梁麗琴，楊 瑞，郜 剛，*

(山西師范大學(xué) a. 生命科學(xué)學(xué)院；b.文理學(xué)院，山西 臨汾 041004)

泛醌氧化酶(ubiquinol oxidase，UOX)是核基因編碼的線粒體末端氧化酶，它與細胞色素C氧化酶(cytochrome C oxidase，COX)同屬于血紅素-銅氧化酶家族(Heme-Copper family)[1]。其中，COX是線粒體呼吸鏈的末端酶，位于線粒體內(nèi)膜上，催化電子從細胞色素C轉(zhuǎn)移到氧，并將質(zhì)子排到線粒體膜間隙最終經(jīng)ATP合酶使ADP轉(zhuǎn)化為ATP供能[2-3]。而UOX主要分布在線粒體內(nèi)膜，負責(zé)催化泛醌的抗氰氧化并將分子氧還原為水，但不轉(zhuǎn)移質(zhì)子，因此與氧化磷酸化沒有聯(lián)系[4]。除此之外，UOX的表達受諸如冷、活性氧物種和病原體感染等脅迫影響時，會導(dǎo)致COX途徑減少電子流動[5-6]。

近年來，有關(guān)泛醌氧化酶的研究進展主要集中在發(fā)育與脅迫應(yīng)答方面。其中研究較深的是交替氧化酶(alternative oxidase，AOX)，AOX是一種膜結(jié)合的非質(zhì)子泵類的泛醌氧化酶，存在于大多數(shù)植物以及許多真菌和原生動物中[7]。在擬南芥中，已鑒定出5個編碼AOX的基因：AOX1a-d和AOX2。其中的AOX基因家族的表達被證明與組織和發(fā)育有關(guān)；在豆科植物中，鑒定出了4種AOX即CaAOX1和CaAOX2A，B和D[8]。而且AOX的活性和表達也已經(jīng)在幾個物種中被證明是由許多非生物脅迫誘導(dǎo)的，例如冷[9-10]、旱[11-12]氮和磷限制和活性氧誘導(dǎo)脅迫[13]，表明AOX在優(yōu)化葉片代謝以適應(yīng)不斷變化的環(huán)境條件方面發(fā)揮了重要作用。AOX基因的表達譜以及AOX的數(shù)量和活性對強光條件表現(xiàn)出強烈的響應(yīng)，這表明AOX基因與葉綠體新陳代謝有關(guān)[14]。除此之外，交替氧化酶途徑通過調(diào)節(jié)細胞ROS、蘋果酸閥和抗氧化系統(tǒng)優(yōu)化滲透和溫度脅迫下的光合作用。關(guān)于其他類型的泛醌的研究極少，尤其是它們與已知AOX在結(jié)構(gòu)、功能、進化關(guān)系等方面的研究未見報道。

馬鈴薯(Solanumtuberosum)是中國第三大糧食作物，含有人體所需要的各種營養(yǎng)成分，是一種重要的糧食和蔬菜作物[15-16]，它的適應(yīng)性很強、營養(yǎng)豐富、經(jīng)濟效益高[17]，但是由于近年來土地資源的各種問題，馬鈴薯的種植出現(xiàn)倒茬問題，這使得馬鈴薯土傳病害尤其是青枯病加重，因此對馬鈴薯產(chǎn)量有巨大的影響。但是有關(guān)馬鈴薯中的StUOXs(EC:1.10.3.11)的研究尚未見報道。本文通過同源序列比對在馬鈴薯SolTub_3.0基因組中鑒定了馬鈴薯的5個StUOXs基因，并對其進行序列比對、進化樹構(gòu)建、蛋白質(zhì)性質(zhì)表達譜分析，旨在研究StUOXs在馬鈴薯抗病過程中發(fā)揮的作用，進而為提高馬鈴薯的產(chǎn)量作貢獻。

1 材料與方法

1.1 馬鈴薯StUOXs家族基因序列的提取

利用前期馬鈴薯測序獲得的一條StUOX4 EST序列為出發(fā)點序列，進行Blast同源性比對，進行insilico克隆[18]。在PGSC網(wǎng)站下載馬鈴薯基因組中的全部蛋白質(zhì)序列。以上述獲得的StUOX4序列作為對象，通過Uniprot、Pfam、TBtools提取同源序列[19]。并對馬鈴薯的StUOXs基因根據(jù)染色體上的位置進行命名。在Ensemblplant數(shù)據(jù)庫中獲取煙草、番茄、辣椒、擬南芥全基因組序列[20]，并提取StUOXs的同源基因序列。

1.2 StUOXs基因序列分析

依據(jù)上述獲得的基因序列號在基因庫中下載相應(yīng)的基因組序列、編碼區(qū)序列以及氨基酸序列，進一步進行序列結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測等分析。用在線ExPASy (https://web.expasy.org/compute_pi與https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/)分析蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，如相對分子質(zhì)量、理論等電點、不穩(wěn)定指數(shù)、親水性等；利用Protcomp 9.0(http://linux1.softberry.com/berry)預(yù)測它的亞細胞定位；利用TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預(yù)測StUOXs蛋白是否含有跨膜結(jié)構(gòu)域。所用軟件均為免費在線工具，在進行分析時，參數(shù)均采用默認值。

1.3 StUOXs進化樹的構(gòu)建

將馬鈴薯的5條StUOXs序列、番茄的4條序列、擬南芥的7條序列、煙草的7條序列及辣椒的24條序列放在MEGA7軟件，利用ClustalW程序進行多序列比對，輸出的多序列比對結(jié)果采用Maximum parsimony方法構(gòu)建進化樹[21]。

Clustal Consensus表示序列的同源性，其中“*”表示完全保守的殘基位置；“:”表示有些保守的殘基位置；“.”表示保守程度較低的殘基位置。Clustal Consensus denoted sequence homology. “*” indicated positions with a fully conserved residues; “:” indicated the positions of some conservative residues; “.” indicated the positions of less conservative residues.圖1 馬鈴薯StUOXs的多序列比對Fig.1 Multiple sequence alignment of representatives of StUOXs family

1.4 StUOXs基因表達模式分析

在PGSC網(wǎng)站上下載各序列的FPKM值，整理相匹配的mRNA數(shù)據(jù)，選擇葉片、莖及整株植物中基因在不同處理條件下(如生物脅迫，熱處理等)的表達量值。利用TBtools軟件對表達數(shù)據(jù)進行可視化分析[22]。

1.5 StUOXs基因蛋白互作分析

通過在線Uniprot軟件，打開Protein-protein interaction databases(STRINGi 4113.PGSC0003DMT400019707)，獲得與目的基因相互作用的蛋白，以及互作分值，從而預(yù)測目的蛋白的功能。

1.6 青枯菌接種及實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測基因表達

實驗取7—8葉齡期的馬鈴薯幼苗，用108CFU·mL-1(D600=0.2)菌液傷根灌菌法接種[23]。處理后在0、24、48、72、96、120、148 h分別取樣，液氮冷存，-80 ℃保存?zhèn)溆?。每次處理重?fù)3次。

以馬鈴薯Actin基因為內(nèi)參，引物如下：Actin-F，5′-TATAACGAGCTTCGTGTTGCAC-3′；Actin-R，5′-ACTGGCATACAGCGAAAGAACA-3′。以StUOX4序列設(shè)計特異性熒光定量引物：F，5′-CGTGCCAACGCCCTCCTG-3′；R，5′-CACCGTCAGCCGCTTCGC-3′。正反引物各0.4 μL，2×TransStart Top Green qPCR SuperMix 10 μL，模板(稀釋的cDNA) 2 μL，加ddH2O定容至20 μL[24]。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯StUOXs的蛋白序列的理化性質(zhì)

通過EST片段序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進行電子克隆以及利用UOXs蛋白保守域建立HMM模型(PF01786)檢索獲得馬鈴薯的StUOXs的候選序列。之后利用生物信息學(xué)進一步驗證，最終獲得5條StUOXs序列，序列的ID號為PGSC0003DMP400022226、PGSC0003DMP400013471、PGSC0003DMP400032207、PGSC0003DMP400013470、PGSC0003DMP400023609；在擬南芥基因組中鑒定出同源序列有7條，分別為AT3G27620.1、AT5G64210.1、AT3G22360.1、AT1G32350.1、AT1G32350.2、AT4G22260.1、AT3G22370.1；辣椒中有24條同源序列(PHT93166、PHT93167、PHT72818、PHT66457、PHT64156、PHT67970、PHT64647、PHT92598、PHT49307、PHT87461、PHT94954、PHT86810、PHT89471、PHT60928、PHT73747、PHT73750、PHT74015、PHT88962、PHT72616、PHT68555、PHT75687、PHT96032、PHT70389、PHT83475)、煙草中有7條同源序列(OIS98262、OIT30507、OIT03592、OIT37664、OIT30836、OIT19320、OIS96044)及番茄中4條同源序列(Solyc08g075540.3.1、Solyc01g105220.3.1、Solyc08g005560.3.1、Solyc11g011980.2.1)。根據(jù)馬鈴薯中該基因各成員在染色體上的位置進行命名(StUOX1-StUOX5)，并對其理化性質(zhì)進行分析。分析發(fā)現(xiàn)該家族成員的氨基酸數(shù)目在279～366；相對分子質(zhì)量分布在31～42 ku。其中StUOX3最小，僅含279個氨基酸殘基，相對分子質(zhì)量為31.90 ku。StUOXs的蛋白等電點為5.61～9.08。除StUOX2、StUOX5呈現(xiàn)酸性，其余成員呈現(xiàn)堿性，蛋白質(zhì)表面電荷為正電荷；亞細胞定位5條序列均定位在線粒體(表1)。

表1 StUOXs理化性質(zhì)基本信息Table 1 Basic information of physical and chemical properties of StUOXs

2.2 染色體定位

利用Stuberosum_448_v4.03.gene.gff3提取馬鈴薯的全部基因位置信息，查找StUOXs的對應(yīng)位置信息。結(jié)果如表2所示，發(fā)現(xiàn)馬鈴薯的StUOXs分別定位在1號、8號和11號染色體上。

表2 馬鈴薯中StUOXs同源基因的染色體定位信息Table 2 Gene mapping information of homologous genes of StUOXs in potato

2.3 多序列比對

利用Bioedit對馬鈴薯的StUOXs的同源序列進行多序列比對(圖1)。結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，StUOXs中序列同源性較高的殘基有88個；StUOX1、StUOX2、StUOX3、StUOX4之間的相似性高于StUOX5。并且進化樹分析也發(fā)現(xiàn)，StUOX1、StUOX2、StUOX3、StUOX4之間的親緣關(guān)系較近，而與StUOX5的親緣關(guān)系較遠(圖2)。

2.4 啟動子分析

隨機選取馬鈴薯StUOX4基因做代表性基因，提取起始密碼子(ATG)上游2 000 bp序列，利用Softberry，Augustus，PlantCARE軟件進行啟動子順式元件分析。分析發(fā)現(xiàn)，StUOX4含有MRE、CGTCA-motif、TATA-box、GARE-motif順式作用元件，它們分別是參與光反應(yīng)的MYB結(jié)合位點、參與MEJA反應(yīng)性的順式作用調(diào)節(jié)元件、TATA-box，以及赤霉素應(yīng)答元件(圖3)。這說明StUOXs會受光照強度、激素、生物脅迫的誘導(dǎo)。

用鄰接法構(gòu)建了StUOXs的系統(tǒng)發(fā)育樹。The phylogenetic tree of StUOXs constructed by using the Neighbor-Joining method.圖2 馬鈴薯StUOXs的進化樹分析Fig.2 Evolutionary tree analysis of StUOXs family

1，MRE；2，CGTCA-motif；3，轉(zhuǎn)錄起始位點；4，TATA box；5，GARE-motif；6，起始密碼子；7，終止密碼子；8，PolA位點。圖中淺色部分是外顯子區(qū)域。1， MRE; 2， CGTCA-motif; 3， Transcription initiation site; 4， TATA box; 5， GARE-motif; 6， Start codons; 7， Stop codons; 8，PolA site. The light part showed the exon region.圖3 StUOXs啟動子順式作用元件分析(StUOX4作為代表性成員)Fig.3 Analysis of promoter elements of StUOX4 as a representative member

2.5 蛋白質(zhì)亞細胞定位及保守結(jié)構(gòu)域分析

亞細胞定位預(yù)測結(jié)果表明(表2)，StUOXs多定位于線粒體中。利用MEME進行蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，motif2、motif4、motif6及motif9在StUOXs蛋白保守結(jié)構(gòu)域中均存在；motif1、motif3、motif5、motif7在StUOX1、StUOX2、StUOX3及StUOX4中存在(圖4)。整體上看，StUOX1、StUOX2、StUOX3、StUOX4編碼的氨基酸蛋白序列保守性較高。

2.6 系統(tǒng)發(fā)育進化分析

通過將擬南芥、番茄、煙草、辣椒和馬鈴薯的UOXs蛋白序列總計47條序列進行建樹(圖5)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，StUOXs基因與番茄、辣椒的UOXs的親緣關(guān)系最近，與擬南芥、煙草親緣關(guān)系遠。除此之外，在進化關(guān)系圖中發(fā)現(xiàn)辣椒的UOXs基因家族占有很大的比例，說明UOXs在辣椒中可能在長期的進化過程中形成并且發(fā)揮著重要作用。

2.7 馬鈴薯StUOXs基因的表達

利用PGSC在線網(wǎng)站下載馬鈴薯StUOXs的FPKM 數(shù)據(jù)，并對數(shù)據(jù)進行處理(圖6)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，葉片中的StUOX1、StUOX2、StUOX4、StUOX5在生物脅迫與病菌脅迫下表達量都增加，StUOX3的表達量有所下降；整株植物在35 ℃下暗培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)StUOX2、StUOX4、StUOX5表達量下降，其他的兩條序列的表達量變化不明顯。除此之外，在圖6中發(fā)現(xiàn)兩條序列StUOX1、StUOX3的表達量是低表達；StUOX4、StUOX5的表達量在脅迫處理下表達量變化差異大；StUOX2在5條序列中的表達量是高表達。

2.8 蛋白互作分析

通過蛋白互作關(guān)系分析可了解與目標蛋白共表達的相關(guān)蛋白的情況，是預(yù)測蛋白功能的一種方法。本研究利用UniProt分析與StUOX4共表達和可能發(fā)生蛋白互作的蛋白，從而為研究StUOX4的功能提供參考。從圖7中可以看到與1089114(StUOX4)蛋白互作分值在0.5以上的蛋白有10個，其中與102589531蛋白互作得分較高。102589531是?；o酶A合成酶(Acyl coenzyme A synthetase)，NCBI注釋中顯示該蛋白參與脂肪酸的代謝、生物合成以及降解過程。102582385、102604331和NAD1是催化線粒體NADH氧化的替代NADH-泛醌氧化還原酶。此外，102586640、102586030、102595411是絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶在KEGG分析中顯示參與mRNA的監(jiān)測和信號通路調(diào)控。這些信息顯示，StUOX4基因可能與mRNA的監(jiān)測和信號通路調(diào)節(jié)有關(guān)。

左圖為5個物種中UOXs 的系統(tǒng)發(fā)育樹；右圖為保守序列的分布，圖中不同的顏色表示10個motif。The map on the left showed the phylogenetic tree of UOXs in 5 species， and the picture on the right showed the distribution of conservative sequences， with different colored boxes representing 10 putative motif.圖4 StUOXs基因的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和保守基序分析Fig.4 Phylogenetic relationship and conserved motif analysis of StUOXs genes

其中點標注的是StUOXs。此圖是用MEGAV7.0軟件使用最大簡約法和1 000次重復(fù)生成樹。The dot in the picture is marked with StUOXs. The tree was generated with MEGA v7.0 software using the Maximum Parsimony method and 1 000 bootstrap replicates.圖5 馬鈴薯與煙草、番茄、擬南芥、辣椒UOXs家族系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of UOXs from potato， Arabidopsis， tomato， tobacco and pepper

2.9 StUOX4在青枯菌誘導(dǎo)下的表調(diào)模式

為了解StUOX4在馬鈴薯抗病過程中的應(yīng)答反應(yīng)，利用qRT-PCR分析青枯菌對StUOX4的影響(圖8)。接種青枯菌后，StUOX4的相對表達量逐漸升高，在第4天達到峰值，在第5、6天時相對表達量降低。在接種后的7～21 d即感染青枯菌后的中后期，未檢測到該基因的表達。這些結(jié)果表明，StUOX4參與馬鈴薯青枯病的早期應(yīng)答反應(yīng)。

此圖是用PGSC軟件獲得StUOXs基因的FPKM值；用TBtools軟件構(gòu)建熱圖。The FPKM value of StUOXs gene was obtained by PGSC software; Heatmap was constructed by TBtools software.圖6 StUOXs在不同組織器官中的表達譜Fig.6 Expression profiles of StUOXs in different tissues and organs

圖中線條表示交互作用。102589114，StUOX4；102589531，酰基輔酶A合成酶；102582385，魚藤酮不敏感的NADH-泛醌氧化還原酶；102604331，NADH-泛醌氧化還原酶；NDA1，線粒體內(nèi)替代NAD(P)H-泛醌氧化還原酶A1；102586640，絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶；102586030，絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶；102595411，絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶。The lines in the figure represent the interaction. 102589114， StUOX4; 102589531， Acyl coenzyme A synthetase; 102582385， Rotenone-insensitive NADH-ubiquinone oxidoreductase; 102604331， NADH-ubiquinone oxidoreductase; NDA1， Internal alternative NAD(P)H-ubiquinone oxidoreductase A1 in mitochondria; 102586640， Serine/threonine-protein phosphatase; 102586030， Serine/threonine-protein phosphatase; 102595411， Serine/threonine-protein phosphatase.圖7 馬鈴薯中基因的相互作用Fig.7 Protein interaction map in potato

圖8 利用qRT-PCR分析接種青枯菌的馬鈴薯幼苗StUOX4基因的相對表達量Fig.8 The relative expression of StUOX4 gene in potato seedlings treated with Ralstonia solanacearum by qRT-PCR

3 討論

泛醌氧化酶作為線粒體末端氧化酶，在植物的生長發(fā)育調(diào)節(jié)及脅迫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用。隨著基因組學(xué)與分子生物學(xué)的發(fā)展，有關(guān)AOXs的研究已有很多，如AOXs已在多種植物中被鑒定與克隆，如水稻、番茄、小麥、擬南芥及豆科植物[6，8，25-26]。本研究通過利用生物信息學(xué)的方法在馬鈴薯基因組中鑒定出了5條StUOXs蛋白序列，其編碼序列屬于血紅素—銅氧化酶家族，該家族的成員中的血紅素—銅中心用于催化氧還原為水的四電子還原反應(yīng)[27]。對StUOXs進行分析發(fā)現(xiàn)它們編碼的蛋白約有350個氨基酸殘基，相對分子質(zhì)量大概在36～41 ku，亞細胞定位發(fā)現(xiàn)它們均分布在線粒體中，其中StUOX2在胞外也有分布，并且它還含有2個跨膜結(jié)構(gòu)及6個外顯子；通過將馬鈴薯、番茄、擬南芥、煙草、辣椒的UOXs進行進化樹分析發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯的5條StUOXs同源序列與番茄、辣椒的UOXs的親緣關(guān)系最近，較擬南芥、煙草稍遠。之后對馬鈴薯的不同器官中的StUOXs基因的表達量進行了在線分析，發(fā)現(xiàn)StUOXs家族的5個基因中有4個基因在生物脅迫與病菌脅迫下表達量都增加，且StUOX4、StUOX5的表達量在脅迫(如病原菌、激素、溫度、光照)處理下表達量變化差異大，而StUOX2是5條序列中的表達量最高的序列，說明4個基因參與了脅迫的響應(yīng)。圖7對目標基因進行蛋白互作分析發(fā)現(xiàn)，StUOX4與脂肪酸的代謝、合成及降解有關(guān)；與NAD1有相互作用參與生物在不利條件下的電子傳遞過程；還與絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶有相互作用，參與mRNA的監(jiān)測以及信號通路調(diào)控。qRT-PCR實驗表明，StUOXs參與馬鈴薯青枯病的早期應(yīng)答反應(yīng)。因此，開展這些基因的功能研究，可為植物青枯病菌的防治機制提供參考。

植物在受到逆境脅迫后，往往會產(chǎn)生自我保護途徑，其中基因的應(yīng)激表達是最主要的。而且基因的表達會受到啟動子的調(diào)控，因此，研究目的基因的啟動子順式作用原件有非常重要的意義。本文對StUOXs的啟動子順式作用原件進行分析，StUOXs含有激素誘導(dǎo)的調(diào)控原件，如MRE、CGTCA-motif、GARE-motif等順式作用元件。除此之外，StUOXs會受光照強度、生物脅迫的誘導(dǎo)。這些順式作用元件的存在可能表明馬鈴薯在受到非生物脅迫后StUOXs基因在應(yīng)答反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。

UOXs基因的表達影響植物的生長發(fā)育及對外界的抵抗力，它們在植物生長發(fā)育的各個生理過程及植物對環(huán)境的適應(yīng)過程中起到重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，亞基Ⅰ中保守的芳香氨基酸殘基如Trp280、Tyr288、Trp331和Phe348對于UOXs的催化功能是必不可少的，它們參與了血紅素—銅雙核中心的組裝和功能[28]。AOXs作為一種泛醌氧化酶，它會影響病毒的侵害，當(dāng)植物在受到病原菌侵害時，往往會導(dǎo)致一氧化氮和氰化物的產(chǎn)生，而它們會干擾線粒體的功能[29]，如煙草中的AOX在丁香假單胞桿菌侵染過程中發(fā)揮重要的作用。這與我們對馬鈴薯的StUOXs的基因表達數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)的StUOXs在生物脅迫、病原菌的脅迫下表達量會變化一致。而且AOXs基因可被活性氧(reactive oxygen species， ROS)、水楊酸(salicylic acid， SA)和逆境(寒冷、干旱、鹽分、病原體)上調(diào)[30-34]。本文同樣發(fā)現(xiàn)馬鈴薯的StUOXs的基因在激素、溫度的脅迫下表達量會發(fā)生變化。這些結(jié)果暗示馬鈴薯的StUOXs基因在生物脅迫、激素、脅迫應(yīng)答反應(yīng)過程中有重要功能，尤其是在馬鈴薯與青枯菌互作的早期，該基因的強烈上調(diào)表達顯示其參與了馬鈴薯對青枯菌的應(yīng)答反應(yīng)，這與本實驗室前期的相關(guān)研究的結(jié)論是一致的[24]。

本文在鑒定馬鈴薯StUOXs基因的基礎(chǔ)上，利用生物信息學(xué)方法對StUOXs基因結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、進化樹構(gòu)建和表達譜進行分析，并對StUOX4參與功能進行了初步分析，這將為進一步深入研究馬鈴薯StUOXs的生物學(xué)功能提供重要線索。