原增艷，宋小鋒，張 婷

（新鄉(xiāng)醫(yī)學院三全學院，河南 新鄉(xiāng) 453000）

腦缺血再灌注損傷（Cerebral ischemia reperfusion injury，CIR）是缺血性腦卒中的主要病理機制，氧化應激在CIR 過程中起重要作用，CIR 發(fā)生時活性氧（ROS）生成顯著增加［1］。在CIR 過程中，腦細胞處于缺氧-葡萄糖剝奪/復氧（oxygen-glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R）狀態(tài)，這可能對腦細胞造成不可逆的損傷［2-4］。

Nrf2-ARE 通路是重要的內(nèi)源性抗氧化應激通路之一。核因子紅血球相關因子2（Nuclear factor erythroid -related factor 2，Nrf2）是氧化應激的抑制劑。在非應激條件下，Nrf2 存在于細胞質(zhì)中，與胞質(zhì)伴侶蛋白（kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）的結(jié)合后被轉(zhuǎn)移到泛素-蛋白酶體系統(tǒng)進行降解［5］。然而，被激活后，Nrf2 轉(zhuǎn)位到細胞核，與ARE 啟動子部位結(jié)合，啟動Nrf2 下游靶基因，增加下游細胞保護蛋白的表達，如血紅素氧合酶1（heme oxygenase 1，HO-1）和奎寧氧化還原酶1（quinine oxidoreductase 1，NQO-1）增強細胞對氧化應激的對抗作用［6］。研究表明，Nrf2/ARE 通路激活可抑制活性氧的聚集，并減輕OGD/R所致的神經(jīng)細胞損傷［7］。

查爾酮化合物被認為是具有潛在藥理活性的黃酮類化合物，異甘草素作為一種查爾酮化合物存在于串果藤、甘草、降香中。研究發(fā)現(xiàn)，異甘草素能通過激活SIRT1，降低實驗性糖尿病神經(jīng)病變大鼠的的氧化損傷［8］，并且可降低NF-κB 活性發(fā)揮對膿毒癥小鼠腦損傷的保護作用［9］。另有研究表明，異甘草素可通過抑制氧化應激降低缺血再灌注所致的損傷［10］。同時，異甘草素可通過抑制氧化應激和調(diào)控Nrf2/HO-1 通路減輕小鼠急性胰腺炎的癥狀［11］。然而，很少有研究探討異甘草素在CIR 中的抗氧化應激作用。并且，目前尚不清楚異甘草素是否通過調(diào)節(jié)Nrf2/ARE 信號通路在CIR 下發(fā)揮保護神經(jīng)功能的作用。本研究旨在探討異甘草素對CIR 誘導的氧化應激損傷的保護作用及這些保護作用的潛在機制。

1 材料

1.1 細胞株 人骨髓神經(jīng)母細胞瘤細胞株（human neuroblastoma cell，SH-SY5Y 細胞）購自中國科學院上海細胞生物研究所。

1.2 藥物與試劑 異甘草素購自成都瑞芬思生物科技有限公司（純度＞98%，批號171106）；MTT 購自美國國Sigma公司（貨號M5655）；GSH、SOD、MDA 活性檢測試劑盒（批號分別為20170521，20170712，20170608）購自南京建成生物技術研究所；乳酸脫氫酶細胞毒性檢測試劑盒（批號170723）、caspase-3 活性檢測試劑盒（批號；170812）、caspase-9 活性檢測試劑盒（批號170612）、活性氧檢測試劑盒（批號170824）均購自碧云天生物技術研究所；TRIzol（總RNA 抽提試劑，貨號15596018）購自美國賽默飛世爾科技公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號RR047 A）、TB GreenTMPremix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus）熒光定量試劑盒（貨號RR820 A）購自寶生物工程（大連）有限公司；HO-1 抗體購自英國Abcam 公司。

1.3 儀器 LightCycler 96 Real-Time PCR System 購自瑞士羅氏公司；Multiskun Mk3 酶標儀購自美國賽默飛世爾科技公司。

2 方法

2.1 Nrf2-siRNA 轉(zhuǎn)染SH-SY5Y 細胞 通過檢測5～100 nmol/L 的轉(zhuǎn)染效率，篩選出細胞毒性最小的轉(zhuǎn)染效果。沉默Nrf2 基因序列Nrf2-siRNA（Si Nrf2-sense RNA，5′-GGAUUAUUAUGACUGUUAAAU-3′；Si Nrf2-antisense RNA，5′-UUAACAGUCAUAAUAAUCCUU-3′）。細胞提前一天鋪板，轉(zhuǎn)染時細胞密度為30%～50%，將Nrf2-siRNA 溶于Opti-mem 無血清培養(yǎng)基中，混勻，放置5 min，同時將lipo2000 溶于Opti-mem 無血清培養(yǎng)基中，二者混合，放置20 min，將上述混合液加入培養(yǎng)孔，混勻，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h 后，去除上清，加入含10% 胎牛血清的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，通過PCR 檢測合格后，備用。同樣方法轉(zhuǎn)染陰性對照NC Nrf2-siRNA。

2.2 OGD/R 模型及細胞分組 用Earle′s 平衡鹽溶液代替含葡萄糖的完全培養(yǎng)基，將細胞置于低氧條件下（含5%CO2、0.5% O2和94.5% N2）培養(yǎng)2 h，換為含葡萄糖的完全培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。分為正常組、模型組、異甘草素組、Nrf2-siRNA 組、NC Nrf2-siRNA 組。正常組，SH-SY5Y 細胞用含10%胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基正常培養(yǎng)。模型組，正常培養(yǎng)SHSY5Y 細胞進行OGD/R，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。異甘草素組在OGD 前2 h 給予終濃度20 μmol/L 異甘草素，OGD/ R 后24 h換液，同樣換成含終濃度20 μmol/L 異甘草素的完全培養(yǎng)基繼續(xù)作用24 h。siRNA-Nrf2 組，使用經(jīng)siRNA-Nrf2轉(zhuǎn)染后的SH-SY5Y 細胞，其它處理同異甘草素組。NC Nrf2-siRNA 組，使用轉(zhuǎn)染陰性對照NC Nrf2-siRNA 后的SHSY5Y 細胞，其它處理同異甘草素組。

2.3 MTT 檢測細胞活力 細胞接種于96 孔培養(yǎng)板，每孔加入0.1 mL 培養(yǎng)基，各組細胞進行相應處理后，每孔加入MTT（5 g/L）20 μL，37 ℃孵育4 h。吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 150 μL，搖床低速震蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解，然后應用酶標儀在490 nm 波段檢測吸光度值（OD）。

2.4 LDH 檢測 LDH 的檢測應用乳酸脫氫酶細胞毒性檢測試劑盒，嚴格按說明書操作。各組細胞進行相應處理后，將細胞培養(yǎng)板用多孔板離心機，400g離心5 min。分別取各孔的上清液120 μL，加入到新的96 孔板相應孔中，隨后各孔分別加入60 μL LDH 檢測工作液?；靹颍覝?，用鋁箔包裹后置于水平搖床避光孵育30 min。然后在490 nm 處測定OD。以正常組作為參照，將正常組的吸光度值作為100%，以測得OD實驗組/OD正常組分別表示各組相對LDH水平。

2.5 caspase-3、caspase9 活性檢測 分別應用caspase-3、caspase9 活性檢測試劑盒。各組細胞進行相應處理后，裂解液裂解細胞，于4 ℃下，16 000g離心12 min。取上清，使用Bradford 法測定蛋白濃度，調(diào)整蛋白濃度為1.5 mg/mL。取待測樣品50 μL，加入檢測緩沖液40 μL，適當混勻，隨后caspase-3 檢測加入caspase-3 顯色底物Ac-DEVD-pNA（2 mmol/L）10 μL，caspase-9 檢測加入caspase-9 顯色底物Ac-LEHD-pNA（2 mmol/L）10 μL，再次混勻。37 ℃孵育100 min，測定405 nm 處OD。以測得OD實驗組/OD正常組分別表示各組相對caspase-3、caspase9 活性。

2.6 細胞內(nèi)ROS 檢測 用2′，7′-二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）熒光探針測定ROS 水平。使用活性氧檢測試劑盒，嚴格按說明書要求操作。按照1∶1 000 用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10 μmol/L。細胞收集后懸浮于稀釋好的DCFH-DA 中，細胞濃度為1×107/mL，37 ℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。每隔3～5 min 顛倒混勻一下，使探針和細胞充分接觸。用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞3 次，以充分去除未進入細胞內(nèi)的DCFH-DA。DCFH-DA本身沒有熒光，可以自由穿過細胞膜，進入細胞內(nèi)后，可以被細胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH。而DCFH 不能通透細胞膜，細胞內(nèi)的ROS 可以氧化無熒光的DCFH 生成有熒光的DCF。熒光分光光度計檢測DCF 的熒光就反映細胞內(nèi)ROS 水平。以正常組作為參照，將正常組熒光強度作為100%，以測得的實驗組熒光強度/正常組熒光強度表示各組相對ROS 活性。

2.7 細胞內(nèi)MDA、SOD、GSH 活性檢測 6 孔板培養(yǎng)SHSY5Y 細胞，各組細胞進行相應處理后，收集細胞，于4 ℃下PBS 洗滌2 次。沉淀細胞用細胞裂解液裂解，4 ℃離心取上清作為待測樣品。然后嚴格按試劑盒說明操作，加相應試劑反應顯色，最后用722 型分光光度計在相應波長處測定吸光度值。

2.8 RT-PCR 檢測Bcl-2、Bax、NQO1、HO-1 mRNA 表達 采用TRIzol 法提取細胞內(nèi)總RNA，使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。然后以轉(zhuǎn)錄后的cDNA 為模板，管家基因β-actin 為內(nèi)參，使用GreenTMPremix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus）熒光定量試劑盒進行熒光定量PCR 擴增。反應體系為TB GreenPremix Ex TaqII（Tli RNaseH Plus）（2×）10 μL，PCR Forward Primer（10 μmol/L）0.8 μL，PCR Reverse Primer（10 μmol/L）0.8 μL，cDNA 2 μL，無菌去離子水6.4 μL，總體積20 μL。引物序列，NQO1 正向5′-TGAGTCTCTGGACCCCTCTAC-3′，反向5′-CTGCCTGGACAAAGACCGAG-3′；HO-1 正向 5′-GGAACTGAGGATGCTGAAGG-3′，反向5′-AAGGAGGAAGGAGCCTATGG-3′；Bcl-2正向 5′-GTCTTCGCTGCGGAGATCAT-3′，反向 5′-CATTCCGATATACGCTGGGAC-3′；Bax正向5′-CATATAACCCCGTCAACGCAG-3′，反向5′-GCAGCCGCCACAAACATAC-3′；βactin正向 5′-CCTGGCACCCAGCACAAT-3′，反向 5′-GCCGATCCACACGGAGTACT-3′。反應條件，95 ℃預變性30 s；變性95 ℃5 s，退火延伸60 ℃20 s，重復40 個循環(huán)。實驗重復3 次。各mRNA 相對表達量用2-ΔΔCt表示。

2.9 Western blot 檢測HO-1 蛋白表達 細胞裂解液冰上裂解細胞，于4 ℃下，12 000 r/min 離心5 min，取上清。使用BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。在收集的蛋白樣品中加入5×SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液，沸水浴加熱5 min，充分變性蛋白，冷卻到室溫后，蛋白樣品加入SDSPAGE 膠加樣孔內(nèi)，100 V、90 min 電泳。使用PVDF 膜，轉(zhuǎn)膜，隨后5% 脫脂奶粉室溫封閉1 h。加入HO-1 抗體（1∶1 000），4 ℃孵育過夜，洗膜3 次后加入二抗室溫搖床孵育1 h。特超敏ECL 化學發(fā)光試劑盒顯影，以HO-1 與β-Actin 條帶灰度的比值表示HO-1 的相對表達。

2.10 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 19.0 軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以（）表示。多組間比較采用單因素方差分析，以P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 異甘草素對細胞活力的影響 由表1 可見，與正常組相比，模型組細胞活力下降（P＜0.01），異甘草素組能提高OGD/R 細胞的活力（P＜0.01）。與NC Nrf2-siRNA 組相比，敲低Nrf2 能抑制異甘草素對OGD/R 細胞活力的促進作用（P＜0.01），。各組細胞鏡下狀態(tài)見圖1。

圖1 各組細胞顯微鏡鏡下狀態(tài)（×100）

3.2 異甘草素對培養(yǎng)液中LDH 水平及caspase-3、caspase-9活性的影響 與正常組相比，模型組LDH 水平和caspase-3、caspase-9 活性升高（P＜0.01）；與模型組比較，異甘草素組LDH 水平和caspase-3、caspase-9 活性降低（P＜0.01）。而與NC Nrf2-siRNA 組相比，敲除Nrf2 能逆轉(zhuǎn)異甘草素對OGD/R 細胞LDH、caspase-3、caspase-9 的作用（P＜0.01）。見表1。

表1 異甘草素對細胞活力、LDH 水平及caspase-3、caspase-9 活性的影響（，n=3）

表1 異甘草素對細胞活力、LDH 水平及caspase-3、caspase-9 活性的影響（，n=3）

注：與正常組比較，##P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01；與NC Nrf2-siRNA 組比較，△△P＜0.01。

3.3 異甘草素對細胞內(nèi)ROS 的影響 與正常組相比，模型組細胞內(nèi)ROS 水平升高（P＜0.01）。與模型組比較，異甘草素組能降低ROS 水平（P＜0.01）。與NC Nrf2-siRNA組相比，敲低Nrf2 抑制了異甘草素對OGD/R 細胞ROS 水平的降低作用（P＜0.01）。見表2。

3.4 異甘草素對細胞內(nèi)MDA、SOD、GSH 水平的影響 與正常組相比，模型組細胞內(nèi)MDA 水平升高（P＜0.01），而SOD、GSH 水平下降（P＜0.01）。與模型組比較，異甘草素組能增加SOD、GSH 水平，降低MDA 水平（P＜0.01）。與NC Nrf2-siRNA 組相比，敲低Nrf2 基因能逆轉(zhuǎn)異甘草素對OGD/R 細胞中SOD、GSH、MDA 的作用（P＜0.05，P＜0.01）。見表2。

表2 異甘草素對細胞內(nèi)ROS、GSH、SOD、MDA 水平的影響（，n=3）

表2 異甘草素對細胞內(nèi)ROS、GSH、SOD、MDA 水平的影響（，n=3）

注：與正常組比較，##P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01；與NC Nrf2-siRNA 組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

3.5 異甘草素對Bcl-2、Bax、NQO1、HO-1 mRNA 的表達 與正常組相比，模型組BaxmRNA 表達升高（P＜0.01），而Bcl-2、NQO1、HO-1 mRNA 表達下降（P＜0.01）。與模型組比較，異甘草素組能增加Bcl-2、NQO1、HO-1 mRNA 表達，降低BaxmRNA 表達（P＜0.01）。與NC Nrf2-siRNA 組相比，敲低Nrf2 能逆轉(zhuǎn)異甘草素對OGD/R細胞 中Bcl-2、NQO1、HO-1、Bax mRNA 表達作用。見表3。

表3 異甘草素對Bcl-2、Bax、NQO1、HO-1 mRNA 表達的影響（，n=3）

表3 異甘草素對Bcl-2、Bax、NQO1、HO-1 mRNA 表達的影響（，n=3）

注：與正常組比較，##P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01；與NC Nrf2-siRNA 組比較，△P＜0.05，△△P ＜0.01。

3.6 異甘草素對HO-1 蛋白表達的影響 與正常組相比，模型組HO-1 蛋白表達下降（P＜0.01）。與模型組比較，異甘草素組能增加HO-1 蛋白表達（P＜0.01）。與NC Nrf2-siRNA 組相比，敲低Nrf2 基因抑制了異甘草素對OGD/R細胞HO-1 蛋白的促進作用。見圖2。

圖2 異甘草素對HO-1 蛋白表達的影響（n=3）

4 討論

SH-SY5Y 細胞系（人骨髓神經(jīng)母細胞瘤細胞株），來源于人神經(jīng)母細胞瘤，細胞分化程度低，其形態(tài)（呈錐體狀并且有明顯的軸突）、生理生化特性與正常神經(jīng)細胞類似，并且活性好，成活率高，培養(yǎng)體系穩(wěn)定，所以常用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)病機制和相關治療藥物作用效果及機制方面的研究［12-13］。

中風是造成成年人死亡和后天殘疾的主要原因［14］。在所有卒中病例中，缺血性中風占60%～70%［15］。一般來說，大腦比其他任何器官都更容易發(fā)生缺血。腦缺血阻斷氧氣輸送和營養(yǎng)，恢復血液供應（再灌注）仍然是缺血的標準治療。然而，再灌注本身也會引起遲發(fā)性繼發(fā)性腦損傷［16］。由ROS 過度生成引起的過度氧化應激在腦缺血再灌注損傷的發(fā)病機制中起著關鍵作用［17］。Nrf2-ARE 通路是重要的內(nèi)源性抗氧化應激通路之一。Nrf2 及其靶基因的激活可保護大腦免受缺血再灌注損傷［18］。HO-1、NQO1 是Nrf2 下游的一種高度可誘導的抗氧化還原酶，主要受Nrf2-ARE 通路調(diào)節(jié)。Nrf2 通過激活包括HO-1、NQO1 在內(nèi)的下游抗氧化蛋白來調(diào)節(jié)氧化應激的主要轉(zhuǎn)錄因子［19］。Nrf2 作為氧化還原敏感轉(zhuǎn)錄因子，在氧化應激刺激下會啟動Ⅱ相解毒酶（SOD、CAT、GSH-Px 等）和抗 氧化酶的基因（HO-1、NQO1 等）的表達，進而保護組織免受氧化應激損傷［20-21］。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)異甘草素能顯著減輕氧化應激，而Nrf2 基因敲除顯著抑制了異甘草素在OGD/R 處理神經(jīng)元中的有益作用，表明異甘草素可能誘導Nrf2/ARE活化，從而減輕OGD/R 所致的氧化應激反應。

另外現(xiàn)在普遍認為，細胞凋亡是導致腦缺血再灌注損傷神經(jīng)元死亡的主要原因［20］。因此，抑制細胞凋亡可能是一種有效的治療腦缺血再灌注損傷的方法。凋亡是由多種凋亡相關蛋白調(diào)控的，包括Bcl-2 蛋白家族和caspase 級聯(lián)［22］。Bcl-2 家族蛋白在調(diào)節(jié)細胞凋亡中起關鍵作用，并且與許多疾病的發(fā)展有關［23］。Bcl-2 家族蛋白是眾所周知的調(diào)節(jié)線粒體外膜通透性的調(diào)節(jié)因子，它與線粒體凋亡信號通路的激活有關［24］。觸發(fā)線粒體外膜通透性的閾值是由Bcl-2 家族的三個亞組之間的相互作用控制的：促凋亡蛋白（BAK 和Bax），抗凋亡蛋白（如Bcl-2）和促凋亡的BH3蛋白［25］。線粒體通透性增高會釋放細胞色素c，caspase-9可以和細胞色素c 以及Apaf1 形成復合物，同時被激活。激活的caspase 9 可以激活細胞凋亡的最關鍵酶caspase-3，從而促進后續(xù)的細胞凋亡信號。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)模型組Bax 表達增加，Bcl-2 表達減少，同時caspase-3，9 的活性增高，提示OGD 誘導神經(jīng)細胞凋亡由線粒體凋亡信號傳導。而異甘草素可抑制該信號通路的激活。研究顯示異甘草素顯著增加了Bcl-2 mRNA 表達并降低Bax mRNA 的表達，進而阻止caspase-3，9 的激活，這些均表明異甘草素在缺血再灌注損傷中，具有潛在的抗凋亡作用。而Nrf2 基因敲除可抑制這種作用，提示異甘草素的抗凋亡作用是通過與氧化應激反應相關的途徑介導的。異甘草素抗氧化應激，保持線粒體膜電位，阻止凋亡信號通路的激活。

綜上所述，研究結(jié)果表明，OGD/R 誘導神經(jīng)細胞的氧化應激和凋亡。異甘草素通過激活Nrf2/ARE 信號通路降低神經(jīng)細胞的氧化應激和凋亡。本研究揭示了OGD/R 后異甘草素神經(jīng)細胞保護作用的新機制，提示異甘草素可能是缺血性腦中風的潛在治療藥物。