張二飛，殷 紫，楊禮白

（1.江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 淮安 223003；2.江蘇護理職業(yè)學(xué)院，江蘇 淮安 223005；3.淮安市中醫(yī)院，江蘇 淮安 223001）

隨著經(jīng)濟社會的發(fā)展，人們的飲食習(xí)慣和結(jié)構(gòu)隨之改變，痛風(fēng)性腎病患病率正在逐年增長。痛風(fēng)性腎病，又稱尿酸性腎?。╱ric acid nephropathy，UAN），病因是患者體內(nèi)嘌呤代謝紊亂，血液中的尿酸排泄減少或者生成過多，在腎間質(zhì)的髓質(zhì)、遠端集合管易形成高尿酸鹽的晶體沉積，進而導(dǎo)致的腎損傷的一類疾?。?-3］，其臨床表現(xiàn)主要為腰部酸痛、尿量增加、夜尿增加、輕度尿蛋白、尿血、腎功能不全、高血壓、水腫等，少數(shù)可表現(xiàn)為急性腎衰竭。目前，西醫(yī)治療本病主要通過降低血尿酸水平，抑制尿酸生成或增加尿酸排泄為主，如非布司他、別嘌醇、苯溴馬隆等，但毒副作用較大，無法改善病理改變，長期服用會導(dǎo)致肝腎功能損害且易復(fù)發(fā)［4］。研究表明，傳統(tǒng)的中醫(yī)藥治療痛風(fēng)性腎病毒副作用較小療效顯著［5-8］。健脾清熱利濁湯為江蘇省淮安市中醫(yī)院的臨床經(jīng)驗方，主要由茯苓、薏苡仁、萆薢、虎杖、六月雪等多味中藥組成，具有利水滲濕，清熱解毒，活血散瘀等功效，臨床治療痛風(fēng)性腎病療效較好，但具體作用機制尚不明確。因此，本研究應(yīng)用乙胺丁醇聯(lián)合腺嘌呤建立UAN 大鼠模型，考察健脾清熱利濁湯對其腎臟保護作用及其相關(guān)機制。

1 材料

1.1 動物 雄性SPF 級SD 大鼠共100 只，體質(zhì)量（200±20）g，購于南京青龍山動物繁殖廠（生產(chǎn)許可證號SCXK（蘇）：2017-0001），動物自由進食及飲水。

1.2 藥物 健脾清熱利濁湯由萆薢、茯苓、薏苡仁、澤瀉、虎杖、六月雪、蒼術(shù)、黃柏、秦艽、地鱉蟲等組成，健脾清熱利濁湯加8 倍量水浸泡1 h，加熱沸騰后再回流1 h，濾過備用，剩余藥材再次加6 倍量水，再次加熱回流提取1 h，合并2 次濾液，濾過濃縮成浸膏（生藥量5 g 生藥/mL）；鹽酸乙胺丁醇片（成都錦華藥業(yè)有限公司，國藥準字 H51020917）；腺嘌呤（美國Sigma 公司，批號102076748）；苯溴馬隆片（德國赫曼大藥廠，批號H20171301）。

1.3 試劑 大鼠尿蛋白定量試劑盒（上海盈公酶聯(lián)生物有限公司，批號YG-E-5096）；大鼠尿素氮（BUN）（ELISA）試劑盒（北京綠源伯德生物科技有限公司，批號DG21036D-48）；IgG（HRP）（英國Abcam 公司，貨號ab6734）；尿酸檢測試劑盒（萊爾生物有限公司，批號LE-06203）；大鼠肌酐（SCr）試劑盒（北京綠源伯德生物科技有限公司，批號DG94526Q-48）；GLUT9（英國Abcam公司，貨號ab223470）；ABCG2（英國Abcam 公司，貨號ab207732）；免疫組化通用型試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，批號13J31H10J1022）；水合氯醛（國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號YA11098000AL）；免疫組化DAB 試劑（武漢博士德生物工程有限公司，批號13I04A22）。

1.4 儀器 臺秤（上海月梓電子科技有限公司，型號MH5MB）；電熱培養(yǎng)恒溫箱（上海善志有限公司，型號DHP-9052）；石蠟切片機（德國萊卡公司，型號CUT4062）；顯微鏡（日本奧林巴斯株式會社，型號BX-53）；烤片機（德國萊卡公司）；包埋機（德國萊卡公司，型號EG1160）；生物組織脫水機（孝感奧華醫(yī)療科技有限公司）；防脫載玻片（杭州曉柚科技有限公司）；酶標儀（杭州奧盛儀器有限公司，型號AMR-100）；高速冷凍離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司，型號TGL-20M）。

2 方法

2.1 造模與給藥 選取60 只大鼠喂養(yǎng)1 周后分組，分為正常組、苯溴馬隆片組、模型組及健脾清熱利濁湯低、中、高劑量組，每組10 只。正常組蒸餾水灌胃；其他組每天灌胃乙胺丁醇（250 mg/kg）和腺嘌呤（200 mg/kg）進行造模15 d。第8 天開始給予苯溴馬隆10 mg/kg、健脾清熱利濁湯3 g 生藥/kg、6 g 生藥/kg、12 g 生藥/kg，給藥容量為20 mL/kg，給藥1 次/d，治療周期為28 d；模型組在第8天后等容量蒸餾水灌胃。

2.2 樣本留取和指標觀察

2.2.1 尿量與尿蛋白 各組在給藥的第28 天，測定24 h尿量，同時進行24 h 尿蛋白水平檢測。

2.2.2 血液 28 d 后，腹腔注射10%水合氯醛（3.0 mL/kg）麻醉，腹主動脈采血，離心（3 000 r/min）10 min，取上清液，ELISA 測血清尿酸、肌酐、尿素氮。

2.3 腎組織形態(tài)學(xué)觀察 大鼠腹主動脈取血后立刻解剖摘取右側(cè)腎組織，剝離腎外膜，將腎臟稱重。腎臟置于4%的多聚甲醛中固定，用于HE 染色及免疫組織化學(xué)檢測。

2.3.1 HE 染色 按照常規(guī)HE 染色方法進行。

2.3.2 免疫組化染色 將腎臟切片置于烘箱內(nèi)60 ℃，脫蠟，至水；PBS 洗滌2 次，10 min/次，3% H2O2室溫放置10 min，滅活內(nèi)原性酶，0.01 mol/L 枸櫞酸鹽溶液，加熱至沸騰后，室溫放涼，PBS 洗滌2 次，10 min/次，5% BSA封閉液，室溫20 min，滴加適當稀釋的一抗，4 ℃過夜。PBS 洗滌3 次，10 min/次，滴加生物素化兔抗大鼠IgG，37 ℃孵育20 min，PBS 洗滌3 次，10 min/次，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、樹脂膠封片，顯微鏡下觀察，拍照采集信息，并用Image J 軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2.4 統(tǒng)計學(xué)分析 通過SPSS 17.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，數(shù)據(jù)以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 一般觀察 與正常組相比，模型組大鼠逐漸出現(xiàn)多飲、多尿，體質(zhì)量增加緩慢等癥狀，造模過程中，有1 只大鼠死亡，實驗結(jié)束后，每組大鼠分別為正常組10 只，模型組9 只，健脾清熱利濁湯高劑量組10 只，中劑量組10只，低劑量組10 只，苯溴馬隆組10 只。

3.2 健脾清熱利濁湯對痛風(fēng)性腎病大鼠24 h 尿量及尿蛋白影響 與正常組比較，模型組大鼠24 h 尿量升高（P＜0.01）；尿蛋白量升高（P＜0.05）。與模型組相比，健脾清熱利濁湯12 g/kg 劑量組，24 h 尿量降低（P＜0.01）；尿蛋白量降低（P＜0.05）。苯溴馬隆片組24 h 尿量及尿蛋白含量降低（P＜0.01）；健脾清熱利濁湯6 g/kg 劑量組尿量降低（P＜0.05）。見表1。

表1 健脾清熱利濁湯對痛風(fēng)性腎病模型大鼠24 h 尿量及尿蛋白定量的影響（）

表1 健脾清熱利濁湯對痛風(fēng)性腎病模型大鼠24 h 尿量及尿蛋白定量的影響（）

注：與正常組相比，#P ＜0.05，##P ＜0.01；與模型組相比，*P ＜0.05，**P＜0.01。

3.3 健脾清熱利濁湯對痛風(fēng)性腎病大鼠模型腎系數(shù)的影響 與正常組相比，模型組大鼠腎系數(shù)（大鼠雙側(cè)腎臟的質(zhì)量與體質(zhì)量的比值）升高（P＜0.01）。健脾清熱利濁湯6 g/kg 劑量組、12 g/kg 劑量組及苯溴馬隆片10 mg/kg 組腎系數(shù)降低（P＜0.01）。見表2。

表2 健脾清熱利濁湯對痛風(fēng)性腎病模型大鼠腎系數(shù)的影響（）

表2 健脾清熱利濁湯對痛風(fēng)性腎病模型大鼠腎系數(shù)的影響（）

注：與正常組相比，## P ＜0.01；與模型組相比，* P ＜0.05，**P＜0.01。

3.4 健脾清熱利濁湯對痛風(fēng)性腎病大鼠模型尿酸、肌酐及尿素氮的影響 模型組與正常組比較，尿素氮、尿酸及肌酐升高（P＜0.01）。健脾清熱利濁湯12 g/kg 劑量組與模型組相比尿素氮、尿酸及肌酐降低（P＜0.01）；健脾清熱利濁湯6 g/kg 劑量組與模型組相比尿素氮、肌酐及尿酸降低（P＜0.05）；苯溴馬隆片10 mg/kg 組與模型組相比尿素氮、肌酐降低（P＜0.01），尿酸降低（P＜0.05）。見表3。

3.5 健脾清熱利濁湯對痛風(fēng)性腎病模型大鼠腎組織形態(tài)學(xué)影響 模型組大鼠的腎組織的HE 染色顯示腎小球部分萎縮（箭頭表示），腎小管細胞在不同程度上彌漫性腫脹（圓圈表示），尿酸鈉晶體沉積在小管和間質(zhì)中并且纖維組織（正方形表示），但健脾清熱利濁湯組及苯溴馬隆組可以不同程度減輕腎損傷。見圖1、表4。

表3 健脾清熱利濁湯對痛風(fēng)性腎病模型大鼠尿酸、肌酐及尿素氮的影響（）

表3 健脾清熱利濁湯對痛風(fēng)性腎病模型大鼠尿酸、肌酐及尿素氮的影響（）

注：與正常組相比，##P＜0.01；與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

圖1 健脾清熱利濁湯對痛風(fēng)性腎病模型大鼠腎臟形態(tài)學(xué)的影響（HE，×40）

表4 健脾清熱利濁湯對腎臟病理切片腎小管個數(shù)和病變面積（）

表4 健脾清熱利濁湯對腎臟病理切片腎小管個數(shù)和病變面積（）

注：與正常組相比，##P＜0.01；與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.6 健脾清熱利濁湯對痛風(fēng)性腎病模型大鼠ABCG2 及GLUT9 表達的影響 與正常組相比，模型組ABCG2 陽性細胞表達降低，GLUT9 陽性細胞表達增加（P＜0.01）；與模型組相比，健脾清熱利濁湯高劑量組12 g/kg、苯溴馬隆片組增加ABCG2 表達增加（P＜0.05）；GLUT9 表達降低（P＜0.01）；見圖2～3、表5。

圖2 健脾清熱利濁湯對痛風(fēng)性腎病模型大鼠腎臟ABCG2 的影響（×40）

圖3 健脾清熱利濁湯對痛風(fēng)性腎病模型大鼠腎臟GLUT9 的影響（×40）

表5 健脾清熱利濁湯對痛風(fēng)性腎病模型大鼠ABCG2 及GLUT9 表達的影響（）

表5 健脾清熱利濁湯對痛風(fēng)性腎病模型大鼠ABCG2 及GLUT9 表達的影響（）

注：與正常組比較，## P ＜0.01，與模型組比較，* P ＜0.05，**P＜0.01。

4 討論

中醫(yī)認為痛風(fēng)性腎病患者的病機多為濕、熱、瘀，表現(xiàn)為濕熱內(nèi)蘊，脈絡(luò)瘀阻。故治療原則應(yīng)為清熱、祛濕、活血、通絡(luò)［9-10］。健脾清熱利濁湯由萆薢、茯苓、薏苡仁、六月雪、虎杖、澤瀉、蒼術(shù)、黃柏、秦艽、地鱉蟲等組成，具有利水滲濕，清熱解毒，活血散瘀的功效。

尿蛋白是反映腎功能是否正常的重要指標。腎指數(shù)、血清肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）是檢測腎功能的主要指標之一，這些指標反映了腎小球的濾過、腎小管重吸收等功能。當腎發(fā)生實質(zhì)損害時，降低腎小球的濾過率，導(dǎo)致血清Scr、BUN 濃度升高。

多種尿酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白參與人近曲腎小管對尿酸鹽的轉(zhuǎn)運［10］，如ATP 結(jié)合轉(zhuǎn)運蛋白G2（ABCG2）及葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白9（GLUT9）［11-12］。GLUT9 可將尿酸重吸收至上皮細胞內(nèi)，再將尿酸轉(zhuǎn)運到血液中。ABCG2，是一種高效的尿酸轉(zhuǎn)運蛋白，可將尿酸轉(zhuǎn)運至腎小管管腔，經(jīng)尿液排出體外，可見GLUT9 與ABCG2 尿酸鹽轉(zhuǎn)運體良性調(diào)控可有效促進腎臟尿酸排泄，降低血尿酸［13-14］。

在本研究中，健脾清熱利濁湯顯著降低了24 h-蛋白尿、腎系數(shù)、尿酸、Scr、BUN 的水平。此外，腎組織學(xué)顯示，健脾清熱利濁湯可明顯抑制GLUT9 蛋白表達，促進ABCG2 蛋白表達，表明健脾清熱利濁湯可通過上調(diào)腎小管上皮細胞中的ABCG2 來促進腎臟對尿酸的排泄；同時下調(diào)GLUT9 來抑制腎臟對尿酸的重吸收，最終達到降低血尿酸水平的作用，說明健脾清熱利濁湯具有改善腎功能的作用。

研究表明健脾清熱利濁湯可通過抑制患者腎臟中GLUT9 和提高ABCG2 尿酸鹽轉(zhuǎn)運體的蛋白表達水平，降低腎小管對尿酸的重吸收，促進尿酸排泄，實現(xiàn)減少尿酸、BUN 和Scr 的水平，從而達到保護腎臟的作用。