劉 敬，趙 斌*，劉曉鑫，曹 暉，王 瓊

（1.中山火炬職業(yè)技術(shù)學(xué)院健康產(chǎn)業(yè)學(xué)院，廣東 中山 528436；2.國家中藥現(xiàn)代化工程技術(shù)研究中心中山健康產(chǎn)品分中心，廣東 中山 528436；3.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；4.國家中藥現(xiàn)代化工程技術(shù)研究中心，廣東 珠海 519085）

水蛭是一味具有破血通經(jīng)、逐瘀消癓的常用動(dòng)物類中藥，現(xiàn)收載于2015 年版《中國藥典》一部［1］，該藥材使用歷史悠久，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，但因其藥效峻猛、有小毒而被列為下品，臨床上常將其炮制后再內(nèi)服使用［2］。漢代《金匱玉函經(jīng)》載有“熬”，為水蛭最早的炮制方法，宋代至清末的文獻(xiàn)中還有不加輔料炮制（炒、煨、焙）、加輔料炮制（米制、石灰制、豬脂制、麝香制、鹽制、油制）等10 余種方法，實(shí)質(zhì)上均為加熱處理［2-3］。

目前，市場(chǎng)上常見的水蛭炮制品有（凈）水蛭、燙水蛭、酒炙水蛭等，其中燙水蛭主要以滑石粉為輔料，收載于自1977 年版起的歷版《中國藥典》、1988 年版《全國中藥炮制規(guī)范》，以及廣西、浙江等地方炮制規(guī)范中［4-6］。現(xiàn)代學(xué)者研究酒炙［7］、滑石粉加酒和姜炮制［8］、麥麩加酒炮制［9］、焙制、電熱烘烤［10］等水蛭炮制新方法，也關(guān)注了炮制前后其水溶性蛋白的差異性［11］、不同炮制方法下的體外抗凝活性［12］。但國家和地方炮制規(guī)范對(duì)水蛭燙制工藝的溫度、時(shí)間、滑石粉用量、翻炒速度等關(guān)鍵參數(shù)均無統(tǒng)一規(guī)定，大多憑藥工主觀經(jīng)驗(yàn)來進(jìn)行評(píng)價(jià)［4-6］，從而影響了炮制品質(zhì)量。課題組前期制定了一些藥材的滑石粉燙制工藝規(guī)范［13-15］，本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化水蛭滑石粉燙制工藝，并分析了炮制前后其理化指標(biāo)的變化，以期為相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考。

1 材料

1.1 儀器 CY-20 型電熱型炒藥機(jī)（江陰市祝塘明科機(jī)械廠）；2500C 型粉碎機(jī)（永康市艾澤拉電器有限公司）；101-2AB 型鼓風(fēng)烘箱（天津泰斯特儀器有限公司）；ATX224 電子分析天平（日本島津公司）；A300 全自動(dòng)氨基酸分析儀（德國曼默博爾公司）；K9860 全自動(dòng)凱氏定氮儀（濟(jì)南海能儀器股份有限公司）；DCY-12G 氮吹儀（青島海科儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥物 水蛭購于廣州漢草醫(yī)藥科技有限公司（批號(hào)20170409），經(jīng)中山火炬職業(yè)技術(shù)學(xué)院趙斌教授鑒定為水蛭科動(dòng)物螞蟥Whitmania pigraWhitman?；郏兾魇ト疳t(yī)藥科技有限公司，批號(hào)20170518）；牛纖維蛋白原（100 mg，批號(hào)F20170412）、凝血酶（1 000 U，CAS 號(hào)9002-04-4）（合肥博美生物科技有限責(zé)任公司）；氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液（德國曼默博爾公司，含18 種氨基酸，胱氨酸濃度為50 nmol/mL，其余均為100 nmol/mL）。乙醇、氯化鈉、三羥甲基氨基甲、鹽酸等試劑均為分析純；水為去離子水。

2 方法與結(jié)果

2.1 燙制工藝優(yōu)化

2.1.1 因素水平確定 翻炒速度為非連續(xù)性數(shù)據(jù)，故本實(shí)驗(yàn)將其設(shè)定為12 r/min。以燙制溫度（A）、燙制時(shí)間（B）、滑石粉用量（C）為影響因素，各因素5 個(gè)水平，見表1。

2.1.2 燙制品制備 取20 份凈水蛭段，每份50 g。先將滑石粉加入炒藥機(jī)內(nèi)，待機(jī)器達(dá)到規(guī)定溫度后再投入藥材，翻炒規(guī)定時(shí)間（12 r/min）后立即取出，篩去滑石粉，放涼，即得。

表1 因素水平

2.1.3 評(píng)價(jià)指標(biāo)測(cè)定

2.1.3.1 粉碎率 取燙制品20 g，粉碎30 s 后過100 目篩，收集，稱定過100 目篩粉末的質(zhì)量，計(jì)算粉碎率。

2.1.3.2 醇溶性浸出物 按2015 年版《中國藥典》四部2201 的醇溶性浸出物測(cè)定法中的熱浸法進(jìn)行測(cè)定，浸出溶劑為稀乙醇。

2.1.3.3 抗凝血酶活性 按2015 年版《中國藥典》一部水蛭項(xiàng)下方法［1，16］進(jìn)行測(cè)定。

2.1.4 數(shù)據(jù)處理 “2.1.3”項(xiàng)下指標(biāo)測(cè)定結(jié)果越大，炮制效果越好，故本實(shí)驗(yàn)按公式dmax＝（Yi-Ymin）/（Ymax-Ymin）進(jìn)行轉(zhuǎn)換，求得“歸一值”［17］，再計(jì)算幾何平均數(shù)，得總評(píng)“歸一值”（OD），公式為OD＝（d1d2…dn）1/n（n＝3）。結(jié)果見表2。

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.1.5 模型擬合及方差分析 通過Design-Expert 8.0.5b版軟件對(duì)表2 數(shù)據(jù)進(jìn)行多元線性回歸和二項(xiàng)式擬合，得方程為OD＝-0.57+0.036A+0.027B-0.031C-0.15AB-0.091AC-0.094BC-0.090A2-0.11B2-0.011C2（R2＝0.955 7，P＜0.000 1）。方差分析顯示，各因素影響程度依次為燙制溫度（A）＞滑石粉用量（C）＞燙制時(shí)間（B），其中炮制溫度具有顯著影響（P＜0.05）；所得方程擬合度良好，可信度高（R2＝0.955 7，P＜0.000 1）。

2.1.6 響應(yīng)面分析 見圖1。綜合考慮實(shí)際炮制過程中的可操作性，確定最優(yōu)工藝為燙制溫度195 ℃，燙制時(shí)間3.5 min，滑石粉用量30%，OD為0.641。

2.1.7 驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)優(yōu)化工藝進(jìn)行3 批驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得平均OD為 0.633，與預(yù)測(cè)值 0.641 接近（偏差為-1.25%），表明工藝穩(wěn)定可行。生品和燙制品見圖2。

2.2 質(zhì)量評(píng)價(jià)

2.2.1 水分、醇溶性浸出物、含氮量、抗凝血酶活性測(cè)定 按照2015 年版《中國藥典》方法進(jìn)行測(cè)定［1］，結(jié)果見表3。由此可知，燙制后上述指標(biāo)均較生品下降。

表3 水分、醇浸出物、含氮量、抗凝血酶活性測(cè)定結(jié)果（n=2）

2.2.2 氨基酸含有量測(cè)定 參考文獻(xiàn)［18］報(bào)道。精密稱取水蛭粉末約30 mg，置于水解管中，加入6 mol/L 鹽酸15 mL、苯酚3～4 滴，于冷凍機(jī)中冷卻3 min 后抽真空，充氮?dú)?，重?fù)3 次，在充氮?dú)鉅顟B(tài)下封口，再于烘箱中加熱至110 ℃水解22 h，取出，冷卻至室溫，過濾水解液，濾液轉(zhuǎn)移至50 mL 量瓶中，水解管用水洗滌3～5 次，洗液合并至量瓶中，加水定容至刻度，精密吸取1.0 mL 至試管中，40 ℃下減壓干燥，殘?jiān)? mL 水溶解后干燥，最后蒸干，精密加入pH 2.2 的檸檬酸鈉緩沖液1 mL，振搖溶解，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

圖1 各因素響應(yīng)面圖

圖2 水蛭燙制前后形態(tài)

將對(duì)照品、供試品溶液注入氨基酸分析儀中，外標(biāo)法計(jì)算含有量，結(jié)果見表4。由此可知，燙制品中氨基酸平均總量為51.71%，含全部16 種氨基酸，以谷氨酸含有量最高，達(dá)8.61 mg/100 mg，占氨基酸總量的16.7%；含有蘇氨酸等7 種人體必需氨基酸，總量為18.4 mg/100 mg，占氨基酸總量的35.6%。

表4 各氨基酸含有量測(cè)定結(jié)果（n=2）

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法，選擇燙制溫度、燙制時(shí)間、滑石粉用量3 個(gè)關(guān)鍵參數(shù)，對(duì)水蛭滑石粉燙制工藝進(jìn)行優(yōu)化，可為其炮制規(guī)范的制定提供合理依據(jù)?？傇u(píng)“歸一值”是多指標(biāo)數(shù)據(jù)處理的一種較科學(xué)的方法，能客觀量化地體現(xiàn)所有指標(biāo)，從而使模型具有更好的預(yù)測(cè)性［17］，本實(shí)驗(yàn)將燙制工藝中的粉碎率、醇溶性浸出物、抗凝血酶活性等指標(biāo)綜合起來，以該方法來表達(dá)最終效應(yīng)，所得結(jié)果更科學(xué)合理。

生水蛭質(zhì)韌難碎，氣味腥臭，嚴(yán)重影響其直接使用，故自古就對(duì)其進(jìn)行加熱處理，其中滑石粉燙是最主流的炮制方法，其目的主要有去腥矯味、使藥材質(zhì)地酥脆、利于粉碎、降低毒性等［2］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，滑石粉燙制后水蛭含水量下降，質(zhì)地松泡，腥臭味明顯下降，有利于臨床應(yīng)用。