俞杞泉，張惠勇，楊 揚(yáng)，壽偉臻，張 琨，李 陽

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海 200032；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)科技實(shí)驗(yàn)中心，上海 201203）

肺癌是目前世界上最常見惡性腫瘤，嚴(yán)重危害人類的健康。肺癌患者存在不同程度的免疫抑制情況［1-2］，人體免疫應(yīng)答與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及治療存在著息息相關(guān)的聯(lián)系［3］。手術(shù)聯(lián)合放化療是目前治療肺癌的主要方式，環(huán)磷酰胺等臨床常用的化療藥物對機(jī)體免疫功能的抑制已得到明確證實(shí)［4］。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，中藥及其復(fù)方抗肺癌的機(jī)理與改善肺癌患者機(jī)體免疫功能有密切關(guān)系［5］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，采用中藥金寧方灌胃后提取的小鼠血清有明顯的抑瘤作用［6］。為了進(jìn)一步觀察金寧方在免疫系統(tǒng)中的調(diào)控效應(yīng)，本研究重點(diǎn)觀察了金寧方對環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠的影響，初步探討了該復(fù)方改善肺癌免疫功能低下狀態(tài)并達(dá)到抗癌作用的可能機(jī)制。

1 材料

1.1 試劑 環(huán)磷酰胺（安道生，批號8D229 A，規(guī)格0.2 g/瓶）購自龍華醫(yī)院西藥房；RPMI-1640 培養(yǎng)液購買自美國ThermoFisher 公司；紅細(xì)胞裂解液（Cat349202）購自美國BD 公司；刀豆球蛋白A（Concanavalin A，ConA，CatC5275）、脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS，Cat.L2630）均購自美國Sigma 公司；CCK-8 檢測試劑（CK04）購自日本同仁化學(xué)科技有限公司。

1.2 動(dòng)物 Balb/c 小鼠35 只，雌性，體質(zhì)量18～20 g（6 周齡），SPF 級，購自西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司（生產(chǎn)許可證號SCXK（滬）2013-0016）。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF 屏障環(huán)境中，正常供食供水。所有實(shí)驗(yàn)操作均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利相關(guān)規(guī)定。

1.3 藥物 金寧方（石上柏30 g、石見穿30 g、干蟾皮15 g、僵蠶15 g、生牡蠣30 g）購自江蘇江陰天江藥業(yè)有限公司，制成顆粒劑（批號1907344）。

1.4 儀器 血細(xì)胞分析儀（邁瑞醫(yī)療國際股份有限公司，BC-2800 Vet）；全波長酶標(biāo)儀［美谷分子儀器（上海）有限公司，Gemini XPS］。

2 方法

2.1 環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)小鼠免疫抑制模型 將小鼠按隨機(jī)分為正常組、模型組、金寧方組，每組10 只。于實(shí)驗(yàn)第1、4、7 天給予環(huán)磷酰胺（75 mg/kg）腹腔注射誘導(dǎo)小鼠免疫抑制，在第10 天對各組小鼠進(jìn)行安樂死處理，檢測相關(guān)指標(biāo)。在實(shí)驗(yàn)全程中監(jiān)測小鼠體質(zhì)量并觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物整體狀況。

2.2 給藥 金寧方為中藥配方顆粒，按金寧方復(fù)方比例混合后用純水溶解。按小鼠/人代謝比推算小鼠每日給藥劑量為20 g/kg，灌胃給藥容量為0.1 mL/10 g。從第1 次環(huán)磷酰胺注射開始給藥。正常組與模型組給予相同方式的等容量對照溶劑，連續(xù)干預(yù)10 d。

2.3 外周血細(xì)胞檢測 在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，取各組小鼠全血，并用枸櫞酸鈉進(jìn)行抗凝處理。通過血細(xì)胞分析儀檢測外周血中各血細(xì)胞比例，主要關(guān)注淋巴細(xì)胞數(shù)量和血紅蛋白含量。

2.4 脾指數(shù)及脾淋巴細(xì)胞總數(shù)計(jì)數(shù) 在處死小鼠后，無菌取其脾臟，并對脾臟進(jìn)行稱重。根據(jù)實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)小鼠體質(zhì)量，計(jì)算每只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的脾指數(shù)，脾指數(shù)＝脾臟質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）。將脾臟磨碎，過膜，1 200 r/min 離心5 min。棄去上清。沉淀加入紅細(xì)胞裂解液每個(gè)脾臟約1 mL，混勻，靜置1 min，加入PBS，離心。再加入PBS，過膜，離心。將所剩細(xì)胞洗滌1～2 次，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液將細(xì)胞懸起，對每份細(xì)胞樣品進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算每只小鼠的脾臟中免疫相關(guān)細(xì)胞總數(shù)。

2.5 淋巴細(xì)胞增殖檢測 將每份細(xì)胞樣品的細(xì)胞濃度調(diào)至4×106/mL。于96 孔板中每孔加入相應(yīng)體積的各組細(xì)胞樣品懸液和有絲分裂原（終濃度為1 μg/mLConA 或2 μg/mL LPS），總體積200 μL。在對金寧方體外效應(yīng)的評價(jià)中，則再加入終濃度為0.32、1.6、8 μg/mL 藥物樣品，并用無藥物干預(yù)的絲裂原誘導(dǎo)細(xì)胞作為對照組，以細(xì)胞培養(yǎng)液（無細(xì)胞）為空白組。細(xì)胞于含5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)結(jié)束前6 h 每孔加入10 μL CCK8 反應(yīng)試劑。用全波長酶標(biāo)儀檢測450 nm 處吸光度值（OD），對照組細(xì)胞的增殖率為100%，以空白組陰性對照孔的OD作為未增殖本底扣除，歸一化計(jì)算并評價(jià)金寧方對于淋巴細(xì)胞增殖比率的影響。

3 結(jié)果

3.1 金寧方能改善免疫抑制小鼠的整體狀況 經(jīng)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的小鼠表現(xiàn)出活動(dòng)度下降、體質(zhì)量減輕、排泄物不成形，甚至體溫下降等整體毒副作用，而經(jīng)金寧方干預(yù)小鼠則在整體水平上均有所改善。通過每日體質(zhì)量監(jiān)測發(fā)現(xiàn)金寧方能夠明顯緩解環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的小鼠體質(zhì)量減輕，特別在環(huán)磷酰胺注射后的緩解期作用明顯，與模型組比較，金寧方組小鼠體質(zhì)量增加（P＜0.05，P＜0.01）。在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)對血紅蛋白的監(jiān)測中也能觀察的金寧方恢復(fù)血紅蛋白水平的趨勢，但由于個(gè)體差異明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖1～2。

圖1 金寧方對免疫抑制小鼠體質(zhì)量的影響（n=10）

圖2 金寧方對免疫抑制小鼠血紅蛋白的影響（n=10）

3.2 金寧方明顯緩解免疫抑制小鼠的淋巴細(xì)胞數(shù)量減少 在針對免疫系統(tǒng)的大體評價(jià)中發(fā)現(xiàn)，金寧方能夠明顯緩解環(huán)磷酰胺引起的脾臟減小，金寧方組脾指數(shù)較模型組增加（P＜0.01）。而對脾臟中淋巴細(xì)胞總數(shù)和外周血淋巴細(xì)胞數(shù)量的計(jì)數(shù)中也反應(yīng)出金寧方對于免疫系統(tǒng)的整體保護(hù)作用。見圖3～5。

圖3 金寧方對免疫抑制小鼠脾指數(shù)的影響（n=10）

圖4 金寧方對免疫抑制小鼠脾淋巴細(xì)胞總數(shù)的影響（n=10）

圖5 金寧方對免疫抑制小鼠外周血淋巴細(xì)胞的影響（n=10）

3.3 金寧方對于免疫抑制小鼠淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的促進(jìn)作用 而各組脾臟淋巴細(xì)胞在體外絲裂原誘導(dǎo)條件下，金寧方組與模型組比較也表現(xiàn)出更高的淋巴細(xì)胞增殖水平，提示復(fù)方對于免疫潛在活性的保護(hù)作用，其作用可能與記憶淋巴細(xì)胞相關(guān)。與體外藥效評價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，金寧方組較ConA 誘導(dǎo)的模型組淋巴細(xì)胞增殖率增加（P＜0.05），這可能與金寧方保護(hù)細(xì)胞免疫效應(yīng)相聯(lián)系。現(xiàn)代研究已證實(shí)，細(xì)胞免疫（特別是細(xì)胞毒性T 細(xì)胞）介導(dǎo)的抗腫瘤作用在癌癥防治中發(fā)揮著核心的作用，而金寧方對于肺癌的治療作用中對于免疫保護(hù)效應(yīng)可能與促進(jìn)了細(xì)胞免疫有關(guān)。見表1。

表1 不同誘導(dǎo)條件下金寧方對淋巴細(xì)胞的影響（，n=7）

表1 不同誘導(dǎo)條件下金寧方對淋巴細(xì)胞的影響（，n=7）

注：與正常組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05。

3.4 金寧方具有促進(jìn)體外淋巴細(xì)胞增殖水平效應(yīng) 金寧方具有促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖效應(yīng)，且在不同誘導(dǎo)條件下均表現(xiàn)出量效關(guān)系，其中無絲裂原條件下促進(jìn)比例明顯，而在絲裂原誘導(dǎo)條件下作用較緩和，ConA 誘導(dǎo)較LPS 誘導(dǎo)作用更為明顯，提示金寧方可直接活化淋巴細(xì)胞，并具有促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖的活性，且對于細(xì)胞免疫可能發(fā)揮更明顯的作用。見表2。

表2 不同誘導(dǎo)條件下不同濃度金寧方組的淋巴細(xì)胞水平（%，，n=3）

表2 不同誘導(dǎo)條件下不同濃度金寧方組的淋巴細(xì)胞水平（%，，n=3）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

4 討論

免疫是機(jī)體抑制腫瘤發(fā)生、生長和轉(zhuǎn)移的主動(dòng)調(diào)控機(jī)制［7］，目前腫瘤的免疫治療日益成為新興的抗癌治療手段，如基于促進(jìn)細(xì)胞毒性T 細(xì)胞（CTL）和抑制免疫抑制性膜分子功能的相關(guān)藥物正在FDA 開展臨床研究。程小珍等［8］發(fā)現(xiàn)晚期肺癌患者CD4+CD25+Treg 的比例顯著高于健康體檢者，表明腫瘤患者CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞是晚期肺癌患者免疫抑制及腫瘤進(jìn)展的原因之一。中醫(yī)藥在長期的歷史傳承中已被證明其安全性和臨床有效性，特別對于免疫系統(tǒng)的調(diào)控作用也不斷被證實(shí)具有其相關(guān)的藥理作用［9-10］?，F(xiàn)代中藥注射液扶助正氣、培植本元的藥理作用證實(shí)調(diào)節(jié)免疫功能是其抗肺癌的重要作用途徑之一［11］。

中醫(yī)認(rèn)為正氣維系人體正常生命活動(dòng)，是抗御外邪及防治疾病的基本物質(zhì)。它的強(qiáng)盛衰敗關(guān)系著人體的生命活動(dòng)及疾病的轉(zhuǎn)歸。從這個(gè)意義上講，中醫(yī)學(xué)正氣體現(xiàn)了現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的人體免疫功能［12］。人體正氣虛弱導(dǎo)致邪氣乘虛而入，肺失宣肅而致氣血津液輸布不利，體內(nèi)濕飲凝聚成痰，痰濕與血瘀互結(jié)，凝為積聚。與此同時(shí)，積聚又加劇了體內(nèi)氣血津液運(yùn)行不暢，臟腑失養(yǎng)而致機(jī)能不調(diào)、免疫低下。

金寧方主要由石上柏、石見穿、干蟾皮、僵蠶、生牡蠣等藥物組成，具有清熱解毒、化痰軟堅(jiān)之功，被長期用于臨床肺癌病人的治療，并在III 期肺癌術(shù)后抗復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移中被證明具有積極的作用，能明顯改善中醫(yī)臨床癥狀，提高生存質(zhì)量［13］。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，以石上柏組方的加味百合固金湯及金復(fù)康口服液均有扶正祛邪、提高免疫功能的作用［14］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，干蟾皮提取物華蟾素及牡蠣提取物牡蠣多糖均具有免疫增強(qiáng)作用［15-16］。

本研究基于免疫抑制小鼠模型，初步探討了金寧方對于免疫功能的保護(hù)和增強(qiáng)作用的可能機(jī)制。在體外研究中，發(fā)現(xiàn)金寧方能夠在較低藥物濃度范圍內(nèi)對淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)發(fā)揮濃度依賴的促進(jìn)效應(yīng)。由于復(fù)方的體內(nèi)吸收代謝過程復(fù)雜，因此又通過小鼠體內(nèi)研究同樣證實(shí)了金寧方對維持機(jī)體整體平衡及淋巴細(xì)胞整體水平均具有積極的治療作用。體內(nèi)外研究同時(shí)也顯示金寧方對于免疫系統(tǒng)的保護(hù)作用可能更傾向于對T 淋巴細(xì)胞反應(yīng)的保護(hù)，這可能提示與藥物的抗腫瘤效應(yīng)密切相關(guān)，達(dá)到祛邪與扶正的統(tǒng)一。本次研究主要基于體內(nèi)免疫抑制的微環(huán)境探討金寧方的免疫保護(hù)作用，在后期研究中則需通過荷瘤小鼠模型，如原位肺癌模型進(jìn)一步明確藥物的抗腫瘤效應(yīng)和藥理作用，特別是對于免疫的調(diào)控機(jī)制。而復(fù)方成分復(fù)雜，則需在嚴(yán)格藥物質(zhì)量控制的前提下，通過運(yùn)用現(xiàn)代高通量研究手段，并結(jié)合生物信息分析方法開展復(fù)方的綜合藥理研究。在后續(xù)研究中，希望通過對金寧方的具體藥物機(jī)制闡述為臨床治療提供更明確的科學(xué)依據(jù)，也為中醫(yī)復(fù)方研究提供可參考的現(xiàn)代研究模式。