李 增，張 瑞，張曉堅(jiān)，杜書(shū)章

（鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 藥學(xué)部，河南 鄭州 450000）

骨肉瘤（Osteosarcoma，OS）是世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的惡性骨腫瘤之一，發(fā)病人群多為兒童和青少年，男性發(fā)病率高于女性［1］，OS 具有強(qiáng)的轉(zhuǎn)移性和侵襲性，臨床上，該病具有預(yù)后性差、致死率高等特點(diǎn)，一般治療手段為化療加上手術(shù)切除，但其惡化程度高，且化療藥耐受性高，因此患者治療后5 年存活率不足70%［2］，此外，化療藥價(jià)格昂貴，治療效果差強(qiáng)人意，且副作用較大。

Wnt 通路是生物體細(xì)胞內(nèi)一條進(jìn)化過(guò)程中高度保守的信號(hào)通路，近年來(lái)在腫瘤細(xì)胞的研究中被廣泛關(guān)注。Wnt 信號(hào)通路分為4 個(gè)分支，分別為經(jīng)典的Wnt/β-catenin 信號(hào)通路、Wnt/Ca2+信號(hào)通路、調(diào)節(jié)紡錘體方向和非對(duì)稱(chēng)細(xì)胞分裂的路徑以及平面細(xì)胞極性路徑［3］，其中Wnt/β-catenin 經(jīng)典路徑是研究最多的一條分支，該信號(hào)路徑能調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、細(xì)胞間質(zhì)化等多個(gè)方面的生物學(xué)功能［4］。大量研究表明，Wnt/β-catenin 通路的異常激活與多種癌癥有關(guān)［3］，同時(shí)有研究證實(shí)，Wnt/β-catenin 通路與OS 的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［4］。

石見(jiàn)穿為唇形科鼠尾草屬植物華鼠尾草，其有效成分石見(jiàn)穿多糖已被證實(shí)具有良好的抗癌效果，對(duì)多種腫瘤細(xì)胞有抑制作用［5］，但其對(duì)OS 的作用影響尚鮮有報(bào)道。本研究擬探討石見(jiàn)穿多糖能否對(duì)人OS MG63 細(xì)胞系的生物學(xué)行為產(chǎn)生影響，及其可能存在的作用機(jī)制，為臨床OS 的治療尋找新的有效藥物提供理論支撐。

1 材料

1.1 細(xì)胞株 人OS MG63 細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2 藥物與試劑 石見(jiàn)穿多糖（SBPs）購(gòu)自上海將來(lái)實(shí)業(yè)股份有限公司（國(guó)藥準(zhǔn)字H20180625）；含雙抗的1640 培養(yǎng)基（批號(hào)M0655）、胎牛血清（批號(hào)M4667）購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；TRIzol（批號(hào)A001-3-2）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)A005-1-2）購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；β-catenin 引物由上海生工生物工程有限公司合成；兔抗人Vimentin（批號(hào)ab190321）、E-cadherin（批號(hào)ab180323）一抗購(gòu)自上海艾博抗貿(mào)易有限公司；鼠抗人β-actin（批號(hào)AF5001）購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；Transwell小室（批號(hào)ab195443）購(gòu)自上海艾博抗貿(mào)易有限公司。

1.3 儀器 雙人水平超凈工作臺(tái)（上海巴玖實(shí)業(yè)有限公司）；二氧化碳細(xì)胞孵育箱（美國(guó)Thermo公司）；低溫高速離心機(jī)（美國(guó)Thermo 公司）；S1000 型PCR 擴(kuò)增儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）；電轉(zhuǎn)儀系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad 公司）；DYC-p32 型電泳儀（上海巴玖實(shí)業(yè)有限公司）；轉(zhuǎn)膜儀（南京生興生物經(jīng)濟(jì)技術(shù)有限公司）；圖像記錄分析系統(tǒng)：大連Jim-X Scientific 公司；倒置熒光顯微鏡（DMIL LED Fluo，德國(guó)Leica 公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞復(fù)蘇和培養(yǎng) 將凍存的人OS MG63 細(xì)胞株解凍、復(fù)蘇，培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%雙抗的1640 培養(yǎng)液中，于37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待其貼壁。每天注意觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，以細(xì)胞液的顏色、形狀判斷是否需要換液，換液周期一般為2～3 d。待細(xì)胞生長(zhǎng)匯合度達(dá)到80%以上時(shí)，則需要進(jìn)行傳代，傳代比例一般為1∶5～1∶8。

2.2 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)石見(jiàn)穿多糖對(duì)人OS MG63 細(xì)胞遷移能力的影響 將人OS MG63 細(xì)胞以約5×105/孔接種于6 孔板，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)16 h 后，加入含不同濃度石見(jiàn)穿多糖的細(xì)胞培養(yǎng)液，加入藥物濃度分別為 0（對(duì)照組）、0.25、0.5、1 mg/mL，每組設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔［6］。在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用不含F(xiàn)BS 的RPMI-1640 培養(yǎng)液饑餓處理12 h；用10 μL 的移液槍頭垂直于板面劃痕，每4 小時(shí)觀察一次細(xì)胞遷移狀態(tài)，于倒置熒光顯微鏡下拍照，用作圖軟件處理，比較每組細(xì)胞0 h 和24 h 的劃痕寬度。

2.3 Transwell 小室檢測(cè)石見(jiàn)穿多糖對(duì)人OS MG63細(xì)胞侵襲能力的影響 將OS MG63 細(xì)胞與不同濃度的石見(jiàn)穿多糖（0、0.25、0.5、1 mg/mL）共培養(yǎng)24 h，加入不含F(xiàn)BS 的培養(yǎng)基，饑餓處理12 h，胰蛋白酶消化后，將細(xì)胞洗滌、離心，用不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度約2×105/mL；將小室置于24 孔板內(nèi)，加入300 μL 含10%FBS 的RPMI-1640 培養(yǎng)液，室溫下靜置30 min 左右，使基質(zhì)膠水化，向外室內(nèi)加入500 μL 含10%FBS 的RPMI-1640 培養(yǎng)液，將200 μL 單細(xì)胞懸液接種于小室內(nèi)，培養(yǎng)24 h 后，進(jìn)行GISMA 染色，向每孔加入400 μL A 液染色4 min，加入800 μL B 液染色8 min，用棉簽擦拭小室內(nèi)側(cè)，流水沖洗染液；用手術(shù)刀片將膜取下，置于載玻片上，于倒置顯微鏡下觀察、計(jì)數(shù)并拍照；每張玻片取上下左右中5個(gè)視野計(jì)數(shù)細(xì)胞，取平均數(shù)。

2.4 RT-PCR 檢測(cè)石見(jiàn)穿對(duì)人OS MG63 細(xì)胞βcateninmRNA 表達(dá)的影響 將OS MG63 細(xì)胞與不同濃度的石見(jiàn)穿多糖（0、0.25、0.5、1 mg/mL）共培養(yǎng)24 h，TRIzol 提取細(xì)胞總RNA，行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。取2 μLRNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，引物序列，內(nèi)參β-actin正向5′-CTACGTCGGCTTAGCGCAAC-3′，反向5′-TAGGCTTAGCTAGCTTCGAA-3′；β-catenin正向 5′-TAGGCTTAGCTAGCCTAGCC-3′，反向 5′-TAGCGGCTATCGGCTAGCAC-3′，擴(kuò)增條件為94 ℃預(yù)變性2 min，1 個(gè)循環(huán)；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃總延伸6 min。取5 μL PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，紫外線投射儀下觀察電泳條帶，分析系統(tǒng)分析目的基因和參比基因的條帶灰度值。

2.5 Western blot 檢測(cè)石見(jiàn)穿對(duì)人OS MG63 細(xì)胞Vimentin、E-cadherin 蛋白表達(dá)的影響 將OS MG63 細(xì)胞與不同濃度的石見(jiàn)穿多糖（0、0.25、0.5、1 mg/mL）共培養(yǎng)24 h，用RIPA 細(xì)胞裂解液裂解，提取蛋白質(zhì)，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結(jié)束后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至NC 膜，置于含有5%脫脂奶粉的TBST 中搖育封閉2 h；加入稀釋后的一抗，TBST 洗滌；加入二抗，TBST 洗滌，ECL顯色；將膠片掃描后用Bandscan 5.0 軟件進(jìn)行灰度分析。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以（）表示，多組間的比較用方差分析分析，組內(nèi)兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。以P≤0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 石見(jiàn)穿多糖對(duì)人OS MG63 細(xì)胞遷移能力的影響 石見(jiàn)穿多糖組劃痕比值（24 h/0 h）高于對(duì)照組（P＜0.01），且隨著藥物濃度的增加，劃痕比值隨之增加，呈劑量依賴(lài)性，說(shuō)明石見(jiàn)穿多糖能抑制細(xì)胞的遷移。Transwell 結(jié)果顯示，石見(jiàn)穿多糖組細(xì)胞透過(guò)上室Matrigel 膠的數(shù)量少于對(duì)照組（P＜0.01），隨著石見(jiàn)穿多糖濃度的增加，侵襲細(xì)胞數(shù)逐漸減少，呈劑量依賴(lài)性，說(shuō)明石見(jiàn)穿多糖能抑制細(xì)胞的侵襲能力。見(jiàn)圖1～2、表1。

圖1 劃痕檢測(cè)各組人OS MG63 細(xì)胞遷移（×40）Fig.1 Detection of human OS MG63 cells migration by scratch test（×40）

圖2 Transwell 檢測(cè)各組人OS MG63 細(xì)胞侵襲能力（×20）Fig.2 Detection of the invasion ability of human OS MG63 cells in each group by Transwell（×20）

表1 石見(jiàn)穿多糖對(duì)人OS MG63 細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響（，n=3）Tab.1 Effects of SBPs on the migration and invasion ability of human OS MG63 cells（，n=3）

表1 石見(jiàn)穿多糖對(duì)人OS MG63 細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響（，n=3）Tab.1 Effects of SBPs on the migration and invasion ability of human OS MG63 cells（，n=3）

注：與對(duì)照組比較，**P＜0.01；與0.25 mg/mL 石見(jiàn)穿多糖組比較，##P＜0.01；與0.5 mg/mL 石見(jiàn)穿多糖組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

3.2 石見(jiàn)穿多糖對(duì)人OS MG63 細(xì)胞β-cateninmRNA 表達(dá)的影響 石見(jiàn)穿多糖組β-cateninmRNA表達(dá)低于對(duì)照組（P＜0.01），且隨著藥物濃度的增加，β-cateninmRNA 的表達(dá)逐漸減弱。見(jiàn)圖3、表2。

圖3 RT-PCR 檢測(cè)各組人OS MG63 細(xì)胞β-catenina mRNA表達(dá)Fig.3 Detection of β-catenina mRNA expression of human OS MG63 cells in each group by RT-PCR

3.3 石見(jiàn)穿多糖對(duì)人OS MG63 細(xì)胞E-cadherin、Vimentin 蛋白表達(dá)的影響 石見(jiàn)穿多糖組細(xì)胞E-cadherin蛋白的表達(dá)高于對(duì)照組（P＜0.01），且隨著藥物濃度的增加，呈劑量依賴(lài)性；石見(jiàn)穿多糖組細(xì)胞Vimentin 蛋白表達(dá)弱于對(duì)照組（P＜0.05，P＜0.01），且該抑制作用隨著藥物濃度的增加而增加。見(jiàn)圖4、表2。

圖4 Western blot 檢測(cè)各組人OS MG63細(xì)胞蛋白表達(dá)Fig.4 Detection of protein expression of human OS MG63 cells in each group by Western blot

表2 石見(jiàn)穿多糖對(duì)人OS MG63 細(xì)胞β-catenin mRNA 及E-cadherin、Vimentin 蛋白表達(dá)的影響（，n=3）Tab.2 Effects of SBPs on the expression of β-catenin mRNA，E-cadherin and Vimentin protein in human OS MG63 cells（，n=3）

表2 石見(jiàn)穿多糖對(duì)人OS MG63 細(xì)胞β-catenin mRNA 及E-cadherin、Vimentin 蛋白表達(dá)的影響（，n=3）Tab.2 Effects of SBPs on the expression of β-catenin mRNA，E-cadherin and Vimentin protein in human OS MG63 cells（，n=3）

注：與對(duì)照組比較，* P ＜0.05，**P ＜0.01；與0.25 mg/mL 石見(jiàn)穿多糖組比較，## P ＜0.01；與0.5 mg/mL 石見(jiàn)穿多糖組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

4 討論

遷移和侵襲是OS 細(xì)胞最主要的特點(diǎn)，也是導(dǎo)致癌癥惡化和擴(kuò)散的最主要原因［7］。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epothelial-mesenchymal transition，EMT）指源于上皮的腫瘤細(xì)胞失去極性而向具有間質(zhì)表型細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過(guò)程，在此過(guò)程中，上皮細(xì)胞粘附性降低，極性消失，使細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力增強(qiáng)［8］。Wnt/β-catenin 信號(hào)通路是導(dǎo)致EMT 的重要因素［8］，正常細(xì)胞β-catenin 與E-cadherin 相結(jié)合形成復(fù)合體，維持細(xì)胞的極性，使細(xì)胞間接觸穩(wěn)定，限制細(xì)胞的移動(dòng)；當(dāng)Wnt 通路被異常激活時(shí)，該復(fù)合體被破壞，細(xì)胞 E-cadherin 表達(dá)下降，Vimentin 等能刺激細(xì)胞移動(dòng)的蛋白表達(dá)上調(diào)，各種蛋白相互作用，使細(xì)胞失去極性，細(xì)胞間連接變得疏松，從而導(dǎo)致細(xì)胞粘附力下降，移動(dòng)能力增強(qiáng)，發(fā)生遷移或侵襲［7-8］。有研究證實(shí)，在OS 細(xì)胞中，Wnt 信號(hào)通路的異常激活促進(jìn)了腫瘤的增殖和早期肺部轉(zhuǎn)移，而抑制Wnt 通路的活性可以抑制OS 干細(xì)胞的自我更新，從而抑制癌癥的侵襲性和耐藥性［9］。

石見(jiàn)穿多糖在臨床上多用于治療各種感染性疾病，近年來(lái)，大量藥理實(shí)驗(yàn)證實(shí)其對(duì)多種細(xì)胞系具有細(xì)胞毒性作用，能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和線粒體損傷，同時(shí)能通過(guò)對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、白細(xì)胞介素的調(diào)控而抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲［10］，但其對(duì)于膀胱癌細(xì)胞的影響尚鮮有研究。本研究發(fā)現(xiàn)，石見(jiàn)穿多糖能顯著抑制人OS 細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲，且在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性。

β-catenin 是該通路的核心因子，大量研究發(fā)現(xiàn)，癌癥的發(fā)生與Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的異常激活有關(guān)［3］，結(jié)直腸癌、乳腺癌、前列腺癌細(xì)胞質(zhì)都存在β-catenin 的聚集［11-12］，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)OS 細(xì)胞核內(nèi) β-catenin 的表達(dá)顯著增加，而敲除β-catenin后，膀胱癌細(xì)胞的遷移核侵襲能力都有所減弱［13］。本研究以β-catenin 作為Wnt 經(jīng)典通路的標(biāo)志因子，用不同濃度的石見(jiàn)穿多糖與人OS MG63 細(xì)胞共培養(yǎng)24 h，石見(jiàn)穿多糖能顯著抑制細(xì)胞內(nèi)β-cateninmRNA 表達(dá)，且呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性，提示石見(jiàn)穿多糖可能對(duì)人OS 細(xì)胞內(nèi)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活性具有抑制作用。

E-cadherin 的表達(dá)缺失是EMT 過(guò)程中的重要標(biāo)志。在許多類(lèi)型的腫瘤中，可以通過(guò)恢復(fù)E-cadherin 的表達(dá)而抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲［7，14］。體外研究證實(shí)，通過(guò)給E-cadherin 表達(dá)缺陷的細(xì)胞轉(zhuǎn)染該蛋白基因后，腫瘤的侵襲性消失［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，石見(jiàn)穿多糖能刺激細(xì)胞內(nèi)E-cadherin 的表達(dá)，且隨著藥物濃度的增加，E-cadherin的表達(dá)隨之增加，推測(cè)石見(jiàn)穿多糖可能通過(guò)刺激人OS MG63 細(xì)胞內(nèi)E-cadherin 表達(dá)而抑制EMT 過(guò)程，從而減弱細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

同一腫瘤細(xì)胞系中，占主導(dǎo)地位的E-cadherin負(fù)性化的作用導(dǎo)致癌癥細(xì)胞播散，并增加了細(xì)胞內(nèi)Vimentin 的活性。Vimentin 屬于中間絲家族成員，其主要作用在于調(diào)節(jié)細(xì)胞收縮、粘附和遷移其作為間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白，是EMT 途徑另一重要的蛋白之一［16］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，石見(jiàn)穿多糖在刺激人OS MG63 細(xì)胞內(nèi)E-cadherin 表達(dá)的同時(shí)，抑制了Vimentin的表達(dá)。石見(jiàn)穿多糖可能通過(guò)刺激人OS細(xì)胞內(nèi)E-cadherin 表達(dá)，抑制Vimentin 的表達(dá)，而阻斷細(xì)胞內(nèi)EMT 過(guò)程，從而減弱細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

綜上所述，石見(jiàn)穿多糖能抑制人OS MG63 細(xì)胞的遷移和侵襲能力，這種作用可能使通過(guò)抑制Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的活性，從而阻斷細(xì)胞內(nèi)EMT 過(guò)程而引起的。