馮倩，劉憲，張妮，崔南

0 引言

宮頸癌是一種嚴重威脅女性健康和生命的生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一。在全球范圍內(nèi)，宮頸癌是次于乳腺癌和結(jié)直腸癌的女性第四種常見的腫瘤類型[1]。己糖激酶2（Hexokinase 2,HK2）是己糖激酶（Hexokinase,HK）同工酶的一種，是糖酵解途徑中的一個關(guān)鍵酶，低氧狀態(tài)、葡萄糖、胰島素等因素均可上調(diào)HK2在腫瘤細胞中的表達，目前的研究發(fā)現(xiàn)HK2在膠質(zhì)瘤、胃癌、結(jié)直腸癌等腫瘤中高表達，其表達水平與腫瘤的惡性程度密切相關(guān)[2]。HK2與線粒體外膜結(jié)合后，通過促進異常糖酵解，可以抑制細胞凋亡從而促進腫瘤細胞增殖[3]。但HK2通過Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)宮頸癌細胞生物學(xué)行為的研究仍不多見。因此，本研究通過觀察HK2對宮頸癌HeLa細胞增殖、細胞活力、細胞周期、遷移和侵襲等生物學(xué)行為的影響，探討HK2通過Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中相關(guān)蛋白的表達，從而促進宮頸癌細胞增殖和遷移的分子機制，為宮頸癌的治療探索新的路徑。

1 材料與方法

1.1 材料

宮頸癌細胞系HeLa購自美國ATCC。質(zhì)粒表達載體pCAG-IRES2-AcVEC-neo由本實驗室保存。DMEM培養(yǎng)基購自上海源培生物科技有限公司，胎牛血清購自以色列Biological Industries公司，Slug蛋白抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，HK2、β-catenin、Cyclin D1、MMP7和GAPDH蛋白抗體均購自美國Santa Cruz公司,Wnt/β-catenin信號通路抑制劑（XAV-939）購自美國Selleck公司，其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人宮頸癌細胞HeLa培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于5%CO2的37℃孵箱中進行常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2 G418壓力篩選穩(wěn)定表達HK2蛋白的HeLa細胞系 將1×105個細胞接種于6孔板內(nèi)，待細胞生長至70%～80%融合時，將2 μg重組質(zhì)粒DNA通過Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染于細胞中。24 h后，將細胞按照1:10比例接種到100 mm培養(yǎng)皿中，加入含有1 000 mg/ml G418的培養(yǎng)基，G418壓力篩選3～4周后，挑取細胞單克隆至24孔板中，繼續(xù)擴增培養(yǎng)。通過Western blot及細胞免疫化學(xué)實驗，鑒定HK2表達陽性的單克隆細胞。

1.2.3 細胞免疫化學(xué) 將對數(shù)生長期的細胞常規(guī)消化后制備成細胞懸液，接種于0.5 cm×0.5 cm的爬片上，待細胞融合度達到70%左右，PBS液洗滌5 min×3次后，4%多聚甲醛室溫固定30 min。PBS液洗滌5 min×3次，加入0.2%TritonX-100，室溫放置10 min。PBS洗滌5 min×3次后，將細胞爬片粘在載玻片上滴加一抗，4℃濕盒過夜。次日，取出濕盒，室溫放置30 min，PBS洗滌5 min×3次，滴加二抗，室溫放置30 min。PBS洗滌5 min×3次后，DAB顯色，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.4 細胞計數(shù)法檢測細胞增殖 將細胞胰酶消化后制備成單細胞懸液，按照4×104個每皿的濃度接種于6孔板里。接種后1、3、5、7 d分別進行細胞計數(shù)。根據(jù)細胞計數(shù)結(jié)果繪制細胞生長曲線，每組試驗設(shè)置3個復(fù)孔。實驗重復(fù)3次。

1.2.5 MTT法檢測細胞活性 將細胞胰酶消化后制成單細胞懸液，以1×103個每孔濃度接種于96孔培養(yǎng)板中。于接種后1、3、5、7 d，采用MTT法檢測各組OD值。步驟如下：每孔加入20 μl MTT（5 mg/ml），5%CO2培養(yǎng)箱孵育4 h，吸棄上清液，加入100 μl的DMSO，搖床震蕩10 min后于酶標儀上測定490 nm波長吸光度值，根據(jù)吸光度值繪制生長曲線，各實驗組均設(shè)置3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.2.6 細胞周期分析 胰酶消化收集對數(shù)生長期細胞，1 000 r/min離心5 min，用預(yù)冷的PBS液洗滌細胞2次，加入預(yù)冷的70%酒精，4℃冰箱固定細胞12 h。1 000 r/min離心5 min，PBS液洗滌2次。用含0.01% RNase的PI染液100 μl處理細胞，4℃避光染色30 min。使用流式細胞儀進行檢測，通過CellQuest軟件分析結(jié)果。重復(fù)實驗至少3次。

1.2.7 Western blot實驗 收集處于對數(shù)生長期的細胞，加入細胞裂解液收集細胞蛋白，并測定各組細胞的蛋白濃度。將蛋白樣本與蛋白質(zhì)分子量標準分別上樣于加樣孔，進行SDS-PAGE分離蛋白。電泳結(jié)束后，進行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將膜移至含5%的脫脂奶粉的TBST緩沖液中室溫封閉1 h，用TBST洗膜10 min×4次。加入一抗，4℃孵育過夜。次日，TBST洗膜10 min×4次，加二抗，室溫孵育1 h，TBST洗膜10 min×4次，化學(xué)發(fā)光檢測液進行發(fā)光反應(yīng)，Western blot化學(xué)發(fā)光成像一體機（陜西鑫來博生物工程有限公司）拍照分析。

1.2.8 細胞劃痕實驗 將細胞接種于6孔板中生長至90%～95%融合度，用20 μl無菌槍頭劃一橫線，PBS清洗細胞3次，加入無血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用倒置顯微鏡進行觀察及拍照，選取5個視野進行統(tǒng)計分析。

1.2.9 Transwell體外遷移實驗 HeLa細胞饑餓24h后制備成細胞懸液，PBS清洗1遍后，調(diào)整細胞濃度為每毫升20×105個。將200 μl細胞懸液加入于Transwell上室，下室中加入600 μl的含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，之后置于含5%CO2的37℃孵箱中進行孵育。24 h后，用棉簽擦去上室內(nèi)殘留的細胞，甲醛固定10 min后，用0.1%的結(jié)晶紫室溫孵育10 min，PBS清洗3遍后，將Transwell小室底面朝上于顯微鏡下拍照觀察，隨機選取5～10個視野進行計數(shù)，進行統(tǒng)計分析，重復(fù)上述實驗3次。

1.2.10 Transwell體外侵襲實驗 Transwell上室中平鋪1:3的Matrigel膠50 μl，紫外燈照射消毒6 h后，將200 μl的細胞懸液加入Transwell上室，下室中加入600 μl的含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，后續(xù)步驟同體外遷移實驗。

1.2.11 抑制Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在HK2過表達HeLa細胞中的活性 Wnt/β-catenin信號通路抑制劑XAV-939按照說明書溶于DMSO，XAV-939工作濃度參考本實驗室前期使用濃度，以80 μmol/L為本研究工作濃度開展后續(xù)實驗[4]。將細胞培養(yǎng)液更換為含XAV-939培養(yǎng)液后，分別于培養(yǎng)1、3、5、7天進行細胞計數(shù)和MTT。將Transwell小室內(nèi)外細胞培養(yǎng)液更換為含XAV-939的DMEM培養(yǎng)液后，進行Transwell體外遷移和侵襲實驗，孵育48 h后記錄結(jié)果；收集經(jīng)過XAV-939培養(yǎng)液培養(yǎng)的細胞（孵育24 h后），加入細胞裂解液收集細胞蛋白，通過Western blot檢測相關(guān)蛋白表達。

1.2.12 TOP/FOP螢火蟲熒光素酶報告系統(tǒng)實驗（TOP/FOP-Flash Luciferase reporter assay） 取對數(shù)生長期的各組細胞，0.25%胰酶消化重懸為單細胞懸液，以5×104個/孔細胞濃度接種于24孔板。將TOP/FOP-Flash報告基因質(zhì)粒與內(nèi)參載體海參（pRL-TK）報告基因質(zhì)粒按照LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染系統(tǒng)說明操作分別共轉(zhuǎn)染于HeLa-VEC和HeLa-Slug細胞。轉(zhuǎn)染48 h 后，按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒操作說明檢測熒光素酶活性：棄去24孔板中的培養(yǎng)基，加入PBS，輕輕洗滌細胞后棄去洗滌液，加入100 μl的1×PLB細胞裂解液裂解細胞，將細胞懸液移入1.5 ml EP管，待測。取待測樣品20 μl加入EP管中，然后加入100 μl熒光素酶測試試劑LARⅡ吹打混合后，放入發(fā)光檢測儀中檢測螢火蟲熒光素酶活性，記錄第一次發(fā)光值為FLU。加入等體積的1×Stop &GloTM試劑，輕輕混勻，放入發(fā)光檢測儀中檢測Renilla熒光素酶活性，記錄第二次發(fā)光值為RLU。以FLU/RLU比值評估TOP/FOP-Flash報告基因的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

用SPSS17.0軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)分析，實驗數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)±標準差（）表示，多組樣本間的均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩組樣本間的均數(shù)比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 HK2對宮頸癌HeLa細胞的影響Figure 1 Effect of HK2 on HeLa cells

2 結(jié)果

2.1 HK2促進HeLa細胞的體外增殖和細胞活力

Western blot結(jié)果顯示，經(jīng)過G418壓力篩選后，成功獲得了穩(wěn)定表達HK2蛋白的HeLa-HK2-5、HeLa-HK2-9及對照細胞HeLa-VEC-1和HeLa-VEC-2細胞系，見圖1A。通過繪制細胞生長曲線，發(fā)現(xiàn)過表達HK2可以促進HeLa細胞的增殖（P=0.0054），見圖1B。MTT法檢測結(jié)果顯示，過表達HK2可以增強HeLa細胞的細胞活力（P=0.0078），見圖1C。細胞計數(shù)和MTT實驗均表明，過表達HK2可以促進宮頸癌細胞HeLa的體外增殖。

流式細胞儀分析結(jié)果顯示，HeLa細胞中過表達HK2后，HeLa-HK2細胞中處于G0/G1的細胞百分比為（45.46±3.43）%，明顯低于HeLa-VEC細胞（57.75±1.03）%（P=0.0092），HeLa-HK2細胞中處于S期的細胞百分比為（38.02±2.31）%，明顯高于HeLa-VEC細胞（26.62±3.49）%（P=0.0091），見圖1D。這些結(jié)果表明，在HeLa細胞中過表達HK2可以促進細胞周期從G1期向S期轉(zhuǎn)換。

2.2 HK2促進HeLa細胞的體外遷移和侵襲

細胞劃痕實驗結(jié)果顯示，在觀察48 h時，HeLa-HK2中細胞劃痕的愈合速度快于HeLa-VEC細胞（P=0.0045），見圖2A。Transwell體外遷移實驗結(jié)果顯示，過表達HK2后，每個視野下穿過Transwell小室的細胞數(shù)量（249.33±21.78）多于HeLa-VEC細胞數(shù)量（147.67±8.51），P=0.0017，見圖2B。Transwell體外侵襲實驗結(jié)果表明，過表達HK2后，每個視野下穿過Transwell小室的細胞數(shù)量（118.34±10.69）多于HeLa-VEC細胞（45.11±10.34），P=0.015，見圖2C。這些結(jié)果提示過表達HK2后可以增強HeLa細胞體外遷移和侵襲的能力。

2.3 HK2通過Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上調(diào)Cyclin D1、MMP7和Slug蛋白表達

Western blot和免疫細胞化學(xué)檢測結(jié)果表明，過表達HK2后，可以顯著上調(diào)β-catenin、Cyclin D1、MMP7和Slug蛋白在HeLa細胞中的表達（P＜0.05），見圖3A、B。螢火蟲熒光素酶（TOP/FOP）實驗結(jié)果也證實，過表達HK2后可增強Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活性（P=0.025），見圖3C。

2.4 抑制Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活性可以消除HK2對HeLa細胞增殖及遷移的影響

在HK2過表達HeLa細胞中添加Wnt/β-catenin信號通路抑制劑（XAV-939）后，可以顯著抑制β-catenin及Wnt/β-catenin信號通路下游蛋白Cyclin D1、MMP7和Slug在HeLa-HK2細胞中的表達（P＜0.05），見圖4A。細胞計數(shù)和MTT實驗表明，XAV-939可以抑制HeLa-HK2細胞的增殖（P=0.0095）和細胞活力（P=0.0083），見圖4B～C。Transwell體外遷移和侵襲實驗的結(jié)果也證實，XAV-939可以抑制HeLa-HK2細胞體外遷移（P=0.0065）和侵襲能力（P=0.0088），見圖4D～E。上述結(jié)果提示，在HeLa-HK2細胞中使用XAV-939抑制Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活性后，可逆轉(zhuǎn)HK2對HeLa細胞增殖、遷移和侵襲的促進作用。

圖2 HK2增強HeLa細胞遷移(A,B) 和侵襲(C)的能力Figure 2 Effect of HK2 on migration(A,B)and invasion(C) abilities of HeLa cells detected by wound-healing assay and Transwell assay

圖3 HK2增強Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活性Figure 3 HK2 enhanced activity of Wnt/β-catenin signaling pathway in HeLa cells

圖4 抑制Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活性可以減弱HK2對HeLa細胞增殖、遷移和侵襲的影響Figure 4 Treating with the Wnt/β-catenin inhibitor XAV-939 inhibited HK2-induced HeLa cell growth,migration and invasion

3 討論

宮頸癌是一種婦科易發(fā)的惡性腫瘤，好發(fā)于20～50歲婦女，近年來宮頸癌的發(fā)病逐漸呈現(xiàn)出年輕化的傾向，其發(fā)展是一個緩慢的、多階段的過程，在多種致癌因素的刺激下，宮頸鱗狀上皮底層細胞增生活躍和分化不良，逐漸形成宮頸上皮的不典型增生，隨著病情的進展，逐漸向鱗狀上皮內(nèi)病變、早期浸潤癌、浸潤癌發(fā)展[5]。

在葡萄糖代謝過程中，葡萄糖被己糖激酶磷酸化，轉(zhuǎn)化為葡萄糖-6-磷酸，可以為腫瘤細胞的快速增殖提供能量支持。HK2被認為參與多種腫瘤細胞的生理過程，如神經(jīng)膠質(zhì)瘤[6]、膠質(zhì)母細胞瘤[7]、結(jié)腸癌[8]和肝細胞癌[9]等，而HK2表達缺失可以抑制細胞增殖、促進細胞凋亡、抑制腫瘤生長。既往研究[10-11]發(fā)現(xiàn)HK2在宮頸癌中呈高表達狀態(tài)，通過PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，可以促進SiHa細胞的增殖和遷移。本研究中，過表達HK2可以顯著促進宮頸癌HeLa細胞的增殖和細胞活力。流式細胞術(shù)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在HeLa-HK2細胞中G0/G1期細胞數(shù)明顯少于HeLa-VEC細胞，S期細胞數(shù)明顯多于HeLa-Vec細胞。上述結(jié)果表明，在HeLa細胞中，HK2通過促進細胞周期從G0/G1期向S期的轉(zhuǎn)換，促進細胞增殖。此外，在HeLa細胞中過表達HK2也可以顯著增強HeLa細胞體外遷移和侵襲的能力。

在腫瘤細胞中，多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與調(diào)節(jié)細胞的增殖、遷移和侵襲，而且糖代謝也與多種細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)。那么HK2能否通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲？本研究中，HK2可以顯著上調(diào)Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中關(guān)鍵蛋白β-catenin在HeLa細胞中的表達。TOP/FOP實驗結(jié)果也證實，HK2可以增強Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在HeLa細胞中的活性。既往研究[12]證實，Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路通過調(diào)節(jié)其下游蛋白的表達，參與腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。本研究進一步發(fā)現(xiàn)，HK2可以上調(diào)Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下游蛋白Cyclin D1、MMP7和Slug的表達。

Cyclin D1作為一種細胞周期調(diào)節(jié)蛋白可以調(diào)節(jié)多種腫瘤細胞的增殖，而MMP7和Slug是上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程中的兩個重要蛋白，參與多種腫瘤細胞EMT進程，促進細胞的遷移和腫瘤的轉(zhuǎn)移[13]。此外，在HK2過表達HeLa細胞中使用Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制劑XAV-939后，可以抑制β-catenin、Cyclin D1、MMP7和Slug蛋白的表達，同時也可以減弱HK2在HeLa細胞中對增殖、遷移和侵襲的促進作用。因此，本研究推測，HK2通過Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上調(diào)Cyclin D1、MMP7和Slug的表達，促進細胞體外增殖、遷移和侵襲。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)HK2高表達可以促進宮頸癌細胞HeLa體外的增殖、遷移和侵襲；HK通過激活Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，可以上調(diào)Cyclin D1表達，促進HeLa細胞的增殖；HK2通過激活Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，可以上調(diào)MMP7和Slug的表達，增強HeLa細胞的體外遷移和侵襲。上述結(jié)果提示HK2通過增強Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活性可以在HeLa細胞中發(fā)揮促進增殖、遷移和侵襲的作用。但HK2作為一種己糖激酶是通過直接還是間接作用調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活性的分子機制仍有待進一步的研究。