李 杰，尚孟文，李婼楠，吳艷芳

（河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院，河南 洛陽 471023）

黃芩為唇形科植物黃芩Scutellaria baicalensisGeorgi 的干燥根，其味苦，性寒，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血等功效，主要活性成分是以黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素為代表的黃酮類物質(zhì)，有著抗氧化、抗腫瘤、抗纖維化等多種生物活性［1］。目前，用于提取黃芩中上述黃酮的溶劑主要有水［2］、甲醇［3］、乙醇［4］、離子液體［5］，其中水提符合中藥傳統(tǒng)使用方法，其廉價易得、無毒、無污染，但產(chǎn)物得率低，能耗高，會造成資源浪費(fèi)，故建立一種環(huán)保、高效、簡便的提取工藝具有一定現(xiàn)實意義。

水熱法提取具有綠色環(huán)保、操作簡便等優(yōu)點，該方法主要是利用一定的水熱溫度和壓力來使植物細(xì)胞壁裂解或水解，減小溶劑滲透、擴(kuò)散到細(xì)胞內(nèi)部的阻力，從而使細(xì)胞內(nèi)的天然產(chǎn)物活性組分能高效、快速的溶出。王星敏等［6］應(yīng)用水熱法提取桑葉中異槲皮苷，發(fā)現(xiàn)它可加快木脂素中苯丙基C-O-C、C＝C 結(jié)構(gòu)的分解，提高了該成分得率；Sato 等［7］將其應(yīng)用于咖啡生豆中抗氧化物質(zhì)的提取，發(fā)現(xiàn)提取液可用于保健品、運(yùn)動飲料；Gao 等［8］通過上述方法提取種茶108 中的多糖，發(fā)現(xiàn)它不會影響該成分生物活性，另外該技術(shù)還可用于β-葡聚糖［9］、蘋果酸［10］、半纖維素［11］等天然活性物質(zhì)的提取，顯示出廣闊的應(yīng)用前景。但目前關(guān)于水熱法在中藥材活性物質(zhì)提取方面的研究還鮮見報道，故本實驗采用該方法提取黃芩中黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素3 種黃酮類物質(zhì)，并對其進(jìn)行優(yōu)化，以期為其他中藥材有效成分的提取提供新思路。

1 材料

LC2000 液相色譜儀（上海天美科學(xué)儀器有限公司）；ELx800 酶標(biāo)儀（美國伯騰儀器有限公司）；BT125D 雙量程電子分析天平（德國賽多利斯公司）；KQ2200D 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；CT14RD 高速離心機(jī)（上海天美生化儀器設(shè)備有限公司）；聚四氟乙烯內(nèi)襯、不銹鋼反應(yīng)釜（鄭州博科儀器設(shè)備有限公司）；PHG9246A 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）。黃芩（洛陽同仁堂藥店）經(jīng)河南科技大學(xué)李艷教授鑒定為唇形科植物黃芩Scutellaria baicalensisGeorgi 的干燥根。黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素對照品（國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心）；甲醇、乙腈、磷酸均為色譜純（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；水為純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Kromasil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相甲醇-水-磷酸（47∶53∶0.2）；體積流量1.0 mL/min；柱溫室溫；檢測波長275 nm；進(jìn)樣量20 μL。

2.2 對照品溶液制備 精密稱取黃芩苷、漢黃芩苷對照品6.0 mg，黃芩素對照品5.0 mg，置于10 mL 量瓶中，50%甲醇溶解，分別移取5、2.5、2.5 mL 至25 mL 量瓶中，50%甲醇定容，得到貯備液，精密吸取1.0、1.5、2、2.5、3 mL 于10 mL 量瓶中，50%甲醇定容，0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.3 供試品溶液制備 取藥材粉末1.0 g（過60 目篩）、純凈水40 mL，一同置于聚四氟乙烯內(nèi)襯的反應(yīng)釜內(nèi)，攪拌均勻后密封，在110 ℃下提取15 min，取出，自然冷卻至室溫，移取提取液2 mL 至離心管中，10 000 r/min 離心5 min，取1 mL 上清液于100 mL 量瓶中，50% 甲醇定容，0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.4 線性關(guān)系考察 取對照品溶液適量，在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系

2.5 專屬性試驗 取對照品、供試品溶液適量，在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖1。由此可知，2種溶液中各成分在相同保留時間處均有吸收，分離度大于1.5，理論塔板數(shù)大于6 000，峰形對稱，雜質(zhì)峰對檢測無干擾，表明該方法專屬性良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖

2.6 方法學(xué)考察 取對照品溶液適量，在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定5 次，測得黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素峰面積RSD 分別為1.22%、0.96%、1.31%，表明儀器精密度良好。取供試品溶液適量，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，測得3 種黃酮峰面積RSD分別為1.09%、1.12%、1.26%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。平行制備5 份供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，測得3 種黃酮含有量RSD 分別為2.04%、1.83%、1.74%，表明該方法重復(fù)性良好。同時，3 種黃酮平均加樣回收率分別為99.5%、103.1%、98.3%，RSD 分別為2.1%、2.9%、3.6%。

2.7 總得率測定 按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.4”項下方法計算3 種黃酮含有量，測定總得率Y，公式為Y＝（C1+C2+C3）×V×N/（M×1 000），其中C1、C2、C3分別為黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素含有量（μg/mL），V為提取溶劑體積（mL），N為稀釋倍數(shù)（倍），M為藥材質(zhì)量（g）。

2.8 單因素試驗

2.8.1 液料比 固定提取溫度110 ℃、提取時間15 min，考察液料比對3 種黃酮總得率的影響，結(jié)果見圖2。由此可知，總得率隨液料比增加而逐漸升高，在40∶1 時達(dá)到最大值，這是因為液料比增加在一定程度上提高了提取體系內(nèi)的壓力與固液之間的接觸面積，并且壓力升高有利于植物細(xì)胞壁破碎［12］，而且接觸面積增加可擴(kuò)大固液間黃酮濃度差［13］，兩者協(xié)同作用使黃酮能夠快速溶出，從而提高提取效率；超過40∶1 時總得率趨于穩(wěn)定，但提取液中黃酮含有量反而降低，導(dǎo)致后續(xù)純化、濃縮成本增加。因此，選擇液料比為40∶1。

圖2 料液比對3 種黃酮總得率的影響

2.8.2 提取時間 固定提取溫度110 ℃、液料比40∶1，考察提取時間對3 種黃酮總得率的影響，結(jié)果見圖3。由此可知，提取時間超過15 min 后總得率開始降低，這是因為在水熱提取過程中纖維素、半纖維素的長鏈分子轉(zhuǎn)化為可溶性的低聚糖、單糖等小分子，木脂素轉(zhuǎn)化為較低分子的酚類單體或多聚體［6］，從而使植物細(xì)胞壁遭到破壞，有利于降低水分子進(jìn)出細(xì)胞的阻力，促進(jìn)黃酮溶出而提高其得率；但提取時間過長會導(dǎo)致黃酮結(jié)構(gòu)發(fā)生變化或分解［14］，導(dǎo)致其得率反而降低。因此，選擇提取時間為15 min。

圖3 提取時間對3 種黃酮總得率的影響

2.8.3 提取溫度 固定液料比40∶1、提取時間15 min，考察提取溫度對3 種黃酮總得率的影響，結(jié)果見圖4。由此可知，隨著提取溫度增加總得率升高，在110 ℃時達(dá)到最大值，這是因為在此溫度下水由常態(tài)轉(zhuǎn)化為亞臨界態(tài)，其理化性質(zhì)發(fā)生了突變，如水分子極性和水分子簇變小、介電常數(shù)降低等，有利于提高黃酮在水中的溶解性和水分子進(jìn)出細(xì)胞的交換速率［15］，同時溫度升高也可使提取體系內(nèi)的自生壓力增加，有助于細(xì)胞壁破裂、黃酮溶出；但超過110 ℃時總得率反而降低，可能是由于溫度過高導(dǎo)致溶出的黃酮分解。因此，選擇提取溫度為110 ℃。

圖4 提取溫度對3 種黃酮總得率的影響

2.9 響應(yīng)面法 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以液料比（A）、提取時間（B）、提取溫度（C）為影響因素，3 種黃酮總得率（Y）為評價指標(biāo)，通過Design-Expert 8.0.6.1 軟件設(shè)計三因素五水平試驗，優(yōu)化水熱法提取工藝。因素水平見表2，結(jié)果見表3。

表2 因素水平

表3 試驗設(shè)計與結(jié)果

通過Design-Expert 8.0.6.1 軟件對表3 數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到二元多項回歸方程為Y＝163.10+5.39A-4.71B+9.808C+21.24AB-8.39AC+5.14BC-24.23A2-20.06B2-16.52C2，方差分析見表4。由此可知，模型具有高度顯著性（P＜0.000 1）；失擬項F值為3.32，P＝0.107 2＞0.05，表明模型可較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系；決定系數(shù)R2、校正系數(shù)分別為0.983 8、0.969 2，表明模型擬合度良好，可信度較高，可用于分析預(yù)測［16］；變異系數(shù)為4.92%，表明模型具有理想的精密度和可靠性［17］；各因素及其二次項、交互項均有顯著影響（P＜0.05），表明它們之間不是簡單的線性關(guān)系，影響程度依次為C（提取溫度）＞A（液料比）＞B（提取時間）。

表4 方差分析

由響應(yīng)面分析可知AB交互效應(yīng)最顯著，其次是AC，BC最弱，與表4 結(jié)果吻合，同時隨著各因素的增加，相應(yīng)響應(yīng)值先升后降。通過Design Expert 8.0.6.1 軟件進(jìn)行分析，得到最優(yōu)條件為液料比40.35∶1，提取時間14.68 min，提取溫度112.79 ℃，總得率165 mg/g。

為了方便操作，將優(yōu)化工藝修正為提取溫度113 ℃，提取時間15 min，液料比40∶1，同時與文獻(xiàn)［18］報道的最優(yōu)水煎煮工藝（提取時間50 min，液料比25∶1，提取次數(shù)2 次）進(jìn)行比較，結(jié)果見表5。由此可知，本實驗所得工藝穩(wěn)定可靠，而且水熱法提取效果優(yōu)于水煎煮法，可能是由于水熱法是在較高溫度、壓力下進(jìn)行的，可使植物細(xì)胞壁被充分破壞，減小了黃酮溶出阻力，從而使其得率增加。

響應(yīng)面分析見圖5。

表5 驗證試驗結(jié)果（n=3）

3 討論與結(jié)論

圖5 各因素響應(yīng)面圖

目前，提取黃芩中黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素的常用溶劑主要為水、甲醇、乙醇、離子液體，其中水提存在時間長、得率低、能耗高等不足；甲醇提取有一定的毒性，與中藥綠色環(huán)保的理念相悖；乙醇提取雖然無毒，但其回收需蒸餾、分餾等操作，后處理較為繁瑣；離子液體提取制備過程繁瑣，成本高，難于工業(yè)化生產(chǎn)。鑒于此，本實驗對水熱法提取黃芩中上述3 種黃酮的可行性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)該方法提取效果較理想，通過響應(yīng)面法優(yōu)化得到最優(yōu)工藝為液料比40∶1，提取時間15 min，提取溫度113 ℃，3 種黃酮總得率為161 mg/g，與預(yù)測值165 mg/g接近，表明該方法合理可靠，可有效減少操作隨機(jī)性和盲目性。