錢葉飛 陸林玲 張華鋒 周 堅(jiān)

（蘇州市藥品檢驗(yàn)檢測研究中心， 江蘇 蘇州215104）

小兒咳喘靈顆粒是由金銀花、麻黃、板藍(lán)根、甘草、苦杏仁、石膏、瓜蔞7 味藥材組成的中藥復(fù)方制劑，具有止咳祛痰、宣肺清熱的功效，臨床上廣泛用于治療上呼吸道感染及其引起的咳嗽等病癥，是兒科常用中成藥之一［1-4］，但其現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅檢測綠原酸或鹽酸麻黃堿單一成分的含有量［5-6］，過于簡單，而且方法也不統(tǒng)一。目前，大多數(shù)文獻(xiàn)［7-11］采用HPLC 法分析小兒咳喘靈顆粒中主要成分，為了節(jié)約時(shí)間與成本，加快檢驗(yàn)進(jìn)度，本實(shí)驗(yàn)建立UPLC 法同時(shí)測定其中板藍(lán)根活性成分（R，S）-告依春、金銀花活性成分綠原酸、苦杏仁活性成分苦杏仁苷、甘草活性成分甘草苷和甘草酸的含有量，以期為該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Waters Acquity H-Class UPLC 超高效液相色譜儀，配置二極管陣列檢測器（PDA）、Empower 3化學(xué)工作站（美國Waters 公司）；電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；Millipore Synergy超純水機(jī)（美國密理博公司）。

1.2 試劑與藥物（R，S）-告依春、甘草苷、苦杏仁苷、綠原酸（批號分別為111753-201706、111610-201607、110820-201607、110753-201716，純度分別為93.1%、90.7%、99.3%）對照品均購于中國食品藥品檢定研究院；甘草酸（批號MUST-17060805，純度99.65%）對照品購于成都曼思特生物科技有限公司。36 批小兒咳喘靈顆粒來自全國11個(gè)廠家。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Waters Acquity UPLC HSS T3色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動相乙腈（A）-0.1% 磷酸（B），梯度洗脫，程序見表1；體積流量0.3 mL/min；柱溫35 ℃；檢測波長207 nm（苦杏仁苷）、237 nm［（R，S）-告依春、綠原酸、甘草苷、甘草酸］；進(jìn)樣量1 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 分別精密稱取（R，S）-告依春、甘草酸、甘草苷、苦杏仁苷、綠原酸對照品10.83、9.27、10.88、11.80、10.07 mg，置 于10 mL量瓶中，50%甲醇定容至刻度，作為貯備液（質(zhì)量濃度分別為1.083 0、0.923 8、1.012 9、1.070 3、1.000 0 mg/mL）。各精密吸取2 mL，置于20 mL 量瓶中，50%甲醇定容至刻度，即得（質(zhì)量濃度分別為108.300 0、99.995 1、92.375 6、101.292 8、107.026 0 μg/mL）。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution programs

2.2.2 供試品溶液 取顆粒適量，研磨成細(xì)粉后精密稱取2.0 g，置于20 mL 量瓶中，加入15 mL 50%甲醇超聲（250 W、33 kHz）處理30 min，放冷至室溫，50%甲醇定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按照顆粒處方比例和制備工藝，分別制備缺板藍(lán)根、缺苦杏仁、缺甘草、缺金銀花的陰性樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.3 專屬性試驗(yàn) 精密吸取對照品、供試品、陰性樣品溶液各1 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖1。由此可知，各成分色譜峰分離度理想，表明該方法專屬性良好。

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下對照品溶液0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mL，置于10 mL 量瓶中，50%甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，結(jié)果見表2，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一份供試品溶液（批號170908），在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6 次，測得（R，S）-告依春、綠原酸、甘草苷、甘草酸、苦杏仁苷峰面積RSD 分別為0.63%、0.55%、0.07%、0.79%、0.12%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一份供試品溶液（批號170908），于0、6、12、18、24 h 在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得（R，S）-告依春、綠原酸、甘草苷、甘草酸、苦杏仁苷峰面積RSD分別為2.37%、1.78%、0.64%、1.86%、2.29%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

圖1 各成分UPLC 色譜圖Fig.l UPLC chromatograms of various constituents

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批顆粒（批號170908）6 份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備6 份供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得（R，S）-告依春、綠原酸、甘草苷、甘草酸、苦杏仁苷峰面積RSD 分別為0.47%、0.98%、0.14%、0.95%、0.24%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取各成分含有量已知的同一批顆粒（批號170908）6 份，每份約1 g，精密稱定，精密加入適量對照品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表3。

2.9 耐用性試驗(yàn) 本實(shí)驗(yàn)考察了Waters Acquity BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）、Waters Acquity HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）色譜柱，發(fā)現(xiàn)各成分均能達(dá)到比較理想的分離效果，表明該方法耐用性良好。

2.10 樣品含有量測定 取11 個(gè)廠家生產(chǎn)的36 批樣品，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算含有量，結(jié)果見表4。

3 討論

3.1 檢測指標(biāo)篩選 麻黃為小兒咳喘靈顆粒君藥，對制劑宣肺止咳的功效發(fā)揮著關(guān)鍵作用，但其主要成分麻黃堿和偽麻黃堿具有揮發(fā)性，提取方法與其他成分不同，而且普通的C18色譜柱對兩者分離效果不佳［12-13］，故今后課題組將對相關(guān)質(zhì)量評價(jià)方法進(jìn)行改進(jìn)。另外，方中石膏、瓜蔞主要成分尚不明確，也未納入研究。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇板藍(lán)根、苦杏仁、甘草、金銀花所含主要成分作為檢測指標(biāo)。

3.2 檢測波長篩選 本實(shí)驗(yàn)采用二極管陣列檢測器在200～400 nm 波長處進(jìn)行掃描，并結(jié)合2015年版《中國藥典》，以物質(zhì)吸收大小和與其他色譜峰分離度為指標(biāo)，最終確定為207、237 nm 雙波長檢測。

表3 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.3 Results of recovery tests for various constituents（n=6）

表4 各成分含有量測定結(jié)果（mg/g）Tab.4 Results of content determination of various constituents（mg/g）

3.3 供試品溶液提取方法篩選 根據(jù)文獻(xiàn)［14］報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)考察了提取溶劑30% 甲醇、50% 甲醇、70%甲醇，溶劑用量10、20、30、50 mL，提取時(shí)間15、30、45 min 對各成分提取效果的影響。最終確定，最優(yōu)供試品溶液提取方法為20 mL 50%甲醇提取30 min。

3.4 含有量分析 36 批小兒咳喘靈顆粒中（R，S）-告依春、綠原酸、甘草苷、甘草酸、苦杏仁苷最高含有量分別是最低含有量的9.67、60.72、23.22、22.49、88.89 倍。由此可知，不同廠家和同一廠家不同批次生產(chǎn)的樣品中各成分含有量差異均較大，質(zhì)量參差不齊，可能與藥材產(chǎn)地、采收季節(jié)、生產(chǎn)工藝等因素有關(guān)，具體原因有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立的UPLC 法能在30 min 內(nèi)同時(shí)測定小兒咳喘靈顆粒中（R，S）-告依春、綠原酸、甘草苷、甘草酸、苦杏仁苷的含有量，而且簡便準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可提高檢驗(yàn)效率，全面評價(jià)該制劑質(zhì)量，從而為完善其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。