黃茸茸，陸松俠，許 燕，李維祖

（1.安徽新華學(xué)院藥學(xué)院藥理教研室，安徽 合肥 230088；2.安徽醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，抗炎免疫藥理學(xué)教育部重點實驗室，國家中醫(yī)藥管理局中藥藥理三級實驗室，安徽 合肥 230032）

阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一種起病隱匿的中樞神經(jīng)退行性疾病，病因復(fù)雜且機制未明，臨床治療難度較大。隨著我國人口老齡化水平的日益加重，該病的發(fā)病率呈持續(xù)升高趨勢，家庭和社會負(fù)擔(dān)沉重，因此，尋找有效的治療藥物迫在眉睫。近年來有研究［1］顯示，β-淀粉樣蛋白（β-amyloid，Aβ）在腦內(nèi)沉積介導(dǎo)的氧化應(yīng)激所致的慢性炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡與神經(jīng)元退行性病變的重要因素之一。因此，抑制氧化應(yīng)激導(dǎo)致的細(xì)胞炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是防治神經(jīng)退行性病變的有效策略。炎癥小體是由胞漿內(nèi)模式識別受體（PRRs）參與組裝的多蛋白復(fù)合物，是與免疫炎癥反應(yīng)密切相關(guān)的關(guān)鍵性物質(zhì)，主要負(fù)責(zé)促進相關(guān)促炎因子的形成。炎癥小體激活后可通過活化caspase-1 來切割pro-IL-1β 和pro-IL-18，使其裂解成熟并介導(dǎo)機體炎癥反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展。研究［2］表明，炎癥小體核苷酸結(jié)合NLRP-1 參與了神經(jīng)退行性疾病的病理過程，在小鼠AD 模型中，Aβ 可通過破壞小膠質(zhì)細(xì)胞的溶酶體來激活NLRP-1，表明NLRP-1 活化促進了老年癡呆癥的病理發(fā)展，而NADPH 氧化酶-ROS 生成增加也是激活炎癥小體的主要途徑之一［3］。因此，推測Aβ 誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞損傷可能與NADPH 氧化酶-ROS 途徑導(dǎo)致的NLRP-1炎癥小體激活有關(guān)。

銀杏葉提取物是治療AD 的常用中藥，而白果內(nèi)酯（Bilobalide）是銀杏葉提取物中重要的生物活性成份，其在神經(jīng)保護以及促進神經(jīng)生長等方面發(fā)揮著重要作用［4］。已有研究結(jié)果表明，白果內(nèi)酯能改善Aβ25-35誘導(dǎo)的AD 模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，對大腦皮層和海馬神經(jīng)元也具有較好的保護作用［5］。NADPH 氧化酶誘導(dǎo)的ROS 生成增多能夠使海馬神經(jīng)元NLRP1 炎癥小體激活從而促進神經(jīng)元損傷［6］。白果內(nèi)酯是否可通過抑制ROS 生成來抑制神經(jīng)元NLRP-1 炎癥小體的活化，參與對Aβ25-35誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元損傷的保護作用目前尚不清楚。因此，本研究采用Aβ25-35誘導(dǎo)的小鼠海馬神經(jīng)元HT22 細(xì)胞損傷模型，觀察白果內(nèi)酯對HT22 細(xì)胞損傷的保護作用是否與其干預(yù)ROS 生成過多所致的NLRP-1 炎癥小體激活有關(guān)。

1 材料

1.1 細(xì)胞株 小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞HT22（編號BNCC337709），購于北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。

1.2 藥物與試劑 白果內(nèi)酯（純度≥98%，美國sigma 公司，批號20160612）；Aβ25-35（美國sigma公司，批號20160503）；胎牛血清（美國Gibco 公司，批號1227697）；DMEM/F12（美國Gibco 公司，批號1868819）；活性氧（ROS）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號E004-1-1）；CCK-8 檢測試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所，批號C0038）；IL-1β、IL-6、TNF-α 檢測ELISA 試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所，批號分別為PI301、PI326、PT512）；兔抗NLRP-1 多克隆抗體、兔抗casepase-1 多克隆抗體（英國Abcam 公司，貨號分別為ab3685、ab1874）；兔抗ASC 多克隆抗體（美國Santa cruz 公司，批號sc-33956）；β-actin 單克隆抗體（北京中杉金橋生物有限公司，批號TA-07）；Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號E-CKA211）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 儀器 無菌超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；5% CO2恒溫培養(yǎng)箱（力康生物醫(yī)療科技控股集團）；FACS Calibur 流式細(xì)胞儀（美國BD 公司）；PowerPac200 Western blotting 電泳儀（美國伯樂公司）；IX-71 熒光倒置顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；756MC 紫外可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）；TGL16H 高速低溫離心機（珠海黑馬儀器有限公司）；Mini-PROTEAN?Tetra 電泳槽（美國Bio Rad 公司）；PowerPacTM電泳儀（美 國Bio Rad 公司）；全波長酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher 公司）；96孔培養(yǎng)板（美國Costar 公司）；Tanon-4500 全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）；Image-Pro Plus（IPP 7.0）圖像處理分析軟件（美國Media Cybernetics 公司）。

2 方法

2.1 分組與給藥 取對數(shù)生長期的小鼠海馬神經(jīng)元HT22 細(xì)胞，分為對照組、模型組（Aβ25-35，1 μmol/L）及白果內(nèi)酯低、中、高劑量組（6、12、24 μmol/L），NADPH 氧化酶抑制劑（DPI，15 μmol/L）陽性對照組。用完全培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。除對照組，其余各組均以Aβ25-35（1 μmol/L）刺激細(xì)胞，并分別給予白果內(nèi)酯和DPI 干預(yù)，作用24 h 后檢測相關(guān)指標(biāo)。

2.2 CCK-8 法檢測HT22 細(xì)胞活力 細(xì)胞藥物處理24 h 后，小心棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，向每孔加入20 μL CCK-8 溶液，放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育2 h，將培養(yǎng)板放置在搖床上搖動5 min，酶標(biāo)儀在450 nm 波長下測定各孔的吸光度值（OD），按以下公式計算各組細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率＝［（OD給藥組-OD空白組）/（OD對照組-OD空白組）］×100%。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)DCFH-DA 熒光法檢測HT22 細(xì)胞ROS 生成 利用熒光探針DCFH-DA 檢測細(xì)胞內(nèi)ROS 生成。DCFH-DA 本身無熒光，進入細(xì)胞后可被水解生成DCFH，而DCFH 無法透過細(xì)胞膜。細(xì)胞內(nèi)的ROS 可以將無熒光的DCFH 氧化生成為有熒光的DCF，通過DCF 熒光強度檢測即可反映細(xì)胞內(nèi)ROS 水平。取藥物作用24 h 后的各組細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，移入離心管800 r/min，離心5 min 棄上清。再按ROS 試劑盒說明書加入1 mL 染色工作液（10 μmol/L DCFH-DA），混勻并放入37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中避光孵育30 min。用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液重復(fù)洗滌細(xì)胞3 次，以充分清除未進入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。最后在激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm 處，使用流式細(xì)胞儀（FITC-A 通道）檢測各組細(xì)胞內(nèi)熒光強度。

2.4 ELISA 法檢測HT22 細(xì)胞上清中炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α 水平 取給藥24 h 后的各組細(xì)胞，吸取培養(yǎng)板每孔上清液100 μL，4 ℃離心10 min，采用雙抗體夾心ELISA 法，按IL-1β、IL-6、TNF-α 細(xì)胞因子檢測試劑盒說明書進行測定操作。酶標(biāo)儀在450 nm 波長下測定各孔吸光度值（OD），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線算出各組細(xì)胞上清中IL-1β、IL-6、TNF-α 水平。

2.5 Western blot 法檢測HT22 細(xì)胞NLRP-1、ASC、caspase-1 蛋白的表達 取給藥24 h 后的各組細(xì)胞，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS 清洗細(xì)胞后每孔加入500 μL 細(xì)胞裂解液，裂解5 min，再于4 ℃下11 000 r/min離心10 min，取其上清。將上清液倒入預(yù)冷的離心管中，用BCA 法對蛋白進行定量，再加入loading buffer 煮沸變性，SDS-PAGE 凝膠電泳并轉(zhuǎn)PVDF 膜，轉(zhuǎn)膜完成后將膜放入5%脫脂奶粉封閉液中室溫孵育1 h，再加一抗（NLRP-1 1∶1 000；ASC 1∶1 000；caspase-1 1∶1 000），于4 ℃冰箱中孵育過夜。TBST 洗滌3 次，10 min/次，加入HRP 標(biāo)記的二抗（1∶5 000），室溫下孵育1 h，TBST 洗滌3 次，10 min/次。最后加ECL 化學(xué)發(fā)光劑，用Tanon-4500 化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進行顯影。以β-actin 的表達作為參照，利用Image J 軟件處理目的蛋白的灰度值進行半定量分析。

2.6 Annexin V-FITC/PI 雙染法檢測HT22 細(xì)胞凋亡 取給藥24 h 后的各組細(xì)胞，2 000 r/min 離心5 min，棄去培養(yǎng)基。用冷PBS 洗滌細(xì)胞2 次，用400 μL binding buffer 懸浮細(xì)胞，調(diào)整濃度約為1×106/mL。在細(xì)胞懸浮液中加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻后于2～8 ℃避光孵育15 min，再加入10 μL PI 后混勻于2～8 ℃避光孵育5 min，最后在熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞的凋亡情況。

2.7 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進行處理與分析。計量資料以（）表示，多組間比較選用單因素方差分析，組間比較采用t檢驗。以P≤0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 白果內(nèi)酯對Aβ25-35誘導(dǎo)的HT22 細(xì)胞存活率的影響 與對照組比較，Aβ25-35（1 μmol/L）刺激HT22 細(xì)胞24 h 后，細(xì)胞存活率下降（P＜0.01）；與模型組比較，白果內(nèi)酯中、高劑量組（12、24 μmol/L）與陽性對照組（15 μmol/L）的細(xì)胞存活率提高（P＜0.01），而白果內(nèi)酯低劑量組（6 μmol/L），差異無統(tǒng)計學(xué)意義。提示白果內(nèi)酯中、高劑量與DPI 對Aβ25-35誘導(dǎo)的HT22 海馬神經(jīng)元細(xì)胞損傷具有較好的保護作用。見表1。

表1 白果內(nèi)酯對Aβ25-35 誘導(dǎo)的HT22 細(xì)胞存活率的影響（，n=3）Tab.1 Effects of bilobalide on the survival of Aβ25-35-induced HT22 cells（，n=3）

表1 白果內(nèi)酯對Aβ25-35 誘導(dǎo)的HT22 細(xì)胞存活率的影響（，n=3）Tab.1 Effects of bilobalide on the survival of Aβ25-35-induced HT22 cells（，n=3）

注：與對照組比較，##P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01。

3.2 白果內(nèi)酯對Aβ25-35誘導(dǎo)的HT22 細(xì)胞內(nèi)ROS生成的影響 流式法（FITC-A 通道）測定細(xì)胞內(nèi)ROS 的流式圖中橫坐標(biāo)代表平均熒光強度，縱坐標(biāo)代表細(xì)胞計數(shù)。與對照組比較，模型組細(xì)胞平均熒光強度增高（P＜0.01），表明經(jīng)Aβ25-35誘導(dǎo)后細(xì)胞內(nèi)ROS 生成增多；與模型組比較，白果內(nèi)酯中、高劑量組（12、24 μmol/L）與陽性藥組細(xì)胞平均熒光強度降低（P＜0.05，P＜0.01），白果內(nèi)酯低劑量組（6 μmol/L），差異無統(tǒng)計學(xué)意義。白果內(nèi)酯能減少Aβ25-35誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS 生成，其機制可能與其抑制NADPH 酶有關(guān)。見圖1。

圖1 白果內(nèi)酯對Aβ25-35誘導(dǎo)的HT22 細(xì)胞內(nèi)ROS 生成的影響（，n=3）Fig.1 Effects of bilobalide on ROS generation in Aβ25-35-induced HT22 cells（，n=3）

3.3 白果內(nèi)酯對Aβ25-35誘導(dǎo)的HT22 細(xì)胞炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α 水平的影響 與對照組比較，模型組細(xì)胞上清液中細(xì)胞炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α 水平增加（P＜0.01）；與模型組比較，白果內(nèi)酯中、高劑量組（12、24 μmol/L）與陽性對照組 IL-1β、IL-6、TNF-α 水平減少（P＜0.05，P＜0.01），而白果內(nèi)酯低劑量組（6 μmol/L）僅減少TNF-α 水平（P＜0.05），對細(xì)胞因子IL-1β、IL-6 釋放的無影響。見圖2。

圖2 白果內(nèi)酯對Aβ25-35誘導(dǎo)的HT22 細(xì)胞炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α 水平影響（，n=3）Fig.2 Effects of bilobalide on the levels of IL-1β，IL-6 and TNF-α in Aβ25-35-induced HT22 cells（，n=3）

3.4 白果內(nèi)酯對Aβ25-35誘導(dǎo)的HT22 細(xì)胞NLRP-1、ASC、caspase-1 蛋白表達的影響 與對照組比較，Aβ25-35（1 μmol/L）刺激細(xì)胞24 h 后，模型組細(xì)胞NLRP-1、ASC、caspase-1 蛋白表達增加（P＜0.01）；與模型組比較，白果內(nèi)酯高劑量組（24 μmol/L）下調(diào)NLRP-1、ASC、caspase-1 的蛋白表達（P＜0.01），陽性對照組NLRP-1 與ASC 蛋白表達減少（P＜0.05）。見圖3。

圖3 白果內(nèi)酯對Aβ25-35誘導(dǎo)的HT22 細(xì)胞NLRP-1、ASC、caspase-1 蛋白表達的影響（，n=3）Fig.3 Effects of bilobalide on the expression of NLRP-1，ASC，caspase-1 protein in Aβ25-35-induced HT22 cells（，n=3）

3.5 白果內(nèi)酯對Aβ25-35誘導(dǎo)的HT22 細(xì)胞凋亡的影響 與對照組比較，模型組可提高Annexin V-FITC 染色神經(jīng)元與PI 染色神經(jīng)元的比值（P＜0.01）；與模型組比較，白果內(nèi)酯中、高劑量組（12、24 μmol/L）及陽性對照組 Annexin V-FITC染色神經(jīng)元與PI 染色神經(jīng)元的比值下降（P＜0.05，P＜0.01）。見圖4。

4 討論

大量研究顯示，AD 的發(fā)病與Aβ 沉積引起的繼發(fā)性炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。炎癥是機體對于外界刺激的一種防御性反應(yīng)，但過度的炎癥反應(yīng)也是導(dǎo)致神經(jīng)元退行性疾病的重要因素，抗炎治療能一定程度延緩AD 的病程，但具體機制尚不完全清楚。炎癥小體是先天免疫系統(tǒng)中重要的組成部分，近年研究發(fā)現(xiàn)，異常活化的炎癥小體能夠?qū)е露喾N炎性疾病的發(fā)生，如痛風(fēng)、關(guān)節(jié)炎和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病等，而炎癥小體所介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)與中樞神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生密切相關(guān)［7］。炎性小體是在多種細(xì)胞的胞質(zhì)中存在的多聚體蛋白復(fù)合體，激活后的炎癥小體以應(yīng)對感染或應(yīng)激信號導(dǎo)致宿主細(xì)胞膜受損。NLRP-1 炎癥小體主要由3 種蛋白構(gòu)成，即NLRP-1、ASC、caspase-1。其中ASC 是接頭蛋白并主要負(fù)責(zé)催化，NLRP-1 是始動分子，caspase-1 則為效應(yīng)分子。NLRP-1 通過ASC 招募Pro-caspase-1，caspase-1 激活后可對pro-IL-1β 等炎癥因子前體進行加工，使其成熟并釋放到胞外，誘發(fā)神經(jīng)炎性反應(yīng)而導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變。因此，抑制NLRP-1 炎癥小體活化成為防治AD 的可能機制。另外，ROS過量生成導(dǎo)致的氧化應(yīng)激亦被認(rèn)為是在Aβ 介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡中發(fā)揮作用的關(guān)鍵因素。有研究［8］表明，Aβ 可誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)ROS 大量蓄積，有助于促進AD 老年斑和神經(jīng)纖維纏結(jié)的形成，使細(xì)胞受到氧化性損傷。NADPH 氧化酶是腦內(nèi)生成ROS 的重要酶系統(tǒng)，已被證明在各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，通過調(diào)控ROS 水平來抑制氧化應(yīng)激，對防治AD 具有積極意義。

白果（又稱銀杏果）是銀杏樹的種子，是一種含有特異生物活性成分的中藥材，已有研究表明，其在抗菌、抗腫瘤、抗氧化、降壓以及抗炎免疫等方面均具有較好療效，因此，在醫(yī)藥保健方面具有很高的研發(fā)價值。白果內(nèi)酯是從銀杏科植物銀杏中提取出來的倍半萜物質(zhì)，是目前銀杏中最受關(guān)注的活性成分，其在心腦血管疾病的臨床治療中已有較確切的療效。課題組前期研究［9］發(fā)現(xiàn)，白果內(nèi)酯可改善癡呆小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，具有清除自由基、抗氧化、抗炎、擴腦血管與促神經(jīng)生長等作用，而其神經(jīng)營養(yǎng)作用更強于銀杏內(nèi)酯。因此，進一步研究AD 的發(fā)生發(fā)展機制及白果內(nèi)酯對AD 的防治作用機制具有非常重要的意義。本課題組前期研究還發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激水平的糖皮質(zhì)激素長期作用可增加腦內(nèi)ROS 生成，促進NLRP-1 炎癥小體的激活，使炎性因子生成增多，促進小鼠皮層和海馬區(qū)神經(jīng)元的損傷［10］。人參皂苷Rg1 能夠減少ROS 產(chǎn)生，抑制NLRP-1 炎癥小體的激活，從而改善神經(jīng)元老化和認(rèn)知功能障礙［11］。因此推測白果內(nèi)酯可能通過抑制NADPH 氧化酶-ROS 介導(dǎo)的神經(jīng)元NLRP-1炎癥小體激活，從而減輕Aβ25-35誘導(dǎo)的神經(jīng)元炎性損傷及細(xì)胞凋亡。

圖4 白果內(nèi)酯對Aβ25-35誘導(dǎo)的HT22 神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的影響（，n=3）Fig.4 Effects of bilobalide on neuronal apoptosis in Aβ25-35-inducedHT22 cells（，n=3）

本研究發(fā)現(xiàn)，Aβ25-35（1 μmol/L）處理HT22細(xì)胞24 h 后，HT22 細(xì)胞活力明顯降低，神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞內(nèi)活性氧ROS 生成、NLRP-1 炎癥小體相關(guān)蛋白的表達及IL-1β、IL-6、TNF-α 等炎性細(xì)胞因子釋放量均明顯升高。本研究結(jié)果表明，ROS 過度生成導(dǎo)致的神經(jīng)元NLRP-1 炎癥小體激活在Aβ 誘導(dǎo)的神經(jīng)元炎性損傷中具有十分重要的作用，而白果內(nèi)酯可通過抑制NADPH 氧化酶-ROS途徑來抑制神經(jīng)元NLRP-1 炎癥小體激活，從而減輕Aβ25-35誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷。

本實驗研究的創(chuàng)新之處在于，首次初步探討了白果內(nèi)酯對Aβ25-35誘導(dǎo)的小鼠海馬神經(jīng)元HT22 細(xì)胞損傷模型的保護作用及其炎性機制，但仍存在諸多不足。臨床和神經(jīng)病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，過度激活的小膠質(zhì)細(xì)胞會導(dǎo)致神經(jīng)毒性，它們是氧化應(yīng)激和炎性因子的重要來源。體外實驗也已證實Aβ 可上調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞前體炎性介質(zhì)的表達，而趨化因子釋放增多則可導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞活化。Aβ 形成后既可直接產(chǎn)生神經(jīng)細(xì)胞毒性作用，又可通過激活神經(jīng)系統(tǒng)中的膠質(zhì)細(xì)胞釋放炎性介質(zhì)如ROS、蛋白水解酶、NO 等，對鄰近的神經(jīng)元產(chǎn)生殺傷作用，同時細(xì)胞因子介導(dǎo)的炎性反應(yīng)又可以促進Aβ 前體蛋白（β-mayloid precursor protein，APP）代謝為Aβ，形成惡性循環(huán)［12-15］。因此，白果內(nèi)酯是否還可通過抑制Aβ 誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥小體激活來發(fā)揮神經(jīng)保護作用及其機制將有待進一步研究。