張晨宇，袁志軍，萬林峰，鄢雨晴，曾 芳

（1.宜春市人民醫(yī)院 藥學(xué)部，江西 宜春 336000；2.武漢協(xié)和醫(yī)院 藥學(xué)部，湖北 武漢 430022）

肝纖維化是指由化學(xué)毒物性損傷、慢性肝炎病毒感染、非酒精性脂肪肝、自身免疫性肝病、先天性代謝缺陷、酗酒等因素引起的以肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生為主要特征的病理、生理過程［1］。肝纖維化嚴(yán)重危害人類健康，在全世界常見的死亡原因中排名第14 位，發(fā)病率及死亡率均呈逐漸增加趨勢［2］。目前臨床上治療肝纖維化的主要藥物包括聯(lián)苯雙酯、水飛薊素、熊去氧膽酸、西列丙胺、維甲酸及干擾素γ 等，但這些藥物療效并不理想，加之較大的毒副反應(yīng)和昂貴的治療費用，極大的阻礙了此類疾病的治療［3］。中藥治療肝纖維化具有療效高、低毒副反應(yīng)、費用低等優(yōu)點，逐漸得到人們的重視［4］。

苦瓜入藥歷史十分悠久，為葫蘆科苦瓜屬植物，因具有特殊苦味而得名，在亞洲許多地區(qū)和國家均有記載［5］。研究表明，苦瓜具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、提高免疫力、降低膽固醇及抗艾滋病等多種顯著的生理活性，其活性成分主要為皂苷、酚類、生物堿、多糖和多肽等［6-8］?？喙霞捌浠钚猿煞謱Ω螕p傷的作用多見報道，如苦瓜多糖對CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝損傷具有保護(hù)作用［9］；苦瓜甾醇對乙酰氨基酚所致小鼠肝損傷具有明顯保護(hù)作用，機制涉及清除自由基能力的提高及酶防御系統(tǒng)功能的維持等［10］；苦瓜皂苷可通過降低機體氧化應(yīng)激水平，減輕肝細(xì)胞脂肪變性［11］。但是關(guān)于苦瓜皂苷對肝纖維化大鼠肝組織的保護(hù)作用及機制研究鮮有報道。因此，本研究擬通過建立CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型，在探討苦瓜皂苷對肝纖維化保護(hù)作用的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步明確其對肝組織抗氧化能力及TGF-β1/Smad信號通路的影響。

1 材料

1.1 動物 SD 大鼠，48 只，雄性，體質(zhì)量（200±20）g，購自中國科學(xué)院斯萊克實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（京）2011-0012；自由飲水，常規(guī)條件飼養(yǎng)，飼養(yǎng)1周后用于正式實驗。

1.2 藥物和試劑 苦瓜皂苷（批號20170125，純度為87.2%）購自西安文竹生物科技有限公司，臨用前用0.5%羧甲基纖維素鈉配制所需濃度的混懸液；聯(lián)苯雙脂（批號160123）購自北京協(xié)和制藥廠；CCl4（批號C128126）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，臨用前用橄欖油稀釋；AST、ALT、LN 及HA 檢測試劑盒（批號分別為20180216、20171209、20180321、20171126）購自上海研晶生物科技有限公司；CAT、SOD 及MDA 等抗氧化能力檢測試劑盒（批號分別為180105、180417、171021）購自南京建成生物工程研究所；TGF-β1、p-Smad 3 多克隆抗體（批號分別為SC-7982、SC-11769）購自美國Santa Cruz 公司。

1.3 儀器 AB-160 型分析天平（美國Denver 公司）；TDL-40B 型臺式離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；DW-HL388 型超低溫冰箱（中科美菱低溫科技有限公司）；UV1800 型紫外可見分光光度計（上海菁華儀器有限公司）；WD-2 102 A型全自動酶標(biāo)儀（北京六一儀器廠）；Mini-PROTEAN Tetra型蛋白電泳及轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司）。

2 方法

2.1 造模、分組及給藥 將SD 大鼠隨機分為正常對照組、模型組、聯(lián)苯雙酯組及苦瓜皂苷低、中、高劑量組，每組8 只；苦瓜皂苷低、中、高劑量組給藥劑量設(shè)置依據(jù)預(yù)實驗結(jié)果。除正常對照組外，每組大鼠背部皮下均注射CCl4（1 mL/kg），2 次/周，共12 周，正常對照組背部皮下注射等體積橄欖油；第5 周時，聯(lián)苯雙酯組灌胃150 mg/kg 聯(lián)苯雙酯，苦瓜皂苷低、中、高劑量組分別灌胃給予150、300、600 mg/kg 苦瓜皂苷，正常對照組和肝纖維化模型組灌胃給予等體積0.5%羧甲基纖維素鈉；1 次/d，持續(xù)至第12 周，期間密切觀察大鼠一般狀態(tài)。

2.2 血清AST、ALT、LN 及HA 水平檢測 末次給藥后24 h，水合氯醛麻醉大鼠，腹主動脈取血；3 000 r/min 離心20 min，分離血清；按照試劑盒說明書中的操作方法，檢測苦瓜皂苷對肝纖維化大鼠血清AST、ALT、LN 及HA水平的影響。

2.3 肝組織抗氧化能力檢測 腹主動脈取血后，剖取大鼠肝臟；固定部位取500 mg 肝組織，經(jīng)預(yù)冷的生理鹽水漂洗沖去表面血液及濾紙拭干后，加適量生理鹽水制備10%肝組織勻漿液；3 000 r/min 離心20 min，吸取上清液分裝至1.5 mL 離心管中，-80 ℃冰箱中凍存?zhèn)溆?。采用比色法分別檢測苦瓜皂苷對肝纖維化大鼠肝組織CAT、SOD 及MDA水平的影響。

2.4 肝組織TGF-β1 及p-Smad 3 表達(dá)檢測 稱取固定部位的肝組織100 mg，經(jīng)預(yù)冷的生理鹽水漂洗沖去表面血液及濾紙拭干后，加入RIPA 細(xì)胞裂解液，置于冰水浴中進(jìn)行裂解（20 min），然后離心（10 000 r/min，15 min）；BCA法測蛋白濃度。取等量蛋白（10 μg）行10% SDS-PAGE 電泳，常規(guī)方法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、封閉后，加入TGF-β1 及p-Smad 3一抗（均為1∶1 000），室溫孵育2 h；經(jīng)緩沖液TBST 洗膜后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體（二抗），繼續(xù)室溫孵育1 h，增強化學(xué)發(fā)光法顯影。采用圖像分析軟件分析各條帶光密度值，通過目的條帶光密度與內(nèi)參（GAPDH）光密度的比值進(jìn)行半定量。

2.5 HE 染色 采用中性甲醛（4%）固定肝組織，經(jīng)乙醇脫水及石蠟包埋等步驟后，行連續(xù)切片后封閉。常規(guī)方法進(jìn)行HE 染色，鏡下觀察肝組織病理形態(tài)。

2.6 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 15.0 軟件進(jìn)行分析。所得數(shù)據(jù)以（）表示，多組間比較采用方差分析；以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 苦瓜皂苷對肝纖維化大鼠一般狀態(tài)的影響 正常對照組大鼠體質(zhì)量穩(wěn)步增加，一般狀態(tài)良好，反應(yīng)敏捷，皮毛光澤；肝纖維化模型組大鼠體形消瘦，一般狀況較差，反應(yīng)遲鈍，皮毛缺少光澤；苦瓜皂苷組一般狀態(tài)好于肝纖維化模型組，反應(yīng)較敏捷，皮毛基本光澤。

3.2 苦瓜皂苷對肝纖維化大鼠血清AST 及ALT 水平的影響 與正常對照組比較，肝纖維化模型組大鼠血清AST、ALT 水平升高（P＜0.05）；與模型組大鼠比較，低、中、高劑量苦瓜皂苷組大鼠血清AST、ALT 水平均降低（P＜0.05）。見表1。

表1 苦瓜皂苷對肝纖維化大鼠血清AST、ALT 水平的影響（，n=8）

表1 苦瓜皂苷對肝纖維化大鼠血清AST、ALT 水平的影響（，n=8）

注：與正常對照組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05。

3.3 苦瓜皂苷對肝纖維化大鼠血清LN 及HA 水平的影響 與正常對照組比較，模型組大鼠血清LN、HA 水平升高（P＜0.05）；與肝纖維化模型組大鼠比較，低、中、高劑量苦瓜皂苷組大鼠血清LN 水平降低（P＜0.05），中、高劑量苦瓜皂苷組HA 水平降低（P＜0.05）。見表2。

表2 苦瓜皂苷對肝纖維化大鼠血清LN 及HA 水平的影響（，n=8）

表2 苦瓜皂苷對肝纖維化大鼠血清LN 及HA 水平的影響（，n=8）

注：與正常對照組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05。

3.4 苦瓜皂苷對肝纖維化大鼠肝組織抗氧化能力的影響 與正常對照組比較，肝纖維化模型組大鼠肝組織CAT、SOD 水平降低，而MDA 水平升高（P＜0.05）；與肝纖維化模型組大鼠比較，中、高劑量的苦瓜皂苷組大鼠肝組織CAT 水平和低、中、高劑量的苦瓜皂苷組SOD 水平均升高，而苦瓜皂苷各劑量組MDA 水平降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 苦瓜皂苷對肝纖維化大鼠肝組織抗氧化能力的影響（，n=8）

表3 苦瓜皂苷對肝纖維化大鼠肝組織抗氧化能力的影響（，n=8）

注：與正常對照組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05。

3.5 苦瓜皂苷對肝纖維化大鼠肝組織TGF-β1 及p-Smad 3表達(dá)的影響 與正常對照組比較，肝纖維化模型組大鼠肝組織TGF-β1 及p-Smad 3 表達(dá)增加（P＜0.05）；與肝纖維化模型組大鼠比較，低、中、高劑量的苦瓜皂苷組大鼠肝組織TGF-β1 及p-Smad 3 蛋白表達(dá)均降低（P＜0.05）。見表4、圖1。

表4 苦瓜皂苷對肝纖維化大鼠肝組織TGF-β1 及p-Smad 3表達(dá)的影響（，n=8）

表4 苦瓜皂苷對肝纖維化大鼠肝組織TGF-β1 及p-Smad 3表達(dá)的影響（，n=8）

注：與正常對照組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05。

圖1 Western blot 檢測各組TGF-β1、p-Smad 3 蛋白表達(dá)

3.6 苦瓜皂苷對肝纖維化大鼠肝組織病理形態(tài)的影響 正常對照組大鼠肝細(xì)胞圍繞中央靜脈呈放射狀排列，形態(tài)正常，肝小葉完整；肝纖維化模型組大鼠肝細(xì)胞排列紊亂、腫脹嚴(yán)重且許多肝細(xì)胞脂肪變性呈空泡狀，可見大量纖維結(jié)締組織增生，肝小葉破壞嚴(yán)重；與肝纖維化模型組大鼠比較，苦瓜皂苷組肝細(xì)胞排列基本正常，病變程有不同程度的緩解。見圖2。

圖2 HE 染色檢測苦瓜皂苷對肝纖維化大鼠肝組織病理形態(tài)的影響（×200）

4 討論

本研究通過灌胃給予肝纖維化模型大鼠低、中、高劑量的苦瓜皂苷后，發(fā)現(xiàn)其可以有效降低模型大鼠血清AST及ALT 水平。AST 和ALT 為世衛(wèi)組織推薦的檢測肝功能損傷與否的最敏感指標(biāo)，當(dāng)肝功能受損時，血清AST 和ALT水平顯著增加［12］；而苦瓜皂苷可以有效降低模型大鼠血清AST 和ALT 水平，表明其具有保護(hù)肝臟損傷作用。在肝纖維化過程中，細(xì)胞外基質(zhì)的代謝產(chǎn)物如LN 和HA 等釋放入血，因而血清中LN 和HA 水平可反應(yīng)肝纖維化程度［13］。本研究發(fā)現(xiàn)，與肝纖維化模型組大鼠比較，低、中、高劑量的苦瓜皂苷組大鼠血清LN 及HA 水平均有不同程度的降低，其中各劑量組的LN 水平及中、高劑量組的HA 水平呈顯著性降低，以上結(jié)果進(jìn)一步表明苦瓜皂苷具有減輕模型大鼠肝纖維化程度的作用。

肝纖維化病理機制復(fù)雜，大量證據(jù)表明，多種因素所致肝纖維化均伴有氧化應(yīng)激水平的增加，氧化應(yīng)激與肝纖維化發(fā)病機制之間的關(guān)系受到越來越多的重視［14］。國內(nèi)外很多學(xué)者嘗試應(yīng)用抗氧化劑治療各種病因所致的肝纖維化，取得較好效果，如白藜蘆醇、維生素E、褪黑激素及水飛薊素等均可以通過抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，降低氧化應(yīng)激水平，進(jìn)而起到減輕肝纖維化程度的作用［15］。由于CAT 及SOD 是細(xì)胞內(nèi)清除氧自由基的主要抗氧化物酶，而MDA 是脂質(zhì)過氧化過程中的最終產(chǎn)物，因此，通過檢測CAT、SOD 及MDA 水平可以反映細(xì)胞受氧化損傷的嚴(yán)重程度［16］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與肝纖維化模型組大鼠比較，各劑量的苦瓜皂苷組大鼠肝組織CAT 和SOD 水平均顯著升高，而MDA 水平則顯著降低；以上結(jié)果提示，苦瓜皂苷對CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠的保護(hù)作用可能與抗氧化作用有關(guān)。

TGF-β1/Smad 信號通路在肝纖維化的發(fā)生及發(fā)展中具有重要作用，TGF-β1 具有刺激肝星形細(xì)胞增殖與活化的作用，而Smad 蛋白可將TGF-β1 信號由細(xì)胞漿轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核，從而調(diào)控LN、HA 及羥脯氨酸等蛋白的表達(dá)，最終導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生與進(jìn)展［17-18］。研究表明，夏枯草總?cè)茖Cl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠具有較好的保護(hù)作用，其機制可能與調(diào)控TGF-β1/Smad 信號通路及下調(diào)p-ERK 表達(dá)有關(guān)［19］。丹參素及白芍總苷等對肝纖維化大鼠的保護(hù)作用也均與抑制TGF-β1/Smad 信號通路的活化有關(guān)［20-21］。本研究結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)，灌胃給予肝纖維化模型大鼠低、中、高劑量的苦瓜皂苷后，模型大鼠肝組織TGF-β1 及p-Smad 3 蛋白表達(dá)水平顯著降低。此結(jié)果提示，苦瓜皂苷對CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠的保護(hù)作用可能與抑制TGF-β1/Smad 信號通路的活化有關(guān)。

綜上所述，苦瓜皂苷對CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠具有較好的保護(hù)作用，該作用與抗氧化及抑制TGF-β1/Smad 信號通路有關(guān)。