楊坤寶 ，龐宗然，尹長(zhǎng)江，白穎慧，魯碧楠，于 寧，韓桂艷

（1.中央民族大學(xué)藥學(xué)院，北京 100081；2.承德醫(yī)學(xué)院，河北 承德 067000；3.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，河北 承德 067000）

2017 年底，國(guó)際糖尿病聯(lián)盟公布了第八版全球糖尿病地圖。全球糖尿病（Diabetes Mellitus，DM）成人患者（20～79 歲）到2017 年已達(dá)到4.25 億，預(yù)計(jì)到2045 年，糖尿病患者可能達(dá)到6.42 億。其中我國(guó)患病人口最多，高達(dá)1.144 億［1］。而糖尿病腎?。―iabetic Nephropathy，DN）作為糖尿病最常見(jiàn)微血管并發(fā)癥，目前已成為導(dǎo)致終末期腎?。‥nd-stage renal disease，ESRD）的最主要原因之一［2］。北大醫(yī)院最新統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，我國(guó)DN 已經(jīng)超過(guò)了腎小球腎炎相關(guān)慢性腎臟病，成為ESRD 的首要病因，估計(jì)患病人數(shù)已達(dá)2 400 萬(wàn)［3］。目前臨床治療糖尿病腎病多以控制血糖、血壓為主，但并不能完全阻止其進(jìn)展。因此，深入研究糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制并尋找新的天然藥物，對(duì)于減緩該疾病發(fā)生發(fā)展具有重要意義。

藏藥灰兜巴又名灰蔸巴、閉口袋，為地蛛科地蛛屬卡氏地蛛（Atypus karschiDoenitz）在老茶樹(shù)根部所筑的巢穴，具有益氣健脾、滋補(bǔ)腎陰之功效，在四川峨眉山地區(qū)被世代相傳，用于糖尿病及其并發(fā)癥的治療［4］。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，灰兜巴可改善糖尿病腎病大鼠腎組織病理學(xué)及足細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變，減少足細(xì)胞丟失，降低蛋白尿。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF 級(jí)健康雄性SD 大鼠32 只，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（京）2016-0011，5 周齡，體質(zhì)量120～140 g。飼養(yǎng)環(huán)境恒溫22～24 ℃，相對(duì)濕度50%～60%，12 h/12 h 晝夜更替，本實(shí)驗(yàn)經(jīng)承德醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)許可（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審查批號(hào)201712-007）。

1.2 藥物與試劑 灰兜巴產(chǎn)于四川省峨眉山市雙福鎮(zhèn)，6 月中下旬采摘，曬制，經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)李欣教授鑒定為正品，二甲雙胍（1，1-二甲基雙胍鹽酸鹽含有量98.8%，批號(hào)H20103205）由石家莊市普力制藥有限公司饋贈(zèng)；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）（貨號(hào)S0130）購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；尿微量白蛋白（mAlb）測(cè)定試劑盒（貨號(hào)E038-1-1）、尿肌酐（Ucr）測(cè)定試劑盒（貨號(hào)C011-1-1）購(gòu)自南京建成生物工程研究所；PASM 染色試劑盒（貨號(hào)G1059）購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司；β-actin 鼠單克隆抗體（貨號(hào)AF0003）、蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物（通用型，50X，貨號(hào)P1045）、預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)（19-117kD，貨號(hào)P0066）、RIPA 裂解液（強(qiáng)，貨號(hào)P0013B）、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（增強(qiáng)型，貨號(hào)P0010）、SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒（貨號(hào)P0 012 A）、BeyoECL Plus（超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒）（貨號(hào)P0018）、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（5X）（貨號(hào)P0015）、PVDF 膜（0.45 μm，26.5 cm×3.75 m，貨號(hào)IPVH00010）均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；Nephrin（B-12）小鼠單克隆抗體（貨號(hào)sc-377246）購(gòu)自美國(guó)圣克魯斯生物技術(shù)有限公司；山羊抗小鼠IGG（H＆L）二抗（CY3 標(biāo)記，貨號(hào)GB21301）、DAPI 染色試劑（貨號(hào)G1012）購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司；50%葡萄糖（武漢市福星生物藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H42022230）。

1.3 儀器 高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 公司）；BK200 全自動(dòng)生化分析儀（山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司）；ES 自動(dòng)組織脫水機(jī)（美國(guó)Thermo公司）；Histocentre 3 組織包埋機(jī)（美國(guó)Thermo 公司）；RM 2125 輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)（德國(guó)Leica 公司），TK-218 型恒溫?cái)偲酒瑱C(jī)（湖北泰維醫(yī)療科技有限責(zé)任公司）；MDF-U4086 超低溫冰箱（日本三洋公司）；Eclipse Ti-SR 倒置熒光顯微鏡（日本Nikon公司）；DS-Ri1-U3 數(shù)碼顯微成像系統(tǒng)（日本Nikon公司）；SDS-PAGE 電泳儀（北京六一廠）；轉(zhuǎn)膜儀（北京六一廠）；Tanon-5200 化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（天能科技有限公司）；HT7700 型透射電子顯微鏡（日本Hitachi 公司）；強(qiáng)生穩(wěn)豪倍易型血糖儀［強(qiáng)生（中國(guó)）醫(yī)療器材有限公司］。

2 方法

2.1 藥物制備 灰兜巴水提物制備，根據(jù)當(dāng)?shù)赜盟幏绞?，總結(jié)灰兜巴制備工藝參數(shù)［4］，并結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果，委托承德頸復(fù)康藥業(yè)集團(tuán)有限公司加工制備。取灰兜巴10 kg，分別加入藥材量10、9、9 倍量的水，藥材浸泡 2 h，沸騰回流（100 ℃）提取3 次，2 h/次；收集提取液，70 ℃減壓濃縮至適當(dāng)?shù)南鄬?duì)密度（1.02），放至室溫，加入乙醇至乙醇濃度為80%，4 ℃醇沉12 h，過(guò)100 目篩，收集水提醇沉部分，真空減壓干燥得灰兜巴水提醇沉物，本次灰兜巴生藥提取率為2.54%。冰上配置1% STZ（10 mg STZ 溶于1 mL檸檬酸檸檬酸鈉緩沖液）后用錫紙包裹，并在15 min內(nèi)使用。

2.2 糖尿病腎病模型制備 SD 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)選取8 只進(jìn)入對(duì)照組并飼以SPF 級(jí)大鼠維持飼料（定義為0 周），其余大鼠以高脂高糖飼料（66.5%大小鼠維持飼料+10% 豬油+20% 蔗糖+2.5%膽固醇+1%膽酸鈉）喂養(yǎng)，6 周后禁食不禁水4 h，一次性腹腔注射1% STZ（65 mg/kg），對(duì)照組注射等體積溶媒。注射1 周后禁食不禁水12 h，進(jìn)行口服葡萄糖耐量試驗(yàn)（oral glucose tolerance test，OGTT），50% 葡萄糖備用，用于低血糖昏迷灌胃搶救。以空腹血糖（Fasting blood glucose，F(xiàn)BG）≥11.1 mmol/L［5-7］，OGTT 實(shí) 驗(yàn)AUC 升高2 倍，視為造模成功。采用隨機(jī)數(shù)字表法將造模成功大鼠分為模型組（n＝8），二甲雙胍組（n＝8），灰兜巴組（n＝8）。

2.3 給藥 課題組前期糖尿病腎病大鼠動(dòng)物預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)合灰兜巴當(dāng)?shù)赜盟幜吭O(shè)計(jì)灰兜巴水提物凍干粉高、中、低劑量組，其中以高劑量組（180 mg/kg）效果最為明顯，確定灰兜巴組給藥劑量（180 mg/kg）。參考魏偉主編第4 版《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》，按種屬間體表面積換算大鼠二甲雙胍等效劑量為45 mg/kg。用0.5% 羥甲基纖維素鈉（CMC-Na）混懸灰兜巴水提醇沉物凍干粉和二甲雙胍粉末，按1 mL/100 g 灌胃給藥。對(duì)照組和模型組每天于固定時(shí)間灌胃等體積0.5% CMC-Na，灌胃6 d，休息1 d，如此連續(xù)干預(yù)6 周。

2.4 給藥前后OGTT 實(shí)驗(yàn) 分別于藥物干預(yù)前（第7 周）和藥物干預(yù)后（第13 周）進(jìn)行OGTT實(shí)驗(yàn)。禁食不禁水12 h，50% 葡萄糖溶液（2 g/kg）灌胃，并于0、30、60、90、120 min，用強(qiáng)生穩(wěn)豪血糖儀測(cè)尾尖血糖。根據(jù)近似梯形面積計(jì)算AUC（mmol/L·h）＝［（BG0+BG30）×0.5/2］+［（BG30+BG60）×0.5/2］+［（BG60+BG90）×0.5/2］+［（BG90+BG120）×0.5/2］（BG 分別代表糖負(fù)荷后各時(shí)間點(diǎn)的血糖值）。

2.5 全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)藥物干預(yù)前后尿液mAlb/Ucr 分別于藥物干預(yù)前后用代謝籠收集大鼠24 h 尿液，期間自由飲食。取1 mL 尿液于1.5 mL離心管中，4 ℃下2 000 r/min 離心10 min，取上清，全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)mAlb、Ucr，并計(jì)算二者比值。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，腹腔注射氯胺酮（10 mg/100 g）麻醉大鼠，脫頸椎法處死大鼠，剖腹取出腎臟，一側(cè)用于組織病理學(xué)及超微結(jié)構(gòu)觀察，另一側(cè)切小塊后-80 ℃保存。

2.6 腎臟組織PASM 染色 4 ℃預(yù)冷生理鹽水沖洗腎臟組織后投入10% 福爾馬林中性固定液固定48 h，經(jīng)充分流水沖洗，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋。常規(guī)病理切片，厚度約4 μm，脫蠟至水，高碘酸染色，烏洛托品儲(chǔ)備液孵育染色，顯色以腎小球毛細(xì)血管基膜呈黑色為準(zhǔn)，硫代硫酸鈉處理，復(fù)染伊紅，脫水封片，光鏡下觀察腎臟組織病理學(xué)改變。

2.7 Western blot腎組織勻漿液，4 ℃下7 500 r/min離心5 min，棄上清液。加PBS 溶液重復(fù)清洗2～3 次至組織無(wú)血色，按說(shuō)明加入RIPA 裂解液（150～250 μL/20 mg），4 ℃下10 000 r/min離心20 min，取上清，按BCA 蛋白質(zhì)定量試劑盒操作測(cè)定蛋白濃度。經(jīng)煮蛋白、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，用TBST 溶液稀釋一抗，4 ℃孵育過(guò)夜。TBST溶液洗膜后，加入與一抗對(duì)應(yīng)來(lái)源的二抗室溫慢搖孵育2 h，再用TBST 溶液洗膜，ECL 發(fā)光液進(jìn)行顯色，化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)曝光。以β-actin 為內(nèi)參分析Nephrin 蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2.8 免疫熒光分析 腎組織石蠟切片約4 μm 厚，脫蠟至水，用EDTA 抗原修復(fù)緩沖液（pH ＝8.0）于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)，自發(fā)熒光淬滅，3%BSA 封閉。按說(shuō)明書(shū)加入Nephrin 一抗（1∶100），4 ℃孵育過(guò)夜。再加入與一抗相應(yīng)種屬的二抗，即山羊抗小鼠IGG（H＆L）二抗（CY3 標(biāo)記），抗熒光淬滅封片劑封片，于尼康倒置熒光顯微鏡下采集圖像。

2.9 透射電鏡觀察腎臟超微結(jié)構(gòu) 腎臟組織修成1 mm3小塊；3.1%戊二醛于4 ℃冰箱內(nèi)固定2 h，1%鋨酸后固定1 h，常規(guī)電鏡樣品包埋；半薄切片，光鏡下定位選區(qū)；超薄切片，片厚60 nm，醋酸雙氧鈾及檸檬酸鉛雙重染色，透射電子顯微鏡觀察腎臟超微結(jié)構(gòu)改變。校準(zhǔn)后，選至少30 個(gè)點(diǎn)測(cè)量腎小球基底膜內(nèi)層到外層的垂直距離，計(jì)算平均腎小球基底膜厚度（thickness of glomerular basement membrane，TGBM）。

2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行分析。分析前進(jìn)行數(shù)據(jù)正態(tài)性分布和方差同質(zhì)性檢驗(yàn)，方差齊則采用單因素方差分析；方差不齊或非正態(tài)，采用秩和檢驗(yàn)；對(duì)OGTT 重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)資料采用多因素方差分析；并采用LSD 法對(duì)多個(gè)樣本均數(shù)進(jìn)行兩兩比較。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以（）表示，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 藥物干預(yù)前后OGTT 分析 藥物干預(yù)前，與對(duì)照組比較，模型組、二甲雙胍組和灰兜巴組大鼠AUC 升高（P＜0.01）；二甲雙胍組和灰兜巴組AUC 與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。藥物干預(yù)后，灰兜巴和二甲雙胍均可改善糖尿病腎病大鼠空腹葡萄糖耐量受損情況，二甲雙胍組、灰兜巴組AUC 低于模型組（P＜0.01）。見(jiàn)圖1。

圖1 藥物干預(yù)前后OGTT 分析及AUC 比較（n=8）Fig.1 OGTT analysis and AUC comparison before and after medication（n=8）

3.2 給藥前后mAlb/Ucr 比較 藥物干預(yù)前，與對(duì)照組比較，模型組大鼠尿液 mAlb/Ucr 升高（P＜0.01）；二甲雙胍組和灰兜巴組mAlb/Ucr 與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。藥物干預(yù)后，二甲雙胍組和灰兜巴組mAlb/Ucr 低于模型組（P＜0.01），且灰兜巴組mAlb/Ucr 低于二甲雙胍組（P＜0.01），見(jiàn)圖2。

圖2 給藥前后mAlb/Ucr 比較（n=8）Fig.2 Comparison of mAlb/Ucr before and after medication（n=8）

3.3 PASM 染色觀察腎組織病理改變 腎組織石蠟切片經(jīng)PASM 染色后，腎小球基底膜IV 膠原鍍銀呈黑色。模型組可見(jiàn)明顯腎小球管叢系膜擴(kuò)張伴基底膜增生?；叶蛋秃投纂p胍可明顯減輕腎小球病理改變（圖3）。

3.4 腎組織Nephrin 蛋白表達(dá) Western blot 結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組足細(xì)胞標(biāo)志蛋白Nephrin 表達(dá)下降（P＜0.01），灰兜巴和二甲雙胍可減輕模型大鼠足細(xì)胞Nephrin 下降情況（P＜0.05，P＜0.01），且灰兜巴組Nephrin 蛋白表達(dá)高于二甲雙胍組（P＜0.01），見(jiàn)圖4。

3.5 腎組織足細(xì)胞Nephrin 熒光檢測(cè) 為驗(yàn)證Nephrin 蛋白表達(dá)結(jié)果，進(jìn)行腎組織石蠟切片免疫熒光檢測(cè)，觀察腎小球足細(xì)胞丟失情況。免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，模型組大鼠腎小球足細(xì)胞標(biāo)志蛋白Nephrin（CY3 標(biāo)記）表達(dá)明顯減少?；叶蛋秃投纂p胍組可明顯減輕足細(xì)胞Nephrin 下降情況（圖5）。

圖3 PASM 染色觀察腎小球組織病理改變（×400）Fig.3 Pathological changes examined by PASM staining（×400）

圖4 腎組織Nephrin 蛋白表達(dá)（n=3）Fig.4 Protein expression of Nephrin in kidney（n=3）

圖5 腎組織Nephrin 免疫熒光檢測(cè)（×200）Fig.5 Expression of Nephrin by immunofluorescence assay（×200）

3.6 透射電鏡觀察腎小球超微結(jié)構(gòu) 利用透射電子顯微鏡觀察足細(xì)胞和腎小球基底膜超微結(jié)構(gòu)改變情況，進(jìn)一步驗(yàn)證足細(xì)胞標(biāo)志蛋白Nephrin 表達(dá)結(jié)果。對(duì)照組腎小球基底膜清晰，足細(xì)胞形態(tài)完整；模型組腎小球基底膜不規(guī)則增厚，足突廣泛融合，足細(xì)胞可見(jiàn)明顯線粒體嵴斷裂或空泡化；灰兜巴和二甲雙胍可明顯改善腎小球基底膜增厚和足細(xì)胞足突融合情況（圖6）。TGBM 測(cè)量結(jié)果進(jìn)一步為上述觀察提供佐證，與對(duì)照組比較，模型組TGBM增厚（P＜0.01）；灰兜巴組和二甲雙胍組可改善TGBM 增厚情況，灰兜巴組TGBM 低于模型組和二甲雙胍組（P＜0.01），見(jiàn)圖7。

圖6 電鏡觀察腎小球超微結(jié)構(gòu)改變（×12 500）Fig.6 Ultrastructure changes under TEM（×12 500）

圖7 腎小球平均基底膜厚度（n=3）Fig.7 Mean thickness of glomerular basement membrane（n=3）

4 討論

現(xiàn)有研究報(bào)道多采用尾尖采血測(cè)空腹血糖或隨機(jī)血糖作為成功造模判定標(biāo)準(zhǔn)［8-9］，但課題組預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)造模后大鼠血糖不穩(wěn)定，存在造模成功，但檢測(cè)時(shí)可能因發(fā)生低血糖反應(yīng)，而未被檢測(cè)出高血糖的情況；或造模不成功，存在一過(guò)性高血糖而被判定為造模成功的情況，因此單獨(dú)以此為標(biāo)準(zhǔn)判定成模與否缺乏嚴(yán)謹(jǐn)性。本研究將空腹血糖檢測(cè)結(jié)果與OGTT 分析結(jié)果結(jié)合起來(lái)，以空腹血糖大于11.1 mmol/L，且OGTT 時(shí)間-血糖曲線下面積升高2 倍，作為造模成功判定標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，灰兜巴組AUC 仍高于對(duì)照組，說(shuō)明灰兜巴組大鼠仍存在2 h 葡萄糖耐量受損的情況。

有研究表明，在糖尿病腎病早期即出現(xiàn)不同程度足細(xì)胞損傷，因此，足細(xì)胞損傷在該疾病發(fā)病中的重要作用倍受關(guān)注［10-11］。足細(xì)胞即腎小球臟層上皮細(xì)胞，附著于腎小球基底膜外側(cè)，參與構(gòu)成腎小球?yàn)V過(guò)膜的最后一道屏障。Nephrin 為足細(xì)胞裂孔隔膜的主要成分，在糖尿病腎病患者中其表達(dá)明顯下降，且下降程度與蛋白尿的進(jìn)展呈正相關(guān)［12］。檢測(cè)尿液mAlb/Ucr 發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎病大鼠發(fā)生大量蛋白尿（＞30 μg/mg），課題組通過(guò)Western blot法和免疫熒光法檢測(cè)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，大鼠腎小球Nephrin 表達(dá)明顯減少，提示存在足細(xì)胞丟失，而灰兜巴可明顯減輕糖尿病腎病大鼠腎小球足細(xì)胞丟失情況，透射電鏡觀察結(jié)果與此相互印證。

更有趣的是，在透射電鏡觀察中發(fā)現(xiàn)模型組大鼠存在明顯的線粒體嵴消失或空泡化。而新近研究表明，線粒體動(dòng)力學(xué)在2 型糖尿病及其血管并發(fā)癥中起著至關(guān)重要的作用，線粒體動(dòng)力學(xué)失衡可致線粒體功能障礙，ATP 合成減少，線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）減少，線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）丟 失，最終以線粒體凋亡通路致足細(xì)胞凋亡，加速糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展［13-14］。強(qiáng)烈提示高糖環(huán)境所誘發(fā)的足細(xì)胞線粒體動(dòng)力學(xué)失衡是否為導(dǎo)致足細(xì)胞凋亡、丟失的始動(dòng)因素？ 這將為下一步從源頭上挖掘灰兜巴發(fā)揮糖尿病腎病保護(hù)作用機(jī)制提供有價(jià)值線索。

此外，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，灰兜巴降糖效果雖然不如二甲雙胍療效顯著，但其對(duì)糖尿病腎病大鼠的腎臟保護(hù)作用明顯優(yōu)于二甲雙胍。中醫(yī)理論認(rèn)為，糖尿病腎臟病屬于“消渴病-下消”范疇，消渴失治或治之不當(dāng)，則致氣陰兩虛，脾腎兩虛，日久則致氣血陰陽(yáng)俱虛，腎絡(luò)瘀結(jié)、濁毒內(nèi)停。臨床治療早期糖尿病腎病以益氣養(yǎng)陰療效較好［15］，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果將進(jìn)一步為臨床應(yīng)用益氣養(yǎng)陰藏藥灰兜巴治療糖尿病腎病提供可靠實(shí)驗(yàn)依據(jù)。