%多聚甲醛固定液固定24 h 后，不同梯度酒精進(jìn)行組織脫水，二甲苯透明處理。石蠟包埋后進(jìn)行切片處理，然后展平烤片?？酒?，兩次二甲苯脫蠟處理，再經(jīng)脫水。在蘇木精水溶液中染色后，浸在1%鹽酸乙醇中片刻后，立即沖洗。酒精伊紅染色液染色2～3 min，再次用無水酒精進(jìn)行脫水處理，再次二甲苯透明處理。中性樹脂封片，顯微鏡下觀察。

2.5 肝組織中A1R、A2AR 蛋白表達(dá) 采用Western blot法，肝組織破碎裂后離心，取上清液進(jìn)行蛋白濃度定量，加入蛋白上樣緩沖液，100 ℃水浴鍋內(nèi)煮沸10 min。進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（80 V 恒壓30 min 濃縮，120 V恒壓50～60 min 分離）。電泳結(jié)束后用濕轉(zhuǎn)儀在冰水冷卻中將相應(yīng)蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，膜在封閉3 h 后，TBST 清洗后，加入一抗中。放置過夜，加入二抗搖床孵育1 h，TBST 清洗，顯影。

免疫組化染色（Immunohistochemistry staining，ICH）法，4%多聚甲醛固定24 h 后的肝組織制成組織蠟塊后進(jìn)行3～5 μm 厚度切片。經(jīng)免疫組化染色染色后觀察其相應(yīng)蛋白表達(dá)情況。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行分析，用GraphPad Prism 軟件驗(yàn)證繪圖。以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩個獨(dú)立樣本比較采用t檢驗(yàn)，以P≤0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 小鼠體質(zhì)量變化 新復(fù)方大青葉片組和珍菊降壓片組小鼠體質(zhì)量增長較慢，且和空白組相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。維C 銀翹組、腦絡(luò)通膠囊組、感冒清片組小鼠體質(zhì)量較空白組增長較快（P＜0.05，P＜0.01）。見圖1。

圖1 各組小鼠給藥30 d 體質(zhì)量變化曲線（n=10）

3.2 小鼠肝指數(shù)變化 給藥7、15 d 后，各給藥組小鼠肝指數(shù)和空白組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。給藥30 d 后，感冒清片組、腦絡(luò)通膠囊組、珍菊降壓片組肝指數(shù)較空白組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。維C 銀翹片組、新復(fù)方大青葉片組肝指數(shù)較空白組增加（P＜0.05），見圖2。說明給藥30 d 后維C 銀翹片組、新復(fù)方大青葉片組小鼠肝臟有明顯的增大。

圖2 給藥30 d 后各組大鼠肝指數(shù)（n=10）

3.3 肝功能生化指標(biāo) 給藥7 d 后，各給藥組小鼠肝功能指標(biāo)AST、ALT、AKP、TBA 和空白組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；給藥15 d 后，僅維C 銀翹片組、新復(fù)方大青葉片組、珍菊降壓片組小鼠肝功能指標(biāo)TBA 水平較空白組增加，見圖3；給藥30 d 后，與空白組比較，C 銀翹片組、新復(fù)方大青葉片組肝功能指標(biāo)AST、ALT、AKP、TBA 水平增加（P＜0.05，P＜0.01），見圖4。

3.4 肝組織HE 染色結(jié)果 給藥7、15 d 后，各給藥組小鼠肝組織HE 染色結(jié)果和空白組相比均未見明顯損傷；給藥30 d，空白組肝小葉結(jié)構(gòu)正常，無腫脹、壞死，肝小葉及匯管區(qū)無炎細(xì)胞浸潤；與空白組相比維C 銀翹片組和新復(fù)方大青葉片組肝小葉肝索不規(guī)則排列，界限模糊且有炎性細(xì)胞浸潤，見圖5。提示小鼠肝臟有明顯損傷。

3.5 維C 銀翹片、新復(fù)方大青葉片對肝組織A1、A2A 受體表達(dá)影響 Western blot 結(jié)果顯示，維C 銀翹片組、新復(fù)方大青葉片組肝組織A1R、A2AR 蛋白表達(dá)隨著給藥時間的延長依次表達(dá)增高，見圖6～7；給藥30 d，與空白組比較，維C 銀翹片組、新復(fù)方大青葉片組A1R、A2AR 蛋白表達(dá)升高（P＜0.01），見圖8～9。免疫組化結(jié)果顯示，給藥30 d 后，維C 銀翹片組和新復(fù)方大青葉片組相比空白組，A1 受體表達(dá)增高（圖10、12），A2A 受體表達(dá)也略有增加（圖11、13）。提示其肝損傷可能與肝組織中A1、A2A 受體表達(dá)增高有關(guān)。

圖3 給藥15 后各組大鼠肝功能指標(biāo)（n=10）

圖4 給藥30 d 后各組大鼠肝功能指標(biāo)（n=10）

圖6 不同給藥時間維C 銀翹片對肝組織A1R、A2AR 蛋白表達(dá)的影響（n=3）

4 討論

藥物性肝損傷（drug-induced liver injury，DILI）是最常見和最嚴(yán)重的藥物不良反應(yīng)之一，藥物性肝損傷是指由各類處方或非處方的化學(xué)藥物、生物制劑、傳統(tǒng)中藥（TCM）、天然藥（NM）、保健品（HP）、膳食補(bǔ)充劑（DS）及其代謝產(chǎn)物乃至輔料等所誘發(fā)的肝損傷［14］。根據(jù)國家藥品監(jiān)督管理局2018 年4 月10 日發(fā)布的國家藥品不良反應(yīng)監(jiān)測年度報(bào)告（2017）抗感染藥嚴(yán)重藥品不良反應(yīng)/事件報(bào)告，口服制劑累及器官系統(tǒng)排名第1 位的是肝膽損害（26.1%）。其中也包括一些中西藥復(fù)方，中西藥復(fù)方制劑的組方復(fù)雜，臨床使用范圍較廣，存在用藥安全隱患［7］。本研究涉及到的中西藥復(fù)方制劑給藥30 d 后，給藥組小鼠體質(zhì)量較空白組增加明顯，可能是由于其復(fù)方制劑含大量輔料所致，特別是維C 銀翹片，其為糖衣片。從血清指標(biāo)和病理切片判斷，僅給藥30 d 后維C 銀翹片組和新復(fù)方大青葉片組對小鼠肝臟有明顯損傷，說明給藥7、15 d時對小鼠肝臟影響較小。其肝組織A1、A2A 受體的表達(dá)情況可以看出，給藥時間越長A1、A2A 受體表達(dá)越多，給藥30 d 后和空白組相比表達(dá)明顯增高，其肝損傷可能與A1、A2A 蛋白表達(dá)增高有關(guān)。如果抑制A1、A2A 受體表達(dá)是否會改善維C 銀翹片和新復(fù)方大青葉片導(dǎo)致的肝損傷還有待進(jìn)一步研究。目前關(guān)于藥物性肝損傷的發(fā)病機(jī)制的研究已經(jīng)有部分成果，大多是多種機(jī)制協(xié)同作用和（或）前后作用的結(jié)果導(dǎo)致［15］。A1、A2A 受體表達(dá)的增多可能意味著，其上游或者下游通路在維C 銀翹片和新復(fù)方大青葉片給藥30 d 后導(dǎo)致的肝損傷中發(fā)揮著重要作用。目前，對于藥物性肝損傷的治療主要是停用可能導(dǎo)致肝損傷的藥物，對癥治療，嚴(yán)重的話可能還需要肝移植［16］。從理論上講藥物對肝臟的損傷在客觀上是不可避免的［17］，除了在上市后嚴(yán)密監(jiān)測藥物的不良反應(yīng)以外，還可以把藥物警戒理念引入監(jiān)測和評價過程中［18］。中西藥復(fù)方由于其成分比較復(fù)雜可能會在用藥的過程中導(dǎo)致重復(fù)用藥，中西藥聯(lián)用更易導(dǎo)致不良反應(yīng)［19］。對于藥物性肝損傷預(yù)防是關(guān)鍵，要對藥物副作用和不良反應(yīng)有充分的了解，盡量少使用肝損傷較大的藥物，避免過長期用同一種藥物，不要重復(fù)用藥。

圖7 不同給藥時間新復(fù)方大青葉片對肝組織A1R、A2AR 蛋白表達(dá)的影響（n=3）

圖8 給藥30 d 后維C 銀翹片對肝組織A1R、A2AR 蛋白表達(dá)的影響（n=3）

圖9 給藥30 d 后新復(fù)方大青葉片對肝組織A1R、A2AR 蛋白表達(dá)的影響（n=3）

圖10 給藥30 d 后維C 銀翹片組A1R 蛋白的表達(dá)情況（×200）

圖11 給藥30 d 后維C 銀翹片組A2AR 蛋白的表達(dá)情況（×200）

圖12 給藥30 d 后新復(fù)方大青葉片組A1R 蛋白的表達(dá)情況（×200）

圖13 給藥30 d 后新復(fù)方大青葉片組A2AR 蛋白的表達(dá)情況（×200）