程盛勇 ，付 洋，陳 慧，尹 航，劉興賦，羅喜榮*，楊 軍

（1.貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550004；3.中國科學(xué)院地球化學(xué)研究所，貴州 貴陽 550081）

蜘蛛香Valeriana jatamansiJones 又名養(yǎng)血蓮、臭藥、馬蹄香、鬼見愁等，為多年生草本植物，以干燥根莖和根入藥，具有理氣止痛、祛風(fēng)除濕、鎮(zhèn)驚安神、消食止瀉之功效［1-4］?，F(xiàn)代藥學(xué)研究表明蜘蛛香主含揮發(fā)油、纈草三酯類、黃酮類、酚酸類、生物堿、氨基酸、木酯素和多糖等成分，具有抗腫瘤、抗焦慮、神經(jīng)保護(hù)、保肝、抗氧化、抗菌、抗病毒等藥理作用，有良好的新藥開發(fā)潛力［3-11］。現(xiàn)行蜘蛛香質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)較簡單，其質(zhì)量控制主要是TLC 法鑒別纈草三酯和乙酰纈草三酯，尚無含有量測定項，藥材質(zhì)量控制及評價困難，亟待建立可靠的蜘蛛香質(zhì)量評價體系。中藥成分復(fù)雜，發(fā)揮療效的成分難以確定，開展指紋圖譜研究和多成分含有量測定并建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，是保障中藥質(zhì)量和療效一致性的有效方法［12］。課題組前期蜘蛛香指紋圖譜研究發(fā)現(xiàn)新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、橙皮苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、乙酰纈草三酯和纈草三酯可作為蜘蛛香的定性鑒別和質(zhì)量差異標(biāo)記物［13-14］，本實驗建立UPLC 法同時測定蜘蛛香中9 種成分的含有量，旨在為蜘蛛香的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)完善、臨床用藥及新藥開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1290 高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；BSA224S 型電子天平（德國賽多利斯公司）；KQ3200E 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；FW177 型中草藥粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥物 新綠原酸（MUST-15011412）、綠原酸（MUST-15041814）、咖啡酸（MUST-15090803）、異綠原酸B（MUST-15081411）、異綠原酸A（MUST-15042518）、異綠原酸C（MUST-15081414）對照品均購自成都曼思特生物科技有限公司；橙皮苷對照品（602F022）購自北京索萊寶科技有限公司；乙酰纈草三酯（wkq16072004）、纈草三酯（wkq16011203）對照品均購自四川維克奇生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%；乙腈、甲醇為色譜純；水為娃哈哈純凈水；其余試劑均為分析純。21 批蜘蛛香樣品來源信息見表1，經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)生藥學(xué)教研室覃容貴教授鑒定為敗醬科植物蜘蛛香Valeriana jatamansiJones 的干燥根莖及根。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Ultimate?UHPLC Polar-RP 色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動相乙腈（A）-0.1% 甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～6 min，12%～35% A；6～10 min，35%～50% A；10～11 min，50%～57% A；11～30 min，57% A）；體積流量0.21 mL/min；檢測波長327 nm（0～11 min），256 nm（11～30 min）；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量0.8 μL；色譜圖見圖1。

圖1 各成分UPLC 色譜圖Fig.1 UPLC chromatograms of various constituents

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取9 種成分對照品適量，用70%甲醇溶解分別制成各成分的對照品貯備液。精密量取上述9 種對照品貯備液，加70%甲醇溶解并稀釋成分別含60.00 μg/mL 新綠原酸、220.00 μg/mL 綠原酸、44.00 μg/mL 咖啡酸、380.00 μg/mL 橙皮苷、210.00 μg/mL 異綠原酸B、360.00 μg/mL 異綠原酸A、150.00 μg/mL 異綠原酸 C、169.20 μg/mL 乙酰纈草三酯、690.00 μg/mL 纈草三酯的混合對照品溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液 取蜘蛛香藥材打粉，過60 目篩，稱取粉末0.2 g，置棕色EP 管中，加入70%甲醇10 mL，稱定質(zhì)量，于37 ℃超聲（150 W，40 kHz）提取40 min，冷卻至室溫，稱定質(zhì)量，用70%甲醇補足減失質(zhì)量，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 取混合對照品溶液適量，70% 甲醇制成系列質(zhì)量濃度對照品溶液，在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣，記錄各成分峰面積。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），對應(yīng)的色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，結(jié)果見表2。表明各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.3.2 精密度試驗 精密吸取對照品溶液，在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣6 次，測得新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、橙皮苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、乙酰纈草三酯、纈草三酯峰面積RSD 分別為 1.84%、0.95%、1.32%、2.19%、1.26%、1.51%、1.24%、1.27%、0.63%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗 取貴州貴陽（S2）蜘蛛香藥材細(xì)粉6 份，按“2.2.2”項下方法平行制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下分別進(jìn)樣，測得新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、橙皮苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、乙酰纈草三酯、纈草三酯含有量RSD 分別為0%、0.49%、0%、1.35%、0.98%、0.18%、0.18%、0.20%、0.10%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗 精密吸取貴州貴陽（S2）供試品溶液，室溫放置0、3、6、9、12、24 h 后，在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣，測得新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、橙皮苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、乙酰纈草三酯、纈草三酯峰面積RSD 分別為 2.33%、1.17%、2.23%、1.35%、1.53%、0.80%、1.41%、1.56%、1.18%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗 精密稱取6 份已知測含有量的貴州貴陽（S2）蜘蛛香藥材粉末0.02 g，分別精密加入150.00 μg/mL 新綠原酸對照品溶液0.032 mL、220.00 μg/mL 綠原酸對照品溶液0.108 mL、220.00 μg/mL 咖啡酸對照品溶液0.003 mL、190.00 μg/mL 橙皮苷對照品溶液0.271 mL、210.00 μg/mL 異綠原酸B 對照品溶液0.020 mL、240.00 μg/mL 異綠原酸A 對照品溶液0.135 mL、200.00 μg/mL 異綠原酸C 對照品溶液0.080 mL、350.00 μg/mL 乙酰纈草三酯對照品溶液0.165 mL、230.00 μg/mL 纈草三酯對照品溶液0.902 mL，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下測定峰面積。計算各成分回收率，結(jié)果見表3。

2.4 樣品含有量測定 取表1 中21 批樣品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下測定峰面積，計算蜘蛛香中9 種指標(biāo)成分的含有量，結(jié)果見表4。

3 討論

纈草三酯類成分具有鎮(zhèn)靜催眠、抗焦慮、抗病毒、血管舒張等多種藥理作用，2015 年版《中國藥典》將纈草三酯和乙酰纈草三酯作為蜘蛛香藥材的質(zhì)量控制指標(biāo)；新綠原酸、綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C 等綠原酸類成分具有清除自由基、抗菌消炎、活血降壓等生物活性，是2015 年版《中國藥典》金銀花、山銀花、茵陳、菊花等許多中藥材和小兒咽扁顆粒、風(fēng)熱清口服液、全杜仲膠囊等多種成品藥質(zhì)量控制的重要指標(biāo)；咖啡酸具有抗菌、抗病毒等藥理作用，2015年版《中國藥典》將咖啡酸作為蒲公英、冬葵果的指標(biāo)成分；橙皮苷是蜘蛛香的主要成分之一，含有量高，穩(wěn)定性好，臨床上常作為治療高血壓的輔助藥和止血藥，其復(fù)合劑也用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和風(fēng)濕熱，2015 年版《中國藥典》將橙皮苷作為陳皮、青皮、橘紅等中藥材和陳丸、人參養(yǎng)榮丸等成方制劑的指標(biāo)成分。因此，本實驗選擇該9 種成分具有良好的代表性，可作為蜘蛛香藥材的質(zhì)量分析指標(biāo)。

表3 各成分加樣回收率試驗結(jié)果（，n=6）Tab.3 Results of recovery tests for various constituents（，n=6）

表3 各成分加樣回收率試驗結(jié)果（，n=6）Tab.3 Results of recovery tests for various constituents（，n=6）

表4 各成分含有量測定結(jié)果（%，，n=3）Tab.4 Results of content determination of various constituents（%，，n=3）

表4 各成分含有量測定結(jié)果（%，，n=3）Tab.4 Results of content determination of various constituents（%，，n=3）

本實驗以9 種成分色譜峰的分離度、峰形及分析時間為評價指標(biāo)，考察了水及20%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%甲醇9 種溶劑對9 種成分提取的影響，發(fā)現(xiàn)70%甲醇的提取效果最好；利用UPLC-DAD 檢測器于190～400 nm 掃描供試品溶液和混合對照品溶液，發(fā)現(xiàn)乙酰纈草三酯、纈草三酯最大吸收波長為256 nm［3，15］，橙皮苷最大吸收波長為284 nm，新綠原酸等6 種被測酚酸類成分最大吸收波長為327 nm［10］，所選用的最大吸收波長均與文獻(xiàn)報道一致，為便于實驗操作確定0～11 min 檢測波長為327 nm、11～30 min 檢測波長為256 nm。根據(jù)Van Deemter 理論，色譜柱粒徑越小，塔板數(shù)高度越低，柱效越高，考察了不同型號色譜柱，結(jié)果顯示Ultimate?UHPLC Polar-RP（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）柱效較佳、各色譜峰響應(yīng)值較高、峰形較好、各成分均能達(dá)到有效分離，30 min 內(nèi)即可實現(xiàn)蜘蛛香中9 種成分有效分離，可大大提高分析效率，同時減少試劑用量，降低分析成本?？疾炝艘译?甲醇-水流動相體系，并水中添加酸試劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)9 種成分色譜峰峰形在乙腈-0.1%甲酸水溶液梯度洗脫系統(tǒng)中基線平穩(wěn)、分離效果最好，可達(dá)到分離度要求。

2015 年版《中國藥典》（一部）中蜘蛛香藥材無含有量測定方法，不能準(zhǔn)確反映其內(nèi)在質(zhì)量；單一的化學(xué)成分難以全面保障和反映藥材的品質(zhì)及有效性，相較于現(xiàn)有蜘蛛香成分含有量的測定［10，16-19］，本實驗應(yīng)用波長切換法建立UPLC 法同時測定蜘蛛香中9 種成分的含有量，包括6 種酚酸類（新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C）、1 種黃酮類（橙皮苷）、2 種纈草三酯類（乙酰纈草三酯、纈草三酯），共3 種化學(xué)結(jié)構(gòu)類型，具有簡便快捷、結(jié)果準(zhǔn)確、專屬性好等特點，適用于蜘蛛香的質(zhì)量控制，測定的成分較多，能更全面地反映其內(nèi)在質(zhì)量，有利于蜘蛛香質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升，以期為蜘蛛香新藥研發(fā)及藥理研究提供參考。中藥材品質(zhì)可能與藥材的生長環(huán)境、生長年限、根莖粗細(xì)、采收時間、貯藏條件等因素有關(guān)，為保證蜘蛛香的臨床用藥質(zhì)量和療效，應(yīng)規(guī)范其適宜采收期、保存時間和指標(biāo)成分含有量限度。實驗結(jié)果表明，不同產(chǎn)地蜘蛛香藥材中9 種成分含有量差異較大，RSD 為24.34%～72.00%，其中纈草三酯、橙皮苷、異綠原酸A、綠原酸的含有量較高分別占總量的 37.10%、20.28%、15.45%、12.95%，為保證蜘蛛香的臨床療效，建議蜘蛛香中纈草三酯、橙皮苷、異綠原酸A、綠原酸含有量分別不得少于 1.035%、0.566%、0.431%、0.361%。