鄒 琛 ，徐潤灝 ，張 泓，馬 展，陳 黎，張 潔，李 敏，張舒林

1. 上海交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)與微生物學(xué)系，上海200025; 2. 上海交通大學(xué)附屬兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海200062；3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200127

肺癌是我國發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，也是惡性腫瘤死因的首位[1]。早期診斷和及時(shí)治療是提高肺癌患者生存率的關(guān)鍵。隨著醫(yī)學(xué)影像學(xué)技術(shù)的發(fā)展，肺癌誤診率及漏診率大幅降低，但影像學(xué)檢查仍然有假陽性率高、過度診斷、輻射劑量超標(biāo)等不足[2]。代謝組學(xué)是20 世紀(jì)末發(fā)展建立的一門學(xué)科，其研究對(duì)象大都是相對(duì)分子質(zhì)量小于1 000 的小分子物質(zhì)。體內(nèi)代謝改變廣泛存在于腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞間，以滿足腫瘤自身惡性增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和免疫逃逸的需要[3]。已有研究[4-6]證明，血清醛、酮、醇、氨基酸等人體代謝產(chǎn)物在肺癌患者和健康人群中有著顯著差異，但有關(guān)其診斷效能的研究還較少。本研究通過應(yīng)用代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)肺癌和肺炎患者血清小分子代謝產(chǎn)物進(jìn)行探索，建立、優(yōu)化診斷模型，尋找快速高效的肺癌和肺炎鑒別診斷的新方法。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

納入2018 年4—12 月于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院就診的肺癌組患者95 例和肺炎組患者69 例，醫(yī)院體檢中心健康人群90 例為健康對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：肺癌組患者均已通過組織病理學(xué)檢查確診，且未發(fā)現(xiàn)肝腸轉(zhuǎn)移。肺炎組患者均已排除肺癌可能。肺癌組和肺炎組患者均未并發(fā)肝功能異常、腸道炎癥、膽囊結(jié)石，且未服用免疫抑制劑及氨基酸類藥物。健康對(duì)照組胃腸道功能未見異常，排除高血壓、糖尿病、慢性肝膽疾病及肝腎功能異常。研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)通過，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 樣本前處理 采用含促凝劑的真空采血管，收集空腹靜脈血4 mL，16 169×g 離心10 min，2h 內(nèi)分離血清。在24 h 內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)的樣本冷藏（2 ～8 ℃）保存，24 h 內(nèi)無法測(cè)定的樣本冷凍（-20 ℃及以下）保存。

1.2.2 氨基酸代謝譜檢測(cè) 采用API3200MD 三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀（美國ABSciex 公司）、Shimadzu 系列液相色譜儀（日本島津公司）檢測(cè)。氨基酸代謝譜分析試劑盒（上?？闪γ匪镝t(yī)藥科技有限公司），可檢測(cè)丙氨酸、精氨酸、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、亮氨酸、賴氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、纈氨酸、鳥氨酸、瓜氨酸。

分析樣品處理：分離血清。取10 μL 待測(cè)樣本于EP 管中，加入40 μL 氨基酸樣本稀釋液，震蕩混勻（10.06×g，5 min）。50℃氮?dú)獯蹈桑患尤霃?fù)溶液100 μL 至96 孔板內(nèi)，震蕩混勻（0.81×g，5 min）。

分析方法：高效液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜法（liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）。色譜條件：分析柱為ACE Excel3AQ（3.0 mm×100 mm；美國Waters 公司）；流動(dòng)相A 為水，流動(dòng)相B 為甲醇（HPLC 級(jí)，MERCK 公司）。梯度洗脫；總分析時(shí)間為13 min；流速為0.5 mL/min；進(jìn)樣量為8 μL。質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，負(fù)離子掃描，霧化氣壓力為40 psi，輔助加熱器壓力為60 psi，氣簾氣壓力為20 psi，碰撞氣壓力為6 psi，離子源電壓為-4 500V，離子源溫度為600 ℃。MRM 掃描分析。

1.2.3 膽汁酸代謝譜檢測(cè) 采用API3200MD 三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀（美國ABSciex 公司）、Shimadzu 系列液相色譜儀（日本島津公司）檢測(cè)。膽汁酸代謝譜分析試劑盒（上?？闪γ匪镝t(yī)藥科技有限公司），可檢測(cè)膽酸、鵝脫氧膽酸、甘氨膽酸、甘氨鵝脫氧膽酸、?；悄懰?、牛磺鵝脫氧膽酸、脫氧膽酸、石膽酸、熊脫氧膽酸、甘氨脫氧膽酸、甘氨石膽酸、甘氨熊脫氧膽酸、牛磺脫氧膽酸、?；鞘懰?、牛磺熊脫氧膽酸。

分析樣品處理：取血清樣本100 μL，加入含內(nèi)標(biāo)的提取液500 μL，渦旋混勻（12.58×g，5 min）；離心（16 169×g，10 min）；取上清液400 μL 于96 孔板中，60 ℃氮?dú)獯蹈?；加入?fù)溶液100 μL，將96 孔板放置在微孔板恒溫振蕩器中混勻（1.10×g，10 min），轉(zhuǎn)移96 孔板中的復(fù)溶液到專用過濾板中，過濾板下放置新的96 孔板，將過濾板及96 孔板一起放置于多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)中進(jìn)行過濾，離心（2 810×g，1 min），收集濾液，上機(jī)進(jìn)樣。

分析方法： LC-MS/MS。 色譜條件：分析柱為XbridgeC18（3.0 mm×50 mm，3.5 μm； 美國Waters 公司）；流動(dòng)相A 為水，流動(dòng)相B 為甲醇（HPLC 級(jí)，美國MERCK 公司）；梯度洗脫；總分析時(shí)間為13min；流速為0.5 mL/min；進(jìn)樣量為8 μL。質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，負(fù)離子掃描，霧化氣壓力為40 psi，輔助加熱器壓力為60 psi，氣簾氣壓力為20 psi，碰撞氣壓力為6 psi，離子源電壓為-4 500 V，離子源溫度為600 ℃；MRM 掃描分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用K-S 檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性分布檢驗(yàn)；正態(tài)性分布的定量數(shù)據(jù)以x—±s表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的定性數(shù)據(jù)以M（Q1，Q3）表示，組間比較采用Mann-Whitney U 檢驗(yàn)；采用逐步法二元Logistic 回歸進(jìn)行相關(guān)性分析；根據(jù)Logistic 回歸結(jié)果，以訓(xùn)練樣本建立初步診斷模型，并以考核樣本對(duì)診斷模型加以驗(yàn)證，驗(yàn)證通過后將訓(xùn)練樣本和考核樣本合并，建立最終診斷模型；以診斷概率Y1為新變量，作ROC 曲線并分析模型診斷性能。P<0.01 為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

肺癌組95 例，其中男性63 例，女性32 例，年齡范圍為34 ～83 歲；肺炎組69 例，其中男性38 例，女性31例，年齡范圍為24 ～82 歲；對(duì)照組90 例，其中男性52例，女性38 例，年齡范圍為41 ～81 歲。

2.1 3 組間血清氨基酸代謝譜的比較

3 組間血清氨基酸比較結(jié)果見表1。肺炎組血清丙氨酸、組氨酸、賴氨酸均顯著降低（均P=0.000），苯丙氨酸顯著增高（P=0.000）；肺癌組血清丙氨酸、谷氨酸、組氨酸、亮氨酸、賴氨酸、纈氨酸均顯著降低（P=0.003；P=0.000； P=0.000；P=0.000；P=0.000；P=0.000）， 瓜氨酸、鳥氨酸顯著增高（P=0.009；P=0.000）。5 種氨基酸在肺炎組和肺癌組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中精氨酸、亮氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸在肺癌組中顯著低于肺炎組（P=0.001；P=0.001；P=0.009；P=0.000），瓜氨酸在肺癌組中顯著高于肺炎組（P=0.001）。

表1 3 組間血清氨基酸代謝譜比較（μmol/L）Tab 1 Comparison of amino acid metabolism spectrum among 3 groups (μmol/L)

2.2 3 組間血清膽汁酸代謝譜的比較

3 組間血清膽汁酸比較結(jié)果見表2。肺炎組血清脫氧膽酸、石膽酸、熊脫氧膽酸、甘氨脫氧膽酸、甘氨石膽酸、牛磺脫氧膽酸、?；鞘懰岬? 種膽汁酸顯著降低（P=0.000；P=0.000；P=0.000；P=0.000；P=0.000；P=0.000；P=0.001），甘氨鵝脫氧膽酸、牛磺鵝脫氧膽酸2 種膽汁酸顯著增高（P=0.003；P=0.003）；肺癌組血清脫氧膽酸、牛磺脫氧膽酸2 種膽汁酸顯著降低（P=0.005；P=0.000），膽酸、鵝脫氧膽酸、甘氨鵝脫氧膽酸、?；蛆Z脫氧膽酸4 種膽汁酸顯著增高（P=0.004；P=0.005；P=0.001；P=0.008）。

膽酸、鵝脫氧膽酸、脫氧膽酸、石膽酸、熊脫氧膽酸、甘氨脫氧膽酸、甘氨石膽酸7 種膽汁酸在肺炎組和肺癌組間比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000； P=0.000；P=0.000；P=0.000；P=0.000；P=0.000；P=0.002）， 其在肺癌組中均顯著高于肺炎組。

表2 3 組間血清膽汁酸代謝譜比較（μmol/L）Tab 2 Comparison of bile acid metabolism spectrum among 3 groups (μmol/L)

2.3 氨基酸代謝譜與膽汁酸代謝譜對(duì)肺炎和肺癌的診斷效能

對(duì)在肺炎組和肺癌組中差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的5種氨基酸和7 種膽汁酸進(jìn)行ROC 曲線分析（表3），結(jié)果顯示：脫氧膽酸、熊脫氧膽酸、苯丙氨酸有一定的診斷價(jià)值（AUC ≥0.7），其余代謝產(chǎn)物的診斷價(jià)值一般（0.5 ≤AUC<0.7）。12 個(gè)代謝物中，脫氧膽酸的敏感度和特異度均較高，且Youden 指數(shù)最高，是鑒別診斷能力最強(qiáng)的單個(gè)指標(biāo)。

表3 5 種氨基酸和7 種膽汁酸的診斷效能分析Tab 3 Analysis of diagnostic efficiency of 5 amino acids and 7 bile acids

2.4 多種代謝物聯(lián)合運(yùn)用建立診斷模型

2.4.1 建立初步診斷模型 隨機(jī)抽取90.0%的樣本，即62 例肺炎和85 例肺癌樣本組成訓(xùn)練樣本。將在肺炎組和肺癌組中差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的12 個(gè)代謝物（精氨酸、亮氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、瓜氨酸、膽酸、鵝脫氧膽酸、脫氧膽酸、石膽酸、熊脫氧膽酸、甘氨脫氧膽酸、甘氨石膽酸）納入逐步法二元Logistic 回歸分析（表4）。結(jié)果顯示瓜氨酸、苯丙氨酸、脫氧膽酸是鑒別診斷肺炎和肺癌的獨(dú)立影響因素。據(jù)此建立初步診斷模型： Y0=1/ （1+e-logit（P0））， 其 中l(wèi)ogit（P0）=0.039× 瓜 氨酸-0.021×苯丙氨酸+0.005×脫氧膽酸+0.692，e 是一個(gè)自然常數(shù)，經(jīng)模型系數(shù)綜合檢驗(yàn)χ2=144.02，P<0.05；Hosmer-Lemeshow 檢驗(yàn)χ2=4.52，P>0.05，顯示模型擬合度良好。根據(jù)ROC 曲線得出，該模型診斷最佳臨界值為0.55，此時(shí)氨基酸和膽汁酸聯(lián)合診斷肺炎的診斷效能最大，診斷靈敏度為76.5%，特異度為79.0%，在訓(xùn)練樣本中共診斷成功49 例肺炎和65 例肺癌樣本，診斷符合率

77.6%。

表4 12 種代謝產(chǎn)物逐步法二元Logistic 回歸分析結(jié)果Tab 4 Analysis result of 12 metabolites by stepwise binary Logistic regression

2.4.2 驗(yàn)證初步診斷模型 將剩余10.0%的樣本，即7例肺炎和10 例肺癌樣本組成考核樣本，代入模型Y 進(jìn)行驗(yàn)證，共診斷成功5 例肺炎和8 例肺癌樣本，診斷符合率76.5%，與訓(xùn)練樣本的診斷符合率基本相同。

2.4.3 建立最終診斷模型 將訓(xùn)練樣本和考核樣本合并后，再將上述12 個(gè)代謝物做逐步法二元Logistic 回歸分析，結(jié)果仍顯示瓜氨酸、苯丙氨酸、脫氧膽酸是鑒別診斷肺炎和肺癌的獨(dú)立影響因素。建立最終診斷模型： Y1=1/ （1+e-logit（P1））其中l(wèi)ogit（P1）=0.037×瓜氨酸-0.027× 苯丙氨酸+0.004×脫氧膽酸+1.449。

2.4.4 分析最終診斷模型的診斷性能 以最終診斷模型診斷概率Y1為新變量作ROC 曲線分析，結(jié)果見圖1， 顯示曲線下面積（AUCROC） 為0.829（95%CI 0.762 ～0.883），最佳臨界值為0.55，此處診斷靈敏度為76.8%，特異度為79.7%，符合率為78.3%。

3 討論

圖1 診斷模型鑒別診斷肺癌和肺炎的ROC 曲線Fig 1 ROC of diagnostic model for differential diagnosis in lung cancer and pneumonia

原發(fā)性肺癌是最常見的惡性腫瘤，且其發(fā)病率有逐年增高的趨勢(shì)，及時(shí)準(zhǔn)確地診斷肺癌直接影響患者的預(yù)后。目前有研究[7-8]顯示，影像學(xué)方法的肺癌誤診率仍超過50%，其中約有40%被誤診為肺炎。現(xiàn)階段臨床采用的常用腫瘤標(biāo)志物多為大分子蛋白，往往無法有效區(qū)分肺癌和肺炎[9]。不斷有研究[10-11]指出，小分子代謝物在診斷效能上更有優(yōu)勢(shì)。隨著各種檢測(cè)技術(shù)，尤其是質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，使得精確測(cè)量小分子代謝物成為可能。因此，利用質(zhì)譜和代謝組學(xué)方法檢測(cè)肺癌患者體內(nèi)小分子代謝產(chǎn)物的差異，從而探索相關(guān)的生物標(biāo)志物，在肺癌和肺炎鑒別診斷中具有重要的臨床價(jià)值。本研究利用質(zhì)譜分析技術(shù)，集中對(duì)氨基酸譜和膽汁酸譜2 種類型的代謝物進(jìn)行分析，尋找肺炎和肺癌患者中這2 類代謝產(chǎn)物的差異。

研究共檢測(cè)了11 種常見蛋白質(zhì)氨基酸和2 種非蛋白質(zhì)氨基酸，與對(duì)照組相比，肺炎組血清丙氨酸、組氨酸、賴氨酸顯著降低，苯丙氨酸顯著增高；肺癌組血清丙氨酸、谷氨酸、組氨酸、亮氨酸、賴氨酸、纈氨酸均顯著降低，瓜氨酸、鳥氨酸顯著增高，其中肺癌組中降低者均為蛋白質(zhì)氨基酸，與Miyamoto 等[12]的研究結(jié)果一致。有報(bào)道[13-14]認(rèn)為這是由于腫瘤增殖過程中，蛋白質(zhì)及氨基酸被大量消耗，也有學(xué)者在血漿氨基酸譜的研究[15]中得出不同的結(jié)論，這可能由于血漿受EDTA 抗凝劑影響導(dǎo)致其部分組分的丟失或改變[16]。肺癌不僅影響人體的呼吸系統(tǒng)和循環(huán)系統(tǒng)，還會(huì)引起人體能量代謝的改變，導(dǎo)致機(jī)體氨基酸表達(dá)異常。在腫瘤患者體內(nèi)，氨基酸為肺部腫瘤細(xì)胞的生長提供能量并構(gòu)建其生長所需的蛋白質(zhì)，并為腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)的免疫逃逸機(jī)制提供相應(yīng)的功能[17]。氨基酸還能參與肺部腫瘤細(xì)胞調(diào)控的各個(gè)信號(hào)通路，參與細(xì)胞能量代謝相關(guān)信號(hào)通路的形成，從而控制細(xì)胞的生長和增殖 周期[18-19]。

膽汁酸是在肝細(xì)胞中合成初級(jí)膽汁酸，排入膽道后進(jìn)入腸腔產(chǎn)生次級(jí)膽汁酸，并由肝門靜脈重吸收返回肝臟[20]。與氨基酸代謝相比，膽汁酸代謝常見于肝膽疾病和腸道疾病方面的研究，目前其與肺部疾病相關(guān)的報(bào)道很少。本研究對(duì)膽汁酸在肺炎和肺癌患者體內(nèi)代謝的差異進(jìn)行分析。肺炎組與對(duì)照組相比，血清脫氧膽酸、石膽酸、熊脫氧膽酸、甘氨脫氧膽酸、甘氨石膽酸、牛磺脫氧膽酸、?；鞘懰? 種次級(jí)膽汁酸顯著降低，甘氨鵝脫氧膽酸、?；蛆Z脫氧膽酸2 種初級(jí)膽汁酸顯著增高；肺癌組血清脫氧膽酸、?；敲撗跄懰? 種次級(jí)膽汁酸顯著降低，膽酸、鵝脫氧膽酸、甘氨鵝脫氧膽酸、牛磺鵝脫氧膽酸4 種初級(jí)膽汁酸顯著增高。據(jù)文獻(xiàn)[21]報(bào)道，在肺炎患者體內(nèi)，膽汁酸受體能通過抑制NF-κB 通路的激活而達(dá)到抑制炎癥的效果，脂多糖及某些促炎細(xì)胞因子也可誘導(dǎo)肺部膽汁酸受體下調(diào)，進(jìn)入外周血的膽汁酸相應(yīng)減少。在肺癌患者體內(nèi)，肺組織內(nèi)的膽汁酸受體能激活細(xì)胞周期蛋白-D1，促進(jìn)肺部腫瘤的增長[22]，也能通過激活JAK2/STAT3 信號(hào)通路刺激肺部腫瘤細(xì)胞增殖[23]；隨著腫瘤的發(fā)生，肺癌患者的肺組織膽汁酸受體增多，進(jìn)入外周血的膽汁酸相 應(yīng)增多。

在了解肺癌和肺炎患者血清中相關(guān)代謝產(chǎn)物的變化和特征后，本研究對(duì)95 例肺癌患者、69 例肺炎患者和90例健康對(duì)照人群血清氨基酸和膽汁酸進(jìn)行了比較，對(duì)其鑒別診斷效能進(jìn)行綜合評(píng)估。12 種代謝物在肺炎組和肺癌組間差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中精氨酸、亮氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸4 種氨基酸在肺癌組中低于肺炎組，膽酸、鵝脫氧膽酸、脫氧膽酸、石膽酸、熊脫氧膽酸、甘氨脫氧膽酸、甘氨石膽酸7 種膽汁酸和瓜氨酸在肺癌組中高于肺炎組。單個(gè)代謝產(chǎn)物診斷效能最好的是脫氧膽酸，其靈敏度為78.2%，特異度為71.1%，ROC 曲線下面積達(dá)到了0.768。為了評(píng)價(jià)上述12 項(xiàng)代謝產(chǎn)物的聯(lián)合診斷效能，我們將其納入Logistic 回歸方程并建立診斷模型，初步的模型及最終的模型均提示瓜氨酸、苯丙氨酸和脫氧膽酸是聯(lián)合診斷的最優(yōu)組合。聯(lián)合診斷模型的ROC 曲線下面積為0.829，高于所有單項(xiàng)代謝產(chǎn)物，因此聯(lián)合診斷能提高相關(guān)代謝產(chǎn)物對(duì)肺癌和肺炎的診斷效能。同時(shí)，對(duì)模型的驗(yàn)證也顯示，訓(xùn)練樣本和考核樣本的診斷符合率基本相符，故該模型有一定的臨床價(jià)值，可以和常用的腫瘤標(biāo)志物并結(jié)合影像學(xué)技術(shù)對(duì)肺癌和肺炎進(jìn)行鑒別診斷。

本研究評(píng)價(jià)了13 種氨基酸和15 種膽汁酸及其聯(lián)合檢測(cè)對(duì)于鑒別肺炎和肺癌的臨床價(jià)值，發(fā)現(xiàn)小分子代謝物聯(lián)合檢測(cè)的診斷效能顯著高于單項(xiàng)分析指標(biāo)。同時(shí)，聯(lián)合檢測(cè)的診斷效能也高于目前臨床常用的單項(xiàng)肺部腫瘤標(biāo)志物，如癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、神經(jīng)元烯醇化酶（nueron enolase，NSE）、鱗癌抗原（squamous cell carcinoma antigen，SCC）等，且小分子代謝產(chǎn)物聯(lián)合檢測(cè)的靈敏度高于肺部腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)的靈敏度，但特異性稍有不如[24]。如果將小分子代謝產(chǎn)物和肺部腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)，可能得到高于這二者對(duì)于肺炎和肺癌的鑒別診斷效能。

由于本研究尚未將全部氨基酸以及脂肪酸類、類固醇類等代謝物納入，因此本研究得出的診斷模型還需要進(jìn)一步優(yōu)化。隨著代謝組學(xué)的迅速發(fā)展，其在腫瘤的早期診斷、發(fā)生機(jī)制的探索、個(gè)體化治療方案的制定等方面將發(fā)揮重要作用。

參·考·文·獻(xiàn)

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