孫 譜，孫婉薷，王 波，石占成，鞏宏杰

(蘇州大學(xué)，江蘇 蘇州 215123)

1 引言

枇杷(Eriobotryajaponica(Thund.)Lindl.)屬薔薇科(Rosaceae)枇杷屬(Eriobotrya Lindl.)多年生常綠小喬木，因形似琵琶而得名，原產(chǎn)中國[1]，因其果肉細(xì)膩，保健價值高而深受消費者喜愛[2]，在我國長江以南各省均有種植，是南方一種較為常見的水果，具有較強的市場競爭力，市場前景廣闊[3]。枇杷樹因為生長旺盛，每年會產(chǎn)生大量的枝葉廢棄物，因其含有大量的蟲卵，如果不加以妥善處置，容易滋生病蟲害，進(jìn)而影響枇杷正常生長發(fā)育。將其堆制成有機肥就成為資源化利用枇杷枝葉的重要途徑之一。

將枇杷枝葉堆制成有機肥存在諸多技術(shù)難點，其中一個重要的障礙就是廢棄物中纖維素含量較高[4,5]，難以分解。當(dāng)前，纖維素降解菌分解纖維素類物質(zhì)的效果不佳，纖維素降解菌產(chǎn)酶量也相對較少，針對此種現(xiàn)象，大部分的研究人員多探究的是單一菌株對纖維素類物質(zhì)降解效果，卻忽視了將多種纖維素降解菌混合培養(yǎng)，很少探究復(fù)合菌群對纖維素的降解能力。大量的試驗研究發(fā)現(xiàn)，僅僅依靠單一的菌株是很難將纖維素類物質(zhì)充分降解。在復(fù)合高效微生物混合作用下，降解纖維素的效率比單一菌株效果更好，分解得更加徹底[6,7]。有很多學(xué)者還在研究復(fù)合微生物菌劑如何可以達(dá)到更好的效果。吳穎等人[8]通過調(diào)整菌種配比來降低各菌株間的拮抗作用，使復(fù)合菌劑效果更佳。為了加快木本廢棄物中纖維素的降解速度，促進(jìn)木本廢棄物堆肥化的發(fā)展，建立復(fù)合菌團(tuán)，即2種或2種以上的菌株相互作用，具有非常重要的意義[9]。

本研究室在先前試驗中分離篩選出的3種纖維素高效降解菌株[10]，擬將這3種微生物分別稱為A菌株、B菌株和C菌株，按照相互混合進(jìn)行組合培養(yǎng)，通過濾紙條降解試驗和測定纖維素含量的變化來說明不同菌團(tuán)對木本廢棄物的降解效果，同時將上述菌株按照不同處理添加進(jìn)堆體材料中進(jìn)行發(fā)酵試驗，利用掃描電子顯微鏡觀測不同微生物處理下不同發(fā)酵進(jìn)程中堆體材料表面微生物分布、微觀形態(tài)變化特征。從而構(gòu)建篩選出高效的，為纖維素復(fù)合菌團(tuán)降解木本材料提供理論依據(jù)，也為資源化利用枇杷枝葉提供技術(shù)支撐。

2 材料與方法

2.1 試驗材料與培養(yǎng)基組成

(1)堆肥原料。由蘇州市吳中區(qū)東山鎮(zhèn)提供，將枇杷枝、葉按照7∶3比例混合，粉碎過篩備用。

(2)培養(yǎng)基：①液態(tài)改良高氏1號，KNO31.0 g/L，K2HPO40.5 g/L，MgSO40.5 g/L，NaCl 0.5 g/L，F(xiàn)eSO40.01 g/L，葡萄糖10.0 g/L，蛋白胨5.0 g/L，蒸餾水1000 mL。②赫奇遜(Hutchinson),KH2PO41.0 g/L，NaCl 0.1 g/L，MgSO4·7H2O 0.3 g/L，NaNO32.5 g/L，F(xiàn)eCl30.01 g/L，CaCl20.1 g/L，蒸餾水1000 mL。上述培養(yǎng)基所用試劑均為分析純，初始pH均調(diào)至7.2左右，并在121 ℃滅菌30 min。

2.2 濾紙降解與堆肥試驗

將篩選獲得的3種菌株(A菌株、B菌株和C菌株)按照體積比進(jìn)行組合，設(shè)置8個處理，分別為處理1(菌株A)、處理2(菌株C)、處理3(菌株B)、處理4(菌株A+C)、處理5(菌株A+B)、處理6(菌株B+C)、處理7(菌株A+B+C)、處理8(對照，無菌株)。將上述8個處理菌種分別接種到液態(tài)改良高氏1號培養(yǎng)基中制備成菌液，30 ℃、160 r/min培養(yǎng)5 d。然后在含有1 cm×6 cm的濾紙條的赫奇遜氏培養(yǎng)基內(nèi)加進(jìn)1 mL的菌液，30 ℃、160 r/min培養(yǎng)10 d。

將枝葉混合物進(jìn)行堆肥試驗，每隔10 d從堆體中間離表層約15 cm處采集多點混合樣，烘至恒重，粉碎過0.25 mm篩，待測。

2.3 樣品測試與電鏡觀察

(1)降解試驗。以“+”數(shù)量的多少來表示濾紙崩潰程度?！?”-濾紙幾乎無變化；“+”為濾紙邊緣出現(xiàn)膨脹；“++”為濾紙整體出現(xiàn)膨脹并已下彎；“+++”為濾紙呈現(xiàn)不定狀；“++++”為濾紙呈現(xiàn)糊狀。

(2)纖維素測定。細(xì)胞壁提取：稱取約0.3 g枝葉混合樣，加1 mL 80%乙醇，室溫快速勻漿，90 ℃水浴20 min，冷卻至室溫，25 ℃、6000 r/min離心10 min，棄去清液，沉淀先后加1.5 mL 80%乙醇和丙酮各洗一遍，25 ℃、6000 r/min離心10 min，棄去清液，沉淀即為粗細(xì)胞壁，加試劑一1 mL，浸泡15 min，25 ℃、6000 r/ min離心10 min，棄去清液，將沉淀干燥，即為細(xì)胞壁物質(zhì)，烘干備用。

纖維素提取與測試：稱細(xì)胞壁物質(zhì)約5 mg，加0.5 mL蒸餾水勻漿，用蒸餾水定容至0.5 mL，置冰水浴中，緩慢加入0.75 mL濃硫酸，混勻，冰水浴靜置30 min，4 ℃、8000 r/min，離心10 min，取上清液，蒸餾水稀釋20倍，用分光光度計在620 nm處測定吸光值。

纖維素(mg/g干重)=[(△A+0.0043)/7.875×V1]/(W×V1/V2)×20=3.17×(△A+0.0043)/W

(1)

式(1)中，V1:加入樣本體積，0.3 mL；V2：加入提取液體積，1.25 mL；W：樣本干重，約5×10-3g；20：表示樣本稀釋倍數(shù)。

(3)電鏡觀察。分別于第0 d，第11 d，第21 d采樣。加入2 %的戊二醛進(jìn)行固定，再用PBS緩沖液漂洗樣品3次，每次10 min。然后對樣品按濃度分別為30 %、50 %、70 %、80 %、90 %、100 %的乙醇溶液進(jìn)行逐級脫水處理，每次為10 min，再用乙酸異戊醇置換 2 次，每次為15 min，并用二氧化碳臨界點干燥儀進(jìn)行干燥處理，繼而用離子噴濺儀進(jìn)行鍍金，最后用JEOL JSM-6390A掃描電子顯微鏡進(jìn)行觀察。

2.4 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)分析使用Excel數(shù)據(jù)處理軟件，數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS17.0軟件。

3 結(jié)果與分析

3.1 濾紙降解

添加微生物處理可以明顯影響濾紙降解(表1)。處理20 d后，對照中濾紙幾乎沒有變化，而添加微生物處理的濾紙變化明顯。復(fù)合菌團(tuán)處理的濾紙降解程度明顯高于單一菌株處理，A、B、C單一菌株處理降解速度較慢，在第20 d時濾紙邊緣僅膨脹。而AC處理和BC處理分別在第18 d和第20 d出現(xiàn)濾紙下彎。整個試驗以AB處理和ABC處理降解速度為最快，在第20 d時2個處理濾紙均呈不定狀。

表1 不同微生物處理對濾紙條降解的影響(20 d)

3.2 纖維素降解

隨著處理時間的增加，堆體材料中纖維素含量逐漸下降(表2)，添加0、1、2、3種微生物處理21d后堆體纖維素含量分別比起始纖維素含量分別下降13.09%、22.40%、31.83%和40.22%，添加ABC復(fù)合菌團(tuán)處理的纖維素含量分別僅為添加0、1、2種微生物的68.79%、77.03%、87.69%，說明添加微生物種類越多，堆體材料中纖維素含量下降越多，降解堆體材料的能力就越強。

處理時間相同的情況下，如7 d、14 d和21 d，均以CK處理纖維素含量最高，添加微生物后，堆體纖維素含量均低于CK處理，且與CK的差異均達(dá)到顯著水平，進(jìn)一步說明添加微生物可以顯著促進(jìn)堆體降解。添加ABC復(fù)合菌團(tuán)的堆體材料纖維素含量最低，且與其他處理的差異均達(dá)顯著水平，說明采用ABC復(fù)合菌團(tuán)處理堆體材料的降解效果最佳。

表2 不同微生物處理對堆體材料纖維素含量的影響 g/kg

3.3 微生物分布

圖1顯示，電鏡照片顯示發(fā)酵前樣品的表面結(jié)構(gòu)基本完整，樣品的表面幾乎沒有微生物的分布(圖1a)。隨著發(fā)酵的進(jìn)程推進(jìn)(20 d)，微生物數(shù)量開始明顯增多，廣泛分布在樣品的表面，并且在因堆體材料降解而出現(xiàn)的縫隙中也觀察到微生物的存在(圖1b、c)，所觀察到的微生物形狀大部分是球狀體和絲狀體。

圖1 發(fā)酵時間對堆體材料表面微生物分布的影響

3.4 堆體材料結(jié)構(gòu)

添加ABC復(fù)合菌團(tuán)后，隨著發(fā)酵時間的推進(jìn)，堆體材料結(jié)構(gòu)變化明顯(圖2)。發(fā)酵前呈紋理清晰的棒狀結(jié)構(gòu)，表面較為光滑平整、致密規(guī)整、纖維束排列整齊、均勻、平滑呈自然伸展?fàn)顟B(tài)(圖2)。在添加ABC復(fù)合菌團(tuán)一段時間后發(fā)現(xiàn)，原本光滑的棒狀結(jié)構(gòu)變得雜亂無章形狀各異(圖2b、c)，處理10 d后的表面開始出現(xiàn)破碎，纖維束也呈現(xiàn)斷裂、粗糙、空穴的現(xiàn)象(圖2)，發(fā)酵20 d后其致密有序結(jié)構(gòu)遭到破壞，排列疏松且沒有規(guī)則，有較多微生物附著在表面，甚至侵入內(nèi)部，出現(xiàn)較多碎片結(jié)構(gòu)(圖2c)。

圖2 發(fā)酵時間對堆體材料結(jié)構(gòu)的影響

在同一時間(第10 d)，添加不同微生物(A處理、AB復(fù)合菌團(tuán)處理、ABC復(fù)合菌團(tuán)處理)的堆體材料結(jié)構(gòu)差異明顯(圖3)。A處理的堆體材料表面比較完整光滑、排列方式很規(guī)則、結(jié)構(gòu)致密有序、具有明顯的纖維形態(tài)特點，能夠觀察到表面完整清晰的構(gòu)造。而經(jīng)過AB處理10 d后的堆體材料，其表面結(jié)構(gòu)開始受到破壞，但仍然能夠保持原有結(jié)構(gòu)。添加ABC處理10 d后的堆體材料表面能觀察到很多維管纖維素被切斷并且顯露出來，排列疏松且無規(guī)則。說明在本試驗條件下，ABC復(fù)合菌團(tuán)對枇杷枝葉形成的堆體材料分解效果最好。

圖3 不同微生物處理(A,AB,ABC)對堆體材料結(jié)構(gòu)的影響(10 d)

4 討論與結(jié)論

枇杷廢棄物中因含有大量的木質(zhì)纖維素而導(dǎo)致降解困難。其中的纖維素由于氫鍵的作用以及它的外面包裹著大量的木質(zhì)素和纖維素，其木質(zhì)素是整體抗性結(jié)構(gòu)成分，是一種非均相復(fù)雜的酚類聚合物，使其降解的難度非常大[10,11]。木質(zhì)素是一種交聯(lián)酚醛樹脂，具有剛性，不易腐爛，堆肥過程中木質(zhì)素的降解主要依賴于木質(zhì)素分解酶，這也是木質(zhì)素降解微生物分泌的一種胞外酶[12]。白腐真菌就是通過獨特的細(xì)胞外氧化酶系統(tǒng)和細(xì)胞內(nèi)酶系統(tǒng)，分泌的三種典型的木質(zhì)素分解酶：木質(zhì)素過氧化物酶(Lip)、錳過氧化物酶(Mnp)和銅基漆酶(Lac)，將木質(zhì)素有效降解[13]。纖維素和半纖維素的早期降解是由于初始混合物中含有大量可降解的有機化合物，刺激了微生物生物量的增加和酶的合成。纖維素是由復(fù)雜的酶蛋白混合物組成，微生物產(chǎn)生的一系列酶(如纖維素酶和木聚糖酶)可以降解纖維素和半纖維素[14]。本研究通過濾紙條降解試驗和測定纖維素含量的變化表明復(fù)合菌團(tuán)可顯著降低堆體材料中纖維素的含量，其中ABC復(fù)合菌團(tuán)處理中纖維素含量由開始的29.37%降至最終的17.56%，降解率達(dá)到40.22%。說明在含較多木質(zhì)纖維素的材料堆肥過程中，復(fù)合菌團(tuán)比單一菌株具有更強的纖維素降解能力，其中復(fù)合菌團(tuán)ABC具有最強的纖維素降解能力。通過掃描電子顯微鏡觀察微生物堆堆體材料侵染過程可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)微生物在侵入到發(fā)酵物內(nèi)部時，其致密結(jié)構(gòu)才可能發(fā)生改變，導(dǎo)致木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)受到了不同程度的破壞，能夠有效地加速其分解。

研究發(fā)現(xiàn)，雖然已經(jīng)分離到200多種可降解木質(zhì)纖維素的細(xì)菌、真菌和放線菌[15]，由于木質(zhì)纖維素分子量大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，難以被單一微生物降解利用，通常需要不同微生物菌株之間的協(xié)同作用，才能進(jìn)行降解[16]。這可能是由于降解過程中菌株代謝過程中產(chǎn)生的乙酸等會抑制菌株的正常生長和降低纖維素酶的活性，而多種微生物組成的微生物復(fù)合菌團(tuán)可相互作用形成一個微小穩(wěn)定的生態(tài)閉環(huán)，不同種微生物菌株之間相互作用能有效提高木質(zhì)纖維素的降解效率[8]。楊林麗[17]將各種菌種按照不同的組合方式組合到一起后，能夠具有效果非常好的協(xié)同作用，起到促進(jìn)纖維素類物質(zhì)的降解。樸哲等[18]在試驗中觀察到，在秸稈堆肥發(fā)酵過程中幾乎沒有看到桿菌的存在。他們分析有可能是由于營養(yǎng)環(huán)境不足導(dǎo)致有些桿菌的微觀形態(tài)接近于球形，所以沒有被辨認(rèn)出來。艾士奇等[19]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過復(fù)合菌團(tuán)處理的樣品表面致密結(jié)構(gòu)隨著發(fā)酵的進(jìn)行，維管束纖維逐漸大面積被降解，發(fā)酵結(jié)束時，樣品表面的完整結(jié)構(gòu)被嚴(yán)重破壞，最難降解的外表皮上的蠟質(zhì)硅化層大部分降解消失，只剩下部分嚴(yán)重木質(zhì)化的表皮組織。黃得揚等[20]通過對菌株組合，將復(fù)合菌團(tuán)作為接種劑應(yīng)用于蔬菜廢物和花卉秸稈的堆肥研究得到了類似的結(jié)果。