胡 敏，李 雪，支紅欣，彭 勃,劉雨心,王玉庭,宋思杭

(大慶師范學(xué)院 生物工程學(xué)院，黑龍江 大慶 163712)

1 引言

海洋是最大的水生生態(tài)系統(tǒng)，具有巨大的開發(fā)潛力。由于許多微生物處于海洋極端環(huán)境中，如高壓、高溫、低溫等，運(yùn)用傳統(tǒng)的技術(shù)很難對(duì)這些微生物進(jìn)行研究，因此利用宏基因組技術(shù)可以為海洋微生物多樣性以及生物技術(shù)的應(yīng)用創(chuàng)造新機(jī)遇。

1.1 海洋微生物研究進(jìn)展

海洋真菌屬于海洋微生物的一個(gè)重要組成部分。根據(jù)國內(nèi)外研究表明，至今還有20000～40000種真菌沒有被開發(fā)和研究。2005年，中山大學(xué)生命科學(xué)院王書錦在中國黃海、渤海、遼寧近海地區(qū)共分離出500多株海洋真菌，并對(duì)其中20多種進(jìn)行鑒定，主要的真菌有青霉屬(Penicillum)、曲菌屬(Aspergillus)、鐮刀菌屬(Fusarium)。

除真菌以外，許多海洋微生物可以產(chǎn)生抗腫瘤活性物質(zhì)。在遼寧近海地帶的8個(gè)地區(qū)，薛德林等分離出8株海洋酵母菌、5株海洋真菌，其中真菌中青霉屬菌株HF9601、HF9602、HF9603中有效成分對(duì)Hela等細(xì)胞有強(qiáng)烈的抑制作用。

在百慕大西洋群島的研究中，發(fā)現(xiàn)擬桿菌門的SAR202在可見光海域分布較多，而在海底不可見光海域非常稀少，通過對(duì)不同的海域和不同的海水進(jìn)行分析比對(duì)證實(shí)了海洋微生物群體的多樣性。運(yùn)用用宏基因組技術(shù)分析珊瑚，發(fā)現(xiàn)其含有38%的真菌序列，其他序列包括7%細(xì)菌、1%古生菌、2%真核病毒以及3%噬菌體。相信，利用宏基因組技術(shù)開發(fā)研究更多的不可培養(yǎng)海洋微生物。

1.2 宏基因組學(xué)概述

宏基因組，最初是由Handelsman等于1998年提出的，即一個(gè)環(huán)境中的全部微生物基因組信息。宏基因組學(xué)是以環(huán)境樣品中的微生物群體基因組作為研究對(duì)象，用功能基因篩選或測(cè)序分析的手段研究包括不可培養(yǎng)微生物在內(nèi)的方法。宏基因組提供了一種探知微生物多樣性結(jié)構(gòu)和功能基因的免培方法，是一條尋找新基因及其產(chǎn)物的新途徑。

自然界生物之間彼此依賴，很多微生物很難在實(shí)驗(yàn)室條件下培養(yǎng)。2004年Handelsman發(fā)現(xiàn)宏基因組技術(shù)可以通過直接提取的方法對(duì)微生物的遺傳物質(zhì)進(jìn)行分析。2010年Wong發(fā)現(xiàn)宏基因組技術(shù)可以用于研究功能基因和編碼酶的基因，同時(shí)可以用于研究生物合成過程的生物活性催化劑以及次生物代謝物。2012年，Stewart將細(xì)胞培養(yǎng)在多孔的中空纖維膜中，運(yùn)用組學(xué)技術(shù)獲取生物多樣性信息。

宏基因組文庫的篩選方式分為功能篩選和測(cè)序篩選。功能篩選即生物活性水平的篩選，根據(jù)重組克隆產(chǎn)生的新活性進(jìn)行功能篩選。測(cè)序篩選是通過PCR擴(kuò)增從已知基因的保守片段中識(shí)別目標(biāo)基因。圖1為宏基因組技術(shù)操作步驟。

圖1 宏基因組技術(shù)操作步驟

2 宏基因組學(xué)在海洋微生物中的研究進(jìn)展

2.1 宏基因組學(xué)在海洋微生物新型酶方面的研究

為適應(yīng)海洋中各種極端環(huán)境，某些海洋微生物經(jīng)演化生成了特殊的代謝產(chǎn)物，可利用宏基因組技術(shù)研究新型酶。2012年Cipolla等和Karan等發(fā)現(xiàn)嗜冷酶在所有極端酶中具有一定代表性，相比其他常溫酶以及嗜熱酶，嗜冷酶的活性相較之高出10倍多。2013年Fu等在北極潮間帶利用宏基因組文庫篩選分離出Est97的新型嗜冷酯酶，此酶可用于低溫生物轉(zhuǎn)化。2012年Lee等首次在朝鮮西海岸利用宏基因組文庫分離出具有脂肪酶活性的磷脂酶A。2012年Fang和他的研究團(tuán)隊(duì)從細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了一種堿性的新型漆酶，該酶可以通過添加含氯化合物增加這種酶的堿性。2012年韓國團(tuán)隊(duì)Jeon等通過宏基因組學(xué)發(fā)現(xiàn)耐鹽酯酶屬于一種新的酶家族。2013年Wierzbicka-Wos等在波羅的海利用宏基因組文庫篩選BglMKg酶，此酶有β-半乳糖苷酶、β-巖藻糖苷酶和β-葡萄糖苷酶活性。Zhu以及他的團(tuán)隊(duì)于2013年在海洋中發(fā)現(xiàn)了解脂酶；2013年Mohamed等從紅海的宏基因組文庫中提取出一種新型酯酶，這種新型酯酶結(jié)合了嗜熱活性和抵抗重金屬的能力，可以將其應(yīng)用到生物修復(fù)中。Schroder等于2014年發(fā)現(xiàn)了β-葡萄糖苷酶。同時(shí)，Schroder等還提取出了具有耐鹽能力的酶。此外， Sayed等于2014年從紅海的樣品中提取一種新型汞還原性酶，它在高溫、高鹽和重金屬條件下有很強(qiáng)的催化能力。

2.2 宏基因組在海洋微生物代謝產(chǎn)物方面的研究

海洋可以稱之為含有大量天然產(chǎn)物的“容器”，這些天然產(chǎn)物很大有藥用價(jià)值。2011年Imhoff等發(fā)現(xiàn)海洋微生物在不斷繁衍進(jìn)化的過程中可以產(chǎn)生具有特殊生物活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物。此外，Asolkar等于2009年、Sakurada等于2010年、Mayer等于2013年分別發(fā)現(xiàn)了這些代謝產(chǎn)物對(duì)于治療心血管疾病、免疫缺陷以及神經(jīng)系統(tǒng)疾病有幫助。宏基因組技術(shù)對(duì)于探索難分離和培養(yǎng)的海洋細(xì)菌中的生物活性化合物十分有利。

2.3 宏基因組在篩選海洋微生物化合物方面的研究

2.3.1 測(cè)序篩選海洋微生物化合物方面的研究

Piel和他的團(tuán)隊(duì)首次在海綿生物上應(yīng)用焦磷酸測(cè)序技術(shù)，提取出非核糖體肽和聚酮合酶基因簇，發(fā)現(xiàn)了聚酮類產(chǎn)物(膽酸脂和異戊烯酮)具有抗腫瘤活性，該基因簇由于內(nèi)含子的缺失和SD序列的存在可以和細(xì)菌形成共生體。2004年和2007年Haygood研究團(tuán)隊(duì)運(yùn)用宏基因組學(xué)技術(shù)證實(shí)了聚酮類物質(zhì)在pks基因簇中的存在。

一直以來，基因組學(xué)的不斷進(jìn)步為宏基因組技術(shù)提供了新策略。單細(xì)胞基因組學(xué)可以降低宏基因組學(xué)的復(fù)雜性。2007年Kvist等從復(fù)雜的微生物群體中分離出單細(xì)胞，再通過測(cè)序或 PCR篩選擴(kuò)增其基因組。2011年Grindberg等利用宏基因組篩選技術(shù)分離apr基因簇，這是一種含有抗腫瘤環(huán)脂肽Apratoxin A.天然產(chǎn)物的物質(zhì)。

2.3.2 功能篩選海洋微生物化合物方面的研究

功能驅(qū)動(dòng)篩選法是以活性測(cè)定為基礎(chǔ)，通過建立和優(yōu)化合適的方法從宏基因組文庫中獲得特殊功能的克隆。主要方法有2種：一種是對(duì)具有特殊功能的克隆子進(jìn)行直接檢測(cè)，如利用其在選擇性培養(yǎng)基上的表型特征進(jìn)行篩選，這種方法靈敏度高，較少的目標(biāo)克隆也能被檢測(cè)到；另一種是基于異源基因的宿主菌株與其突變體在選擇性條件下功能互補(bǔ)生長的特性進(jìn)行篩選。功能篩選的優(yōu)點(diǎn)是不需要生物合成過程中初始化合物的信息。

盡管功能篩選有許多成功的實(shí)驗(yàn)，可仍然存在不足，因?yàn)楹芏嗷蛟诋愒此拗鞑荒鼙磉_(dá)。但2012年Ekkers等用鏈霉菌、假單胞桿菌和芽孢桿菌形成的細(xì)菌鏈解決了這類問題。此外，陽性克隆子可以通過快速的篩選技術(shù)分析大量樣品，Ballestriero等于2010年和Owen等于2012年發(fā)現(xiàn)了新的篩選技術(shù)，2013年P(guān)enesyan等對(duì)其方法進(jìn)行改善，提高其篩選的效率，對(duì)未來的功能篩選技術(shù)作出貢獻(xiàn)。

2.4 宏基因組學(xué)在海洋微生物石油修復(fù)方面的研究

一直以來，常用微生物降解石油烴進(jìn)行海洋石油污染修復(fù)，對(duì)比其他方法有著無可比擬的優(yōu)越性。但有些海洋微生物處于極端環(huán)境，并且海洋環(huán)境中可培養(yǎng)的微生物僅占0.001%～0.1%。宏基因組技術(shù)無需培養(yǎng)微生物，可直接從環(huán)境中提取微生物的基因組，篩選出低溫環(huán)境中活性較高的微生物及新活性物質(zhì)。因此，宏基因組學(xué)在海洋微生物石油修復(fù)中有很好的應(yīng)用前景。2019年Luciana R.Appolinario、DiogoTschoeke、Raphael V.S.Paix?o等在南太平洋利用宏基因組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)了降解石油的微生物的代謝物質(zhì)。

此外，宏基因組學(xué)技術(shù)若與其他技術(shù)相結(jié)合還可以更好地提升海洋石油污染生物修復(fù)的效果?？傊?，宏基因組學(xué)可以用于開發(fā)新功能的海洋微生物和基因，從而運(yùn)用于海洋石油污染治理，有十分大的開發(fā)潛力。

3 展望

無論是對(duì)海洋環(huán)境中微生物多樣性的研究，還是發(fā)現(xiàn)新型生物活性催化劑或活性化合物的研究，宏基因組技術(shù)都可以在這些方面有廣泛的應(yīng)用前景。由于宏基因組學(xué)技術(shù)操作簡便，培養(yǎng)技術(shù)相對(duì)于傳統(tǒng)基因組學(xué)培養(yǎng)技術(shù)更先進(jìn)，該技術(shù)在測(cè)序以及生物信息學(xué)分析上有更大的進(jìn)步空間。

此外， 宏基因組技術(shù)在生物資源研究方面有很明顯的優(yōu)勢(shì)，但是由于該技術(shù)還不夠成熟，仍然有一些問題需要解決，如：如何高效提取DNA、如何選擇更高效的提取載體以及篩選的方法。因?yàn)楹昊蚪M學(xué)涉及領(lǐng)域十分廣泛，我們可以將現(xiàn)代分子技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)以及生物信息學(xué)與宏基因組技術(shù)相融合，在各個(gè)領(lǐng)域獲得更廣泛的應(yīng)用。

宏基因組技術(shù)在國內(nèi)外已經(jīng)有如此廣泛的應(yīng)用前景，因此各國在海洋生態(tài)系統(tǒng)建設(shè)方面也都有一定的貢獻(xiàn)。許多實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目正在進(jìn)行當(dāng)中，主要針對(duì)于從極端環(huán)境中提取新型海洋微生物，發(fā)現(xiàn)一些新型產(chǎn)物，并在健康、醫(yī)療、保健等方面有一定突破。目前，研究人員在海洋微生物方面的研究有卓越貢獻(xiàn)，并得到了各國政府的大力支持。