張玲艷 王榮 柳汀 蔡揚(yáng) 1.貴州醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，貴陽 55000；.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙周黏膜科，貴陽 55000；3.綿陽市中心醫(yī)院口腔科，綿陽 61000；.口腔疾病研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院正畸科，成都 61001

口腔扁平苔蘚（oral lichen planus，OLP）是一種較常見的口腔黏膜慢性炎性疾病[1]，具有病程遷延、有癌變危險的特點(diǎn)[2]。目前，OLP的病因和發(fā)病機(jī)制尚未明確，研究[3]認(rèn)為T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫與其發(fā)病密切相關(guān)，其典型病理學(xué)改變?yōu)榛准?xì)胞液化變性及固有層T淋巴細(xì)胞呈帶狀浸潤。白細(xì)胞介素（interleukin，IL）35是一種具有獨(dú)特免疫抑制作用的分泌型蛋白，主要由調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regula tory T cells，Treg）分泌，且是Treg發(fā)揮免疫抑制作用的關(guān)鍵細(xì)胞因子，其生物學(xué)功能的發(fā)揮有賴于細(xì)胞表面受體的表達(dá)[4-6]。IL-35受體（interleukin-35 receptor，IL-35R）由gp130和IL-12受體β2（interleukin-12 recep-tor β2，IL 12Rβ2）構(gòu)成，當(dāng)IL-35與IL-35R結(jié)合，可激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子（singal transducer and activator of transcription，STAT）1和（或）STAT4，從而增加IL-35的表達(dá)，形成IL-35反饋回路，發(fā)揮免疫抑制作用[7-10]。本課題組前期研究[11]發(fā)現(xiàn)，IL-35在OLP組織中的表達(dá)升高，且與臨床分型有關(guān)，提示IL-35在OLP局部病損形成和發(fā)展中具有重要作用。為進(jìn)一步研究IL-35信號通路相關(guān)因子在OLP發(fā)生發(fā)展中的意義，本研究通過檢測IL-35R兩亞基gp130、IL 12Rβ2及STAT1、STAT4在OLP組織中的表達(dá)，分析IL-35R與OLP患者臨床特征的相關(guān)性，探討IL-35R在OLP病損形成及發(fā)展中的作用和意義。

1 材料和方法

本項(xiàng)研究經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理學(xué)委員會審批[2014倫審第（06）號]，所有研究對象均被告知研究內(nèi)容并均簽署知情同意書。

1.1 標(biāo)本來源

研究納入的41例OLP組織來自2010年10月—2016年12月就診于貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院口腔黏膜?？崎T診的初診患者（OLP組）。納入標(biāo)準(zhǔn)：參考衛(wèi)生部規(guī)劃教材《口腔黏膜病學(xué)》第4版OLP診斷標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合OLP臨床表現(xiàn)和組織病理學(xué)檢查[1]確診為OLP者。排除標(biāo)準(zhǔn)：1）1個月內(nèi)使用過抗生素，3個月內(nèi)使用過糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等相關(guān)藥物者；2）伴全身系統(tǒng)性疾病，既往有免疫系統(tǒng)性疾病者；3）某些藥物、殘冠殘根或銀汞合金充填物等引起苔蘚樣反應(yīng)者；4）患感染性疾病、腫瘤及其他口腔黏膜病者；5）處于妊娠及哺乳期女性患者。

研究納入的15例正?？谇火つそM織來自于正頜手術(shù)或牙齦環(huán)切術(shù)的正常口腔黏膜（對照組），均經(jīng)病理科證實(shí)無明顯炎癥及病理改變。

將收集到的組織標(biāo)本分為2份：一部分經(jīng)過石蠟包埋，制備組織切片用于免疫組織化學(xué)染色；另一部分保存在RNA液中，用于mRNA檢測。

1.2 主要試劑及儀器

鼠抗人gp130單克隆抗體（Santa Cruz公司，美國），兔抗人IL 12Rβ2多克隆抗體（Abcam公司，美國），DAB顯色試劑盒、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）抗原修復(fù)液（pH=9.0）、PV6001山羊抗兔IgG/辣根過氧化物酶（hor-seradish peroxidase，HRP）聚合物、PV6002山羊抗小鼠IgG/HRP聚合物（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），RNAiso Plus、Prime ScriptTMRT Reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒（寶生物工程大連有限公司），F(xiàn)ast Start Essential DNA Green Master試劑盒（Roche公司，瑞士），電熱恒溫培養(yǎng)干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司），YS100光學(xué)顯微鏡（Nikon公司，日本），核酸蛋白分析儀（Gene Quant 100，Bioch-rom公司，美國），聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增儀、CFX96熒光定量PCR儀、GelDoc XR+凝膠成像分析系統(tǒng)（BIO-RAD公司，美國）。實(shí)時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）引物設(shè)計與合成均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成，引物序列詳見表1。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 qPCR 取樣本組織50 mg，Trizol法提取組織總RNA，檢測RNA濃度及純度；按照Prime ScriptTMRT Reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成cDNA。按照Fast Start Essential DNA Green Master試劑盒說明在冰上配制10 μL qPCR反應(yīng)體系，在熒光定量PCR儀上機(jī)并設(shè)置反應(yīng)條件：95 ℃10 min；95 ℃10 s，60 ℃15 s，共40個循環(huán)。

qPCR結(jié)果判斷：利用軟件Bio-Rad CFX Manager 3.0獲取數(shù)據(jù)Ct值，通過擴(kuò)增曲線和溶解曲線分析排除非特異性擴(kuò)增，每個樣本重復(fù) 2 次，使用2 ΔCt法[12]對gp130、IL 12Rβ2、STAT1、STAT4基因的表達(dá)進(jìn)行相對定量分析。

表 1 引物序列Tab 1 Primer sequence

1.3.2 免疫組織化學(xué) 采用免疫組織化學(xué)超敏二步法檢測OLP組織以及正常口腔黏膜組織切片中g(shù)p130、IL 12Rβ2蛋白的表達(dá)。檢測時均采用高溫高壓抗原修復(fù)（切片浸入裝有pH=9.0 EDTA抗原修復(fù)液的修復(fù)盒內(nèi)，修復(fù)盒放入裝有水的高壓鍋中，高溫加熱4 min）；一抗：鼠抗人gp130單抗（1︰100）、兔抗人IL 12Rβ2多抗（1︰200）；二抗：gp130用PV6002山羊抗鼠IgG/HRP聚合物、IL 12Rβ2用PV6001山羊抗兔IgG/HRP 聚合物；嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行操作，用已知陽性表達(dá)gp130、IL 12Rβ2的人胎盤組織切片作陽性對照，以PBS代替一抗為陰性對照。

染色結(jié)果判定：陽性染色表現(xiàn)為棕黃色顆粒，gp130、IL 12Rβ2陽性染色主要位于細(xì)胞膜。按照Fu等[13]的方法進(jìn)行分析，2人雙盲閱片，每張切片隨機(jī)選取觀察5個400倍視野觀察，計算5個視野中陽性細(xì)胞數(shù)的平均百分比。陽性細(xì)胞計分：0分（≤5%）；1分（6%～25%）；2分（26%～50%）；3分（51%～75%）；4分（>75%）。細(xì)胞染色強(qiáng)度計分：0分（無染色），1分（淡黃色），2分（棕黃色），3分（棕褐色）。以兩計分之積判斷染色結(jié)果：0～2分為陰性（-），3～5分為弱陽性（+），6～8分為陽性（++），9～12分為強(qiáng)陽性（+++），將+～+++都?xì)w為陽性表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 23.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。所有的計量資料數(shù)據(jù)經(jīng)K-S正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，2組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用“M（Q25，Q75）”的形式表示，2組間均數(shù)比較采用秩和檢驗(yàn)；計數(shù)資料用卡方檢驗(yàn)；gp130、IL 12Rβ2蛋白表達(dá)與OLP臨床特征（臨床類型、病程）的相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 2組的基本信息分析

OLP組患者的年齡為18～70歲，平均年齡（44.1±12.6）歲；男性18例，女性23例；非糜爛型21例，糜爛型20例；病程≥6個月者15例，病程<6個月者26例。對照組患者的年齡為19～67歲，平均年齡（46.4±14.5）歲；男性7例，女性8例。統(tǒng)計分析表明，OLP組和對照組年齡、性別的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（年齡，t=-0.581，P=0.564；性別，χ2=0.034，P=0.854）。

2.2 gp130、IL 12Rβ2、STAT1、STAT4 mRNA的表達(dá)

OLP組gp130、IL 12Rβ2、STAT1、STAT4 mRNA的相對表達(dá)量均高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，表2）；但在OLP不同臨床類型之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05，圖1）。

表 2 2組gp130、IL-12Rβ2、STAT1、STAT4 mRNA的表達(dá)Tab 2 The expression levels of gp130, IL-12Rβ2, STAT1, STAT4 mRNA in 2 groups

2.3 gp130、IL 12Rβ2蛋白的表達(dá)

gp130和IL 12Rβ2蛋白在對照組中均為陰性表達(dá)，在OLP組中的陽性表達(dá)率分別為36.59%（15/41）、34.15%（14/41）。OLP組中g(shù)p130、IL 12Rβ2蛋白的陽性表達(dá)率均高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（gp130，χ2=7.496，P=0.006；IL 12Rβ2，χ2=6.829，P=0.009）。在OLP組織固有層炎性浸潤細(xì)胞中可見散在分布的gp130、IL 12Rβ2陽性細(xì)胞，gp130、IL 12Rβ2陽性染色主要位于細(xì)胞膜（圖2）。Spearman相關(guān)性分析顯示，gp130及IL 12Rβ2蛋白在OLP組織中的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.984，P<0.001）。

圖 1 非糜爛型、糜爛型OLP組織和正?？谇火つそM織gp130、IL 12Rβ2、STAT1、STAT4 mRNA的表達(dá)Fig 1 The expression of gp130, IL 12Rβ2, STAT1, STAT4 mRNA in non erosive, erosive OLP tissues and normal oral mucosa

圖 2 gp130、IL 12Rβ2的表達(dá) 免疫組織化學(xué)Fig 2 The expression of gp130, IL 12Rβ2 immunohistochemistry

2.4 gp130、IL 12Rβ2與OLP臨床特征的相關(guān)性

gp130、IL 12Rβ2蛋白與OLP臨床特征的相關(guān)性分析表明，糜爛型OLP組織中g(shù)p130、IL 12Rβ2蛋白的陽性表達(dá)率高于非糜爛型OLP組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），但gp130、IL 12Rβ2蛋白的陽性表達(dá)率在不同病程OLP組中差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05，表3）。

3 討論

OLP是一種較常見的口腔黏膜慢性炎性疾病，其病因和發(fā)病機(jī)制尚未明確，目前普遍認(rèn)為細(xì)胞免疫在OLP的發(fā)生發(fā)展中占重要作用。研究[14-15]證實(shí)，具有促炎作用的Th17細(xì)胞以及具有抑制免疫炎癥作用的Treg細(xì)胞參與了OLP的發(fā)生發(fā)展，IL-35是Treg細(xì)胞發(fā)揮最大免疫抑制作用的關(guān)鍵細(xì)胞因子之一，在OLP的發(fā)生發(fā)展中具有一定作用。

表 3 gp130、IL-12Rβ2與OLP臨床特征的相關(guān)性分析Tab 3 The relationship gp130, IL-12Rβ2 expressions and clinical characteristics of OLP

IL-35是由Collison等[4]2007年首先發(fā)現(xiàn)并命名的IL-12家族新成員，由異源二聚體Ebi3和p35構(gòu)成，具有獨(dú)特的免疫抑制作用。IL-35主要通過誘導(dǎo)T細(xì)胞分化為特殊的新型調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，介導(dǎo)其免疫抑制功能；此外，還可通過促進(jìn)Treg細(xì)胞增殖、抑制Th17細(xì)胞分化來發(fā)揮其免疫抑制作用，從而抑制炎癥反應(yīng)，在炎癥性疾病、自身免疫性疾病及腫瘤中發(fā)揮重要作用[16-18]。本課題組前期研究[11]發(fā)現(xiàn)，IL-35在OLP組織中表達(dá)上調(diào)，且與臨床分型有關(guān)，提示IL-35在OLP局部病損形成及發(fā)展中具有重要作用。IL-35是一種分泌型蛋白，其生物學(xué)功能的有效發(fā)揮依賴于細(xì)胞表面受體的表達(dá)及STAT對其信號的傳導(dǎo)。因此，本研究就IL-35R及STAT進(jìn)行研究，以進(jìn)一步探討及完善IL-35信號通路相關(guān)因子在OLP發(fā)生發(fā)展中的意義。

IL-35R是由IL 12Rβ2和gp130組成的，IL-35與IL-35R結(jié)合可以激活T細(xì)胞中的STAT1和STAT4[19]。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)IL-35與其同源二聚體gp130:gp130或IL 12Rβ2:IL 12Rβ2結(jié)合，只激活STAT1或STAT4一個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分支，會導(dǎo)致IL-35的抑制活力部分喪失；當(dāng)IL-35與其異源二聚體gp130:IL 12Rβ2結(jié)合，誘導(dǎo)Janus激酶家族成員磷酸化，同時激活STAT1和STAT4進(jìn)行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，形成獨(dú)特的異源二聚體，促進(jìn)基因Ebi3和p35啟動子轉(zhuǎn)錄，從而上調(diào)IL-35的表達(dá)，形成IL-35的反饋回路，發(fā)揮最大的免疫抑制作用[7-10]。

本研究發(fā)現(xiàn)，gp130和IL 12Rβ2蛋白在OLP組織固有層浸潤的炎性細(xì)胞中呈陽性表達(dá)，且高于對照組，說明其與OLP局部病損的形成有關(guān)。通過分析gp130和IL 12Rβ2蛋白與OLP臨床特征的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，gp130和IL 12Rβ2蛋白與OLP的臨床類型有關(guān)，在糜爛型中的表達(dá)高于非糜爛型，但與OLP不同病程無相關(guān)性，提示IL-35R水平可能反映了OLP局部病損的形成及疾病的炎癥程度，但與OLP病程長短無關(guān)，不能反映疾病發(fā)展情況；且gp130和IL 12Rβ2蛋白與IL-35兩配體在OLP中的表達(dá)結(jié)果一致[11]，說明隨著OLP病情的加重，IL-35和IL-35R表達(dá)均升高，因此推測可能是IL-35與IL-35R結(jié)合中，部分IL-35與其同源二聚體結(jié)合，導(dǎo)致其免疫抑制作用部分喪失，以致IL-35發(fā)揮的免疫抑制作用不能彌補(bǔ)OLP免疫抑制功能的不足，從而使疾病加重，提示IL-35R協(xié)同IL-35參與了OLP的發(fā)病過程。

STAT1和STAT4是具有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能的蛋白質(zhì)家族成員，不僅能把細(xì)胞外的信號傳遞到細(xì)胞內(nèi)，而且能直接參與細(xì)胞的基因調(diào)控，調(diào)節(jié)免疫、炎癥反應(yīng)[20]，亦是IL-35R信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中不可缺少的下游細(xì)胞因子。本研究運(yùn)用qPCR檢測gp130、IL 12Rβ2、STAT1和STAT4 mRNA的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)其在OLP組織中明顯升高，提示IL-35R激活后，進(jìn)一步激活下游STAT1和STAT4基因的表達(dá)，從而對IL-35信號進(jìn)行傳導(dǎo)。因此推測：IL-35與IL-35R結(jié)合后，激活JAK激酶，啟動下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，上調(diào)IL-35的表達(dá)，從而形成IL-35的反饋回路，發(fā)揮IL-35免疫抑制作用，參與OLP疾病的發(fā)生。

本研究中g(shù)p130、IL 12Rβ2蛋白在糜爛型OLP與非糜爛型OLP中的表達(dá)具有差異，而其mRNA的表達(dá)在OLP兩型中無差異，分析其原因可能有：1）mRNA到蛋白質(zhì)需經(jīng)翻譯、加工、修飾等一系列過程，基因翻譯的調(diào)控因素可能調(diào)節(jié)了蛋白的表達(dá)；2）mRNA與蛋白質(zhì)的半衰期不同，mRNA極易降解，而蛋白質(zhì)性質(zhì)相對較穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)過程中可能部分標(biāo)本mRNA發(fā)生降解。蛋白質(zhì)是行使功能的基本單位，故認(rèn)為gp130、IL 12Rβ2蛋白對OLP的發(fā)生具有一定的調(diào)節(jié)作用。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)，IL-35R及STAT在OLP組織中表達(dá)升高，且與臨床分型有關(guān)，提示IL-35R及STAT的異常表達(dá)可能參與了OLP的發(fā)生。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。