劉 蕊 ，趙新悅，毛雯雯，王亞冬，馮 紅，張東浩，張?zhí)m蘭*

（1.河北大學藥學院，河北 保定 071028；2.數(shù)字本草檢測科技有限公司，天津 300400）

隨著中醫(yī)藥的發(fā)展，中藥材的安全問題也越來越被人們關注。對于部分種子類、果實類、動物類及少數(shù)根莖類藥材，由于在加工、貯藏過程中易產(chǎn)生霉變，極易被黃曲霉毒素污染。2010 年版《中國藥典》規(guī)定了酸棗仁、僵蠶、胖大海、陳皮、桃仁共5 種藥材黃曲霉毒素的限度標準；2015 年版《中國藥典》，進一步對決明子、遠志等14 種易受黃曲霉毒素污染的藥材和飲片增加了檢查項目和限度標準。隨著國家標準對安全指標控制的加強，黃曲霉毒素的檢測方法得到了廣泛研究［1-7］。

2015 年版《中國藥典》共收錄2 種黃曲霉毒素測定方法，一種為高效液相色譜-柱后衍生法，采用熒光檢測器；當測定結果超出限度時，需采用第二種，即高效液相色譜串聯(lián)質譜方法進行確認［8］。這2 種檢測方法具有特異性強、定量準確等優(yōu)點，但所需儀器昂貴、樣品處理過程繁瑣、試劑及對照品毒性強、污染大，并且需要專業(yè)的技術人員才能實現(xiàn)檢測。對于中藥材的采收、加工、流通、倉儲等環(huán)節(jié)，無法滿足快速檢測的需求。因此需要開發(fā)簡單、便捷、即時、準確、高效、節(jié)能的快速檢測技術方法用于中藥材安全控制。

ELISA 快速檢測方法即將黃曲霉毒素的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使酶標記的抗原抗體反應在固相表面進行的技術。該方法具有操作簡單、費用少、樣品量少等優(yōu)點，已在食品、飼料檢測中廣泛應用。王彤穎等［9］利用ELISA 法測定金銀花、胖大海、遠志的黃曲霉毒素B1 的含有量，其檢測結果與HPLC 檢測結果基本一致。林方芬等［2］通過ELISA 檢測方法檢測30 種中藥飲片中黃曲霉素B1的含有量。雖然黃曲霉毒素B1 有少量ELISA 檢測方法報道，但尚未見黃曲霉毒素總量ELISA 檢測方法的研究報道。

本研究建立中藥材的黃曲霉毒素總量ELISA檢測方法并對麥芽、酸棗仁、柏子仁、桃仁、遠志、決明子等6 種中藥材黃曲霉毒素總量的前處理方法進行探討，以期ELISA 檢測方法能夠運用到更多中藥材的黃曲霉毒素檢測中。

1 材料

EPOCH 型酶標儀（美國博騰公司）；U3000 型高效液相色譜儀、U3000 型熒光檢測器（美國賽默飛世爾公司）。黃曲霉毒素總量抗原（深圳冪次方生物科技有限公司）；黃曲霉毒素總量抗體（哈爾濱進萬康生物科技有限公司）；黃曲霉毒素總量對照品（青島普瑞邦生物工程有限公司）；山羊抗小鼠IgG-HRP（北京康為世紀生物科技有限公司）；TMB（北京索萊寶科技有限公司）；黃曲霉毒素總量免疫親和柱（青島普瑞邦生物工程有限公司）。甲醇（天津康科德化學試劑公司）；磷酸鹽緩沖液（PBS）、碳酸鹽緩沖液（CBS）（實驗室自制）；水為超純水。

酸棗仁、桃仁、麥芽、遠志、決明子、柏子仁樣品，均購買自河北安國市場，經(jīng)數(shù)字本草檢測科技有限公司張?zhí)m蘭研究員鑒定為正品。

2 方法

2.1 間接競爭ELISA 方法建立 參考文獻［10］方法，用CBS 將抗原1∶8 000 稀釋，每孔100 μL包被在聚苯乙烯酶標板上，37 ℃孵育2 h，用PBST 洗板5 次；以每孔100 μL 0.5% 脫脂奶粉37 ℃封閉1 h，用PBST 洗板3 次；每孔依次加入40 μL 經(jīng)PBS 稀釋的不同濃度的黃曲霉毒素總量（AFs）對照品溶液和60 μL 適當濃度的酶標抗原，37 ℃孵育1 h，用PBST 洗滌3 次；以每孔100 μL加入山羊抗小鼠IgG-HRP（用PBS 1∶10 000 稀釋），37 ℃孵育1 h，PBST 洗板3 次；每孔加入100 μL TMB 溶液，37 ℃孵育30 min，用酶標儀測定450 nm 吸光值，建立間接競爭酶免疫分析法。抑制率＝（A陽性對照孔-A陰性對照孔/A陽性對照孔）×100%。

2.2 間接競爭ELISA 方法學考察

2.2.1 ELISA 條件優(yōu)化 包被液選擇，CBS、PBS、Tris-HCl、醋酸鹽緩沖液稀釋包被原進行抑制實驗；封閉液選擇，選擇1% BSA、0.5%脫脂奶粉、1%酪蛋白作為封閉液進行封閉，進行抑制實驗；包被方式優(yōu)化，分別選擇37 ℃孵育1、2、3 h和4 ℃過夜方式作為包被方式，進行抑制實驗；競爭反應時間選擇，分別選擇競爭時間為30 min、1 h、2 h 做為競爭反應時間，進行抑制性實驗；顯色時間選擇，分別選擇顯色時間為10、20、30、40 min 為顯色反應時間，進行抑制性實驗；離子強度選擇，分別制備含有 0.1、0.05、0.01、0.005 mol/L PBS，調(diào)pH 至7.4，以此稀釋黃曲霉毒素總量對照品溶液和抗體進行抑制實驗。

2.2.2 線性關系考察 以PBS 配制200 ng/L 黃曲霉毒素總量為母液，2 倍逐級稀釋到6.25 ng/L，以黃曲霉毒素總量質量濃度對數(shù)值為橫坐標（X），抑制率為縱坐標（Y）進行回歸。

2.2.3 精密度試驗 制備100、80、60、40、20、10 ng/L 黃曲霉毒素總量對照品溶液，間接競爭ELISA 方法檢測其抑制率，每個孔3 個平行，比較每孔差異，計算RSD 值。連續(xù)3 d 檢測6 個質量濃度的抑制率，比較每孔差異，計算RSD 值。

2.2.4 特異性試驗 將不同濃度的嘔吐毒素、赭曲霉毒素A、伏馬菌素B1、玉米赤霉烯酮用PBS稀釋到不同質量濃度用于替代黃曲霉毒素總量對照品溶液，應用間接ELISA 法測定其線性關系，計算出50%抑制濃度（IC50），并計算交叉反應率。

2.2.5 樣品處理

2.2.5.1 麥芽 稱取1 g 麥芽樣品，于5 mL 70%甲醇溶液中，超聲5 min，離心（5 000 r/min）5 min，濾過，吸取1 mL 續(xù)濾液溶于9 mL PBS 中，混勻。

1）建立健全節(jié)能管理組織機構。集團公司成立了以董事長為組長的節(jié)能減排低碳領導小組，設立節(jié)能減排辦公室作為節(jié)能工作的日常管理機構，要求凡是年綜合能源消費量1×104t標準煤以上的用能單位須按規(guī)定設置專職節(jié)能管理人員。各所屬單位建立了從公司到班組的三級網(wǎng)絡，形成了縱向到底、橫向到邊、上下聯(lián)動的管理體制。

2.2.5.2 酸棗仁、柏子仁、桃仁 稱取1 g 酸棗仁、柏子仁、桃仁樣品，于12 mL 70% 甲醇溶液中，超聲5 min，離心（5 000 r/min）5 min，濾過，取上清400 μL 于蒸發(fā)皿中，置水浴上揮干，再加4 mL 水復溶，得樣品檢測液。

2.2.5.3 遠志、決明子 稱取1 g 未檢測出黃曲霉毒素總量的遠志、決明子樣品，于12 mL 70%甲醇溶液中，超聲5 min，離心（5 000 r/min）5 min，濾過，取3 mL 過免疫親和柱，3 mL 上樣，3 mL 水洗，1 mL 甲醇洗脫。取100 μL 洗脫液揮干，加5 mL水中復溶，得樣品液。

2.2.6 加樣回收率試驗 分別空白樣品基質中，添加黃曲霉毒素總量對照品溶液，制成含黃曲霉毒素4、2、1 ng/g 的樣品，用優(yōu)化后的ELISA 方法進行檢測。

2.3 ELISA 檢測結果與HPLC 法比較

2.3.1 樣品制備 ELISA 方法供試品溶液按“2.2.5”項下方法制備；HPLC 法供試品溶液制備參考2015 年版《中國藥典》方法。

2.3.2 檢測方法 ELISA 方法為“2.2.1”項下優(yōu)化后的檢測方法，計算其抑制率代入回歸方程，計算黃曲霉毒素總量殘留量。HPLC 方法參照文獻［11］方法，色譜條件稍有改動，C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；FLD 熒光檢測器，激發(fā)波長360 nm，發(fā)射波長440 nm；流動相甲醇-水（45∶55）；體積流量1.0 mL/min；柱溫45 ℃；進樣量20 μL。

3 結果與分析

3.1 ELISA 方法優(yōu)化 在其他條件一致的情況下，通過改變反應體系中某一條件，如包被溫度、離子強度、pH 等，采用間接競爭ELISA 方法，測定標準曲線并比較IC50值、A0值，優(yōu)化后的結果見表1。根據(jù)優(yōu)化后的條件，黃曲霉毒素總量回歸方程為Y＝22.603 ln（X）-22.606，r＝0.9902，在6.25～100 ng/L范圍內(nèi)線性關系良好；以抑制率達到50%的所對應的黃曲霉毒素總量值為靈敏度，靈敏度為24.83 ng/L，以抑制率達到10%的所對應的黃曲霉毒素總量值為檢出限，檢出限為4.23 ng/L。

表1 間接競爭ELISA 測定黃曲霉毒素總量的優(yōu)化條件Tab.1 Optimization conditions for determination of total aflatoxin by indirect competition ELISA

3.2 精密度試驗 板內(nèi)6 個濃度的RSD 為1.2%～7.0%。板間變異系數(shù)RSD 為4.1%～11.8%?？梢钥闯?0 ng/L 的標準點波動較大，可能是由于該點接近標準曲線的檢測下限，但這種波動并不影響標準曲線穩(wěn)定性。一般試劑盒的批間檢測變異系數(shù)在5%～15%是可以接受的，即儀器精密度良好。

3.3 特異性試驗 由表2 可知，AFB1 與AFB2、AFG1、AFG2 的交叉反應率在40% 以上，因此該方法為檢測黃曲霉毒素總量的方法，玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、嘔吐毒素、伏馬毒素B 交叉反應率小于0.01%，表明該抗體特異性好。

表2 不同結構類似物交叉反應結果Tab.2 Results of Cross-reaction with other mycotoxins

3.4 樣品處理 本研究以樣品空白提取液和0.05 MPBS 溶液作為標準品系數(shù)溶液繪制標準曲線，對不同樣品基質對標準曲線的影響進行考察，圖1 顯示，按“2.2.5”項下處理的方法與PBS 稀釋標準曲線基本一致。麥芽、酸棗仁、柏子仁、桃仁4 種中藥材通過樣品稀釋可消除基質效應，但遠志和決明子藥材經(jīng)過甲醇提取后色素較重，對黃曲霉毒素總量標準曲線干擾較大，提取液經(jīng)免疫親和柱凈化后，消除了色素影響。酸棗仁、柏子仁、桃仁按麥芽方法處理后也出現(xiàn)對標準曲線干擾的現(xiàn)象，加大稀釋倍數(shù)后，消除了這3 種藥材基質對黃曲霉毒素總量標準曲線的干擾，見圖2。

圖1 樣品與PBS 標準曲線Fig.1 Standard curve of samples and PBS

圖2 麥芽處理法樣品與PBS 標準曲線Fig.2 Standard curve of Hordei Fructus Germinatustreated samples and PBS

3.5 加樣回收率試驗 6 種藥材黃曲霉毒素的加樣回收率結果見表3，其中麥芽的檢出限為0.2 μg/kg，桃仁、酸棗仁、柏子仁的檢出限為0.5 μg/kg，決明子、遠志的檢出限為0.8 μg/kg。這6 種藥材的平均加樣回收率為94.5%～109.5%。

表3 各成分加樣回收率試驗結果（n=3）Tab.3 Results of recovery tests for various constituents（n=3）

3.6 ELISA 檢測結果與HPLC 法比較 收集麥芽13 批，酸棗仁10 批，柏子仁、決明子各7 批，桃仁8 批，遠志15 批，共計60 批，同時用ELISA 方法和HPLC 法檢測黃曲霉毒素。檢測結果見表4，偏差在1 ng/g以上的有3 個，分別為b002、y001、y003。產(chǎn)生偏差的原因可能是樣品的黃曲霉毒素含有量已經(jīng)超過本研究建立的標準曲線范圍。但通過皮爾森相關系數(shù)計算間接ELISA 與HPLC 結果的匹配度為0.998，表明本研究建立的間接ELISA 法測定結果與HPLC 法一致。60 種中藥材中檢出率最高的為柏子仁，檢出率為100%，酸棗仁、桃仁次之，檢出率均為50%。

表4 60 批樣品2 種方法檢測結果（ng/g，，n=3）Tab.4 Results of sixty batches of samples by two methods（ng/g，，n=3）

表4 60 批樣品2 種方法檢測結果（ng/g，，n=3）Tab.4 Results of sixty batches of samples by two methods（ng/g，，n=3）

注：“-”表示未檢出。

4 討論

隨著免疫分析方法的發(fā)展，ELISA 在中藥材檢測方面得到廣泛研究［12］。本實驗通過優(yōu)化封閉液、包被液、包被方式、競爭反應時間、顯色時間、離子強度因素，建立間接競爭ELISA 法并完成其方法學研究。該方法檢測結果與HPLC 法相吻合。

對數(shù)字本草檢測科技有限公司2017 至2019 年上半年接檢黃曲霉毒素殘留量測定樣品及文獻［11-14］報道分析，選擇檢出率最高的6 種中藥材進行ELISA 快速檢測方法的摸索。由于6 種中藥材的作用基質不同，因此采用了不同的處理方法消除基質對ELISA 方法的影響。

麥芽的基質影響較小，通過甲醇溶液提取、離心、PBS 稀釋即可消除。酸棗仁、桃仁、柏子仁基質的影響次之，通過蒸干甲醇提取液，除掉有機溶劑，再用水復溶的方式可消除。決明子、遠志由于甲醇溶液提取后，色素較重，僅用蒸干甲醇提取液的方式不能消除基質的影響，因此采用免疫親和柱進行基質凈化。出現(xiàn)不同品種用不同提取方式提取的原因可能為ELISA 法在競爭反應階段由于中藥材基質不同影響了樣品和競爭抗原的競爭；中藥材經(jīng)甲醇溶液提取后，提取顏色不一，在競爭反應階段部分色素聚集到酶標板上，影響了最終的顯色反應。

綜上，本研究建立了6 種中藥材黃曲霉毒素總量間接ELISA 法，該方法與HPLC 法相比具有樣品前處理簡單、樣品量少、檢測時間快、經(jīng)濟無污染等特點［15］。本研究建立《中國藥典》中規(guī)定的6種中藥材黃曲霉毒素快速檢測試方法，簡化了中藥材黃曲霉毒素檢測過程，降低了檢測成本，提高了檢測效率；同時為中藥材黃曲霉毒素檢測提供了新方法，以期為中藥材快速檢測提供新思路，由此可以開發(fā)出更多的中藥材快速檢測產(chǎn)品，滿足中藥材多元化檢測需求。