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        UPLC-FLD 法同時(shí)測(cè)定不同產(chǎn)地白芷中5 種香豆素

        2020-10-14 08:11:06李月婷趙淑軍肖紅斌
        中成藥 2020年9期

        李 乾,劉 潔,李月婷,陽 嬌,趙淑軍,肖紅斌,3*

        (1.石河子大學(xué)藥學(xué)院,新疆 石河子 832002;2.北京中醫(yī)藥大學(xué),中藥分析與轉(zhuǎn)化研究中心,北京 100029;3.北京中醫(yī)藥大學(xué)北京中醫(yī)藥研究院,北京 100029;4.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院,北京 100029)

        白芷為傘形科植物植物白芷Angelica dahurica(Fisch.ExHoffm.)Benth.et Hook.f.或杭白芷Angelica dahurica(Fisch.Ex Hoffm.)Benth.et Hook.f.var.formosana(Boiss.)Shan et Yuan 的干燥根,味辛、性溫,歸胃、大腸、肺經(jīng),具有發(fā)散風(fēng)寒、通竅止痛、燥濕止帶、消腫排膿等功效,臨床常用于治療陽明頭痛、眉棱骨痛、鼻淵頭痛、牙痛、風(fēng)寒濕痹、瘡瘍腫毒等病癥[1]。白芷含有的化學(xué)成分主要有香豆素類、揮發(fā)油類、多糖類、甾醇類及生物堿等[2-4]。文獻(xiàn)報(bào)道其有效成分主要為歐前胡素、異歐前胡素等香豆素類[5-7]。2015 年版《中國(guó)藥典》一部以歐前胡素為指標(biāo)成分來評(píng)價(jià)白芷質(zhì)量,歐前胡素的總量不得低于0.080%[1]。近年來有文獻(xiàn)表明歐前胡素、異歐前胡素、佛手柑內(nèi)酯、水合氧化前胡素能夠進(jìn)入血液及腦脊液[8-9]且佛手柑內(nèi)酯[10-12]、氧化前胡素[13-14]均有明顯的抗炎抗腫瘤作用。因此,僅以歐前胡素作為評(píng)價(jià)指標(biāo),不能全面地評(píng)價(jià)白芷的質(zhì)量。

        HPLC 法是目前測(cè)定白芷中香豆素含有量的主要方法[15],也有超臨界流體色譜法[16]、近紅外光譜法[17]、LC-MS 法[18]等。白芷中的水合氧化前胡素、佛手柑內(nèi)酯、氧化前胡素、歐前胡素、異歐前胡素,具有苯環(huán)(π*-π*)結(jié)構(gòu)特征,其有較強(qiáng)的熒光吸收。熒光分析方法具有選擇性好,靈敏度高等特點(diǎn),比紫外-可見分光光度法低3 個(gè)數(shù)量級(jí)以上。通過文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn),相比于紫外檢測(cè)器,熒光檢測(cè)器有更好的選擇性[19];相比于三重串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜,熒光檢測(cè)器花費(fèi)更少[8]。此外,鑒于傳統(tǒng)HPLC 方法測(cè)定白芷中香豆素類成分含有量耗時(shí)長(zhǎng),同時(shí)存在干擾峰的問題。因此,本研究以期開發(fā)保留時(shí)間更短、特異性和選擇性更好的UPLC-FLD 測(cè)定方法,對(duì)白芷中5 種香豆素類成分同時(shí)測(cè)定,并對(duì)21 批不同產(chǎn)地白芷中5 種成分進(jìn)行含有量測(cè)定,以期更準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)白芷藥材的質(zhì)量。

        1 材料

        1.1 儀器 Agilent 1290 超高效液相色譜儀、Agilent 1260 G1321B 熒光檢測(cè)器(美國(guó)Agilent 公司);Milli-Q 超純水制備儀(德國(guó)Millipore 公司);AT201 型電子天平(1/10 萬,瑞士Mettler Toledo 公司);KQ-500E 型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

        1.2 試劑與藥物 對(duì)照品歐前胡素(O-001-170526)、異歐前胡素(Y-007-170426)、水合氧化前胡素(S-128-170426)、氧化前胡素(Y-151-180713)、佛手柑內(nèi)酯(F-008-170426)均購于成都瑞芬思生物科技有限公司,純度均大于98%。乙腈(色譜純,美國(guó)Fisher 公司);甲酸(色譜純,美國(guó)Sigma 公司)。

        1.3 樣品 白芷藥材購買于河北安國(guó)藥材市場(chǎng)和安徽亳州藥材市場(chǎng),信息見表1,經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)王學(xué)勇教授鑒定為正品,憑證樣本留樣存放于北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥分析與轉(zhuǎn)化研究中心。

        表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

        2 方法與結(jié)果

        2.1 色譜條件 Agilent ZORBAX ECLIPSE Plus C18柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm);流動(dòng)相0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B),梯度洗脫(0~2 min,10%~38% B,2~7 min,38%~39% B,7~9 min,39%~40% B,9~10 min,40%~55% B,10~14 min,55%~70%B,14~15 min,100% B);體積流量0.4 mL/min;柱溫35 ℃;進(jìn)樣量5 μL。色譜圖見圖1。

        圖1 各成分熒光色譜圖Fig.1 Fluorescence chromatograms of various constituents

        2.2 對(duì)照品溶液制備 取對(duì)照品水合氧化前胡素、佛手柑內(nèi)酯、氧化前胡素、歐前胡素、異歐前胡素適量,精密稱定,加甲醇溶解并定容,制備成水合氧化前胡素、佛手柑內(nèi)酯、氧化前胡素、歐前胡素、異歐前胡素質(zhì)量濃度分別為20、20、200、200、100 μg/mL 的混合對(duì)照品溶液,4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

        2.3 供試品溶液制備 精密稱取白芷粉末(過5 號(hào)篩)約1 g,置具塞錐形瓶中,精密加入甲醇25 mL,稱定質(zhì)量,超聲(120 W,40 kHz)提取1 h,放冷。再次稱定質(zhì)量,用甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量。搖勻,靜置后取上清液,濾過,取續(xù)濾液即得。

        2.4 最佳波長(zhǎng)確定 將“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液,在“2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣2 針,分別獲取各化合物的激發(fā)波長(zhǎng)(Ex)及發(fā)射波長(zhǎng)(Em)曲線。獲取Ex 曲線時(shí),先固定Em(如500 nm),將Ex 處設(shè)置為“zero order”,采集范圍設(shè)定為230~450 nm,掃描間隔為5 nm。獲取Em 曲線時(shí),先固定Ex(如250 nm),將Em 處設(shè)置為“zero order”,采集范圍設(shè)定為300~600 nm,間隔為5 nm。分別進(jìn)行數(shù)據(jù)采集,即得。

        2.5 方法學(xué)考察

        2.5.1 線性關(guān)系考察 分別精密量取制備好的混合對(duì)照品貯備液,采用逐級(jí)稀釋的方法,即得不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液。在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣,以峰面積為縱坐標(biāo)(Y),質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行回歸,結(jié)果見表2,可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

        表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

        2.5.2 定量下限 按10 倍信噪比計(jì)算,水合氧化前胡素、佛手柑內(nèi)酯、氧化前胡素、歐前胡素、異歐前胡素的定量下限分別為10、10、10、20、10 ng/mL。

        2.5.3 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液5 μL,在“2.1”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣7 針,水合氧化前胡素保留時(shí)間RSD 為0.06%,峰面積RSD 為0.92%;佛手柑內(nèi)酯保留時(shí)間RSD 為0.08%,峰面積RSD 為0.80%;氧化前胡素保留時(shí)間RSD 為0.08%,峰面積RSD 為0.83%;歐前胡素保留時(shí)間RSD 為0.03%,峰面積RSD 為0.87%;異歐前胡素保留時(shí)間RSD 為0.03%,峰面積RSD 為0.96%,表明儀器精密度良好。

        2.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液,在“2.1”項(xiàng)色譜條件下,分別于0、4、8、12、24 h進(jìn)樣5 μL,測(cè)定水合氧化前胡素、佛手柑內(nèi)酯、氧化前胡素、歐前胡素、異歐前胡素的峰面積,其中RSD 分別為0.77%、0.76%、0.35%、0.70%、0.33%,表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

        2.5.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品6 份,按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,在“2.1”項(xiàng)色譜條件下分別進(jìn)樣。測(cè)得水合氧化前胡素、佛手柑內(nèi)酯、氧化前胡素、歐前胡素、異歐前胡素的平均含有量分別為0.36、0.35、3.76、2.84、1.08 mg/g,RSD 分別為2.56%、4.17%、1.81%、1.86%、1.02%,表明該方法重復(fù)性良好。

        2.5.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含有量的四川白芷粉末0.5 g,分別精密加入混合對(duì)照品溶液1 mL,按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,在“2.1”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定,計(jì)算各成分回收率。結(jié)果見表3。

        2.6 樣品含有量測(cè)定 精密稱取不同產(chǎn)地21 批白芷粉末各1 g,按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,以外標(biāo)法計(jì)算水合氧化前胡素、佛手柑內(nèi)酯、氧化前胡素、歐前胡素、異歐前胡素的含有量,結(jié)果見表4。

        3 討論

        3.1 熒光檢測(cè)波長(zhǎng)確定 按“2.4”項(xiàng)下方法得水合氧化前胡素、佛手柑內(nèi)酯、氧化前胡素、歐前胡素、異歐前胡素的最大激發(fā)波長(zhǎng)區(qū)間分別為259~262、259~262、255~258、253~254、259~260 nm,最大發(fā)射波長(zhǎng)分別為494~498、495~500、486~490、484~487、484~487 nm。并以氧化前胡素為例展示其激發(fā)及發(fā)射波長(zhǎng)曲線。為確保5 種成分同時(shí)均有較強(qiáng)吸收,最終確定了熒光檢測(cè)器的Ex 為259 nm,Em 為490 nm。

        3.2 色譜條件優(yōu)化 在實(shí)驗(yàn)過程中,流動(dòng)相為純水-乙腈時(shí),出現(xiàn)了拖尾現(xiàn)象。加入0.1%甲酸后能夠有效改善峰拖尾現(xiàn)象。最后對(duì)梯度洗脫比例進(jìn)行了摸索,在保證R≥1.5 的前提下,使分析時(shí)間在15 min 內(nèi)達(dá)到全部分離。

        3.3 熒光檢測(cè)器與紫外檢測(cè)器比較 熒光分析方法的主要優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高,選擇性好,檢測(cè)限達(dá)10-10g/mL,相較紫外-可見分光光度法低3 個(gè)數(shù)量級(jí)以上。本研究發(fā)現(xiàn)白芷樣品的紫外色譜圖在峰1(水合氧化前胡素)和峰3(氧化前胡素)處有其他物質(zhì)干擾,而其熒光色譜圖不存在干擾峰,且熒光色譜峰基線平穩(wěn)。因此,本研究所建立的熒光檢測(cè)方法圖譜雜質(zhì)干擾少,選擇性強(qiáng),分離度好,靈敏度高。

        3.4 結(jié)果分析 2015 年版《中國(guó)藥典》一部以歐前胡素為指標(biāo)成分來評(píng)價(jià)白芷質(zhì)量,歐前胡素的總量不得低于0.080%[1]。本研究采用UPLC-FLD 法

        同時(shí)測(cè)定了不同地區(qū)共21 批樣品中5 種香豆素的含有量,結(jié)果表明安徽白芷中歐前胡素含有量最高,達(dá)到3.26 mg/g;而陜西商洛白芷中歐前胡素含有量最低,低至0.36 mg/g。此外,結(jié)果表明,浙江白芷中水合氧化前胡素和氧化前胡素含有量最高,分別為0.73、0.95 mg/g;而河北白芷中佛手柑內(nèi)酯和氧化前胡素含有量最高,分別為0.33、2.99 mg/g。

        表3 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Tab.3 Results of recovery tests for various constituents(n=6)

        表4 不同產(chǎn)地樣品中各成分含有量測(cè)定結(jié)果(mg/g)Tab.4 Results of content determination of various constituents in samples from different growing areas(mg/g)

        3.5 指標(biāo)性成分選擇 文獻(xiàn)報(bào)道水合氧化前胡素、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、異歐前胡素可吸收進(jìn)入血液[8],且水合氧化前胡素、佛手柑內(nèi)酯、異歐前胡素可透過血腦屏障到達(dá)腦組織[9];此外,課題組利用UPLC-FLD 檢測(cè)白芷入血成分時(shí)發(fā)現(xiàn)氧化前胡素也可吸收進(jìn)入血液,表明這5 種成分均直接影響著白芷的臨床療效。當(dāng)以5 種香豆素總含有量來評(píng)價(jià)白芷時(shí),大部分產(chǎn)地中5 種香豆素總含有量較高,但陜西及湖南產(chǎn)地總香豆素含有量較低,5 種香豆素總含有量小于2.0 mg/g。本研究所得香豆素總含有量較高的產(chǎn)地與文獻(xiàn)報(bào)道的白芷5 大產(chǎn)區(qū)河北(祁白芷)、河南(禹白芷)、四川(川白芷)、杭州(杭白芷)、安徽(亳白芷)相一致[20-21]。因此,建議將水合氧化前胡素、佛手柑內(nèi)酯、異歐前胡素、歐前胡素、氧化前胡素這5 種成分作為白芷質(zhì)量控制指標(biāo)成分。

        4 結(jié)論

        本研究建立的UPLC-FLD 法選擇性強(qiáng),靈敏度高,重現(xiàn)性好,對(duì)不同產(chǎn)地白芷中5 種香豆素的含有量進(jìn)行測(cè)定。該方法首次應(yīng)用于白芷藥材中香豆素含有量的檢測(cè),相較于紫外檢測(cè)器,熒光檢測(cè)器有其固有的特異性和選擇性。以期為白芷藥材的含有量測(cè)定提供一種新方法,也為中藥復(fù)雜體系及體內(nèi)香豆素類成分含有量測(cè)定提供參考。

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