孫巧珍 石凡 羅丹 徐婷 王升志

1.青島大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，青島 266003；2.青島大學(xué)附屬煙臺毓璜頂醫(yī)院口腔頜面外科，煙臺 264000

患者自身腫瘤細胞免疫原性較弱，免疫細胞較少浸潤腫瘤組織，加之免疫抑制微環(huán)境的存在，使得免疫治療仍面臨單獨治療療效不理想，患者響應(yīng)率低等諸多問題[1-4]。因此，尋求更多增強腫瘤細胞免疫原性的方法與途徑，有助于提高腫瘤治療的療效[5]。近年來的研究[2,6-10]發(fā)現(xiàn)，部分特定的化療藥物、紫外線、γ 射線及光熱治療，在誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生凋亡的同時，會促使其表達與釋放一系列損傷相關(guān)分子模式（danger associated molecular patterns，DAMPs），可作為一種內(nèi)源性危險信號，增強腫瘤細胞免疫原性，并進一步介導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng)。熱療（hyperthermia，HT）與化療聯(lián)合應(yīng)用時的協(xié)同增敏作用已在多種類型癌癥治療中得到驗證[11-13]。既往的研究[14-15]證實，熱化療可提高荷瘤宿主及口腔癌患者體內(nèi)細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic T lym-phocyte，CTL）和自然殺傷細胞（natural killer cell，NK cell）的數(shù)目及活性，白細胞介素-2 （interleukin-2，IL-2）和腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）的活性水平，并促進熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）70在腫瘤細胞特異性的高表達等。本研究選取3株口腔鱗狀細胞癌不同細胞系，探討熱化療誘導(dǎo)口腔鱗狀細胞癌細胞表達DAMPs，從而增強免疫原性的作用，以期為熱化療與免疫療法聯(lián)合治療口腔鱗狀細胞癌提供思路。

1 材料和方法

1.1 材料

口腔鱗狀細胞癌CAL27、SCC-15和Tca8113細胞（煙臺毓璜頂醫(yī)院中心實驗室、青島市立醫(yī)院實驗室提供）；1640培養(yǎng)基及胎牛血清（Biological Industries BI公司，以色列）；胰蛋白酶、DMSO等（Gibco公司，美國）；CCK-8試劑（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；Anti-Calreticulin antibody（Ab-cam公司，英國）；FITC Annexin V Apoptosis Detec-tion kit Ⅰ（BD Biosciences公司，美國）；注射用鹽酸平陽霉素（pingyangmycin，PYM）（吉林敖東藥業(yè)集團延吉股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將保存于液氮罐中的口腔鱗狀細胞癌CAL27、SCC-15和Tca8113細胞取出置于37 ℃水浴鍋快速解凍，然后以1 000 r·min-1速度離心5 min后收集細胞，用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3 d傳代一次，待細胞生長狀況穩(wěn)定、呈對數(shù)生長期時，收集細胞用于實驗。

1.2.2 CCK-8實驗檢測PYM對細胞的半數(shù)抑制濃度（inhibiting concentration，IC50） 收集對數(shù)生長期的細胞，以每孔100 μL（104個細胞）接種于96孔板，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育過夜。待細胞貼壁后，棄上清，分別加入100 μL濃度為80、40、20、10、5、2.5 μg·mL-1的PYM溶液，每種濃度設(shè)置5個復(fù)孔，并設(shè)置空白孔（無細胞培養(yǎng)孔）與對照孔（未加藥物處理的細胞培養(yǎng)孔）。藥物干預(yù)24 h后，每孔加入100 μL CCK 8溶液（含10%的CCK-8），2 h后于酶標儀上檢測各孔在450 nm處的光密度（optical den-sity，OD）值。細胞抑制率（%）=（實驗組OD值-對照組OD值）/對照組OD值×100%，計算IC50。

1.2.3 熱療 將處理組細胞培養(yǎng)瓶分別于39、42、45 ℃恒溫培養(yǎng)箱孵育60 min后，放回至37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱復(fù)溫孵育。

1.2.4 細胞分組 細胞分組如下。1）對照組：常規(guī)培養(yǎng)細胞，不經(jīng)任何處理；2）化療組：工作濃度（IC50）PYM處理細胞24 h，37 ℃恒溫培養(yǎng)；3）熱療組：將細胞分別于39、42、45 ℃培養(yǎng)箱處理60 min后，放回至37 ℃復(fù)溫培養(yǎng)24 h；4）聯(lián)合組（HT+PYM）：工作濃度PYM處理細胞并于不同溫度培養(yǎng)箱培養(yǎng)60 min后，放回至37 ℃復(fù)溫培養(yǎng)24 h。

1.2.5 膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）/碘化丙啶（propi-dium iodide，PI）聯(lián)合染色以及流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 不同組細胞經(jīng)熱療、化療及熱化療聯(lián)合處理后，分別消化收集各組細胞（包括上清液中的細胞），洗滌2次后1 200 r·min-1離心5 min，棄上清，Buffer重懸細胞并計數(shù)。取100 μL細胞懸液（密度為每毫升1×106個），離心棄上清，100 μL 1×Binding Buffer重懸，加入5 μL FITC Annexin V吹打混勻后，再加入5 μL PI混勻，置室溫（20～25 ℃）避光孵育15 min，洗滌2遍離心后，加入400 μL 1×Binding Buf fer重懸上流式細胞儀檢測。

1.2.6 流式細胞儀檢測細胞表面鈣網(wǎng)蛋白（calreticu-lin，CRT）表達率 不同組細胞經(jīng)熱療、化療及熱化療聯(lián)合處理后，分別消化收集各組細胞，洗滌2次后1 200 r·min-1離心5 min，棄上清，Buffer重懸細胞并計數(shù)。取100 μL細胞懸液（密度為每毫升1×106個），滴加2 μL Anti Calreticulin antibody吹打混勻后，置室溫避光孵育30 min，洗滌2遍離心后，加入500 μL Buffer重懸上流式細胞儀檢測。

1.2.7 酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosor-bent assay，ELISA）檢測細胞上清中高遷徙率族蛋白B1（high-mobility group box 1，HMGB1）分泌情況 不同組細胞經(jīng)熱療、化療及熱化療聯(lián)合處理后，分別收集各組細胞上清液，1 200 r·min-1離心20 min，取上清檢測，具體步驟按照ELISA試劑盒說明書進行，當(dāng)標準孔出現(xiàn)明顯濃度梯度后，終止反應(yīng)，并立即于酶標儀檢測450 nm波長下的OD值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，結(jié)果以均數(shù)±標準差表示，多組間細胞凋亡率、CRT膜表達率及HMGB1分泌量差異比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PYM工作濃度的確定

PYM作用24 h對CAL27、SCC-15細胞的IC50為5 μg·mL-1，對Tca8113細胞的IC50為20 μg·mL-1，選定為工作濃度，進行后續(xù)實驗（表1）。

表 1 CCK-8法檢測PYM作用24 h時細胞的增殖抑制情況Tab 1 Cell inhibitation after 24 h chemotherapy of PYM was detected by CCK-8 assay %

2.2 不同溫度熱療對口腔鱗狀細胞癌細胞CRT膜表

達比例及HMGB1分泌的影響

流式細胞術(shù)及ELISA試驗檢測不同溫度熱療處理3株口腔鱗狀細胞癌細胞系后，CRT膜表達比例及HMGB1分泌的改變（圖1）。結(jié)果顯示：1）CAL27細胞及Tca8113細胞中，隨溫度升高，CRT膜表達比例及HMGB1分泌量均增加，39 ℃組、42 ℃組與對照組相比，CRT膜表達比例的升高無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），HMGB1分泌量的增加有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；而45 ℃組與對照組相比，CRT膜表達比例及HMGB1分泌量的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；且45 ℃組與39 ℃組和42 ℃組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。2）SCC-15細胞熱療處理后，CRT膜表達比例隨溫度升高而增加，但無論是熱療組與對照組比較還是溫度組間兩兩比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

2.3 熱化療對口腔鱗狀細胞癌細胞CRT膜表達比例及HMGB1分泌的影響

進一步檢測熱化療對3株細胞CRT膜表達比例及HMGB1分泌量的影響，結(jié)果見圖2。CAL27和Tca8113經(jīng)熱化療聯(lián)合處理后，CRT膜表達率升高明顯，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；而SCC-15細胞在經(jīng)PYM及熱化療聯(lián)合處理后，CRT膜表達率也升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。3株細胞經(jīng)PYM處理后HMGB1分泌均增多，且熱化療組HMGB1分泌量較單純PYM化療組升高明顯，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

2.4 熱化療對口腔鱗狀細胞癌細胞凋亡的影響

Annexin V/PI聯(lián)合染色及流式細胞術(shù)檢測熱化療處理3株細胞后細胞凋亡比例的改變。結(jié)果顯示：各組細胞凋亡比例較處理前均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；其中聯(lián)合組（PYM+45 ℃）與對照組及其他處理組兩兩比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），其晚期凋亡率（Annexin V+PI+）顯著增多，而早期凋亡（Annexin V+PI-）較其他處理組減少（圖3）。

3 討論

目前，口腔鱗狀細胞癌主要采取以手術(shù)為主的綜合序列治療。熱療作為繼手術(shù)、放療、化療及生物免疫治療之后的第五大腫瘤治療手段，以其提高患者生存質(zhì)量的獨特優(yōu)勢已經(jīng)成為綜合治療的有效治療方式之一。熱療常與化、放療聯(lián)合應(yīng)用以增強腫瘤對化、放療的敏感性[11-13]。傳統(tǒng)觀點認為，熱化療聯(lián)合應(yīng)用時療效的增強主要是通過熱誘導(dǎo)細胞凋亡、化療藥物的細胞毒作用以及熱化療聯(lián)合應(yīng)用時的協(xié)同作用。而近來研究顯示，與單一治療方式相比，熱化療聯(lián)合應(yīng)用不僅對原發(fā)腫瘤更為有效，而且可激活抗腫瘤免疫效應(yīng)，抑制遠端轉(zhuǎn)移瘤的生長[16]。這提示，熱化療聯(lián)合應(yīng)用不僅可增強腫瘤對化療的敏感性，而且具有免疫刺激作用。

部分特定的化療藥物、紫外線、γ 射線及光熱治療，在誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生凋亡的同時，會促使其表達與釋放DAMPs，增強腫瘤細胞免疫原性，并進一步介導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng)。CRT、HSP70、HMGB1以及三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）是此過程中重要的DAMPs，這些分子信號在細胞內(nèi)主要為非免疫原性，但釋放至細胞外后則可發(fā)揮免疫原性作用。細胞表面暴露的CRT，會向機體免疫系統(tǒng)發(fā)出“吃我”信號，通過與樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）和其他抗原呈遞細胞（antigen-presenting cells，APCs）上的CD91受體結(jié)合，促進腫瘤抗原的識別與吞噬；細胞外分泌的HMGB1可向機體免疫系統(tǒng)發(fā)出“危險”信號，通過與DCs上的toll樣受體4（toll-like receptor 4，TLR4）相結(jié)合，從而活化該受體介導(dǎo)的信號通路，誘導(dǎo)DCs的成熟，并且促進抗原的加工與提呈，從而介導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng)[2,6-10]。

圖 1 口腔鱗狀細胞癌細胞經(jīng)熱療處理24 h后CRT膜表達比例變化及HMGB1分泌情況Fig 1 Changes of the percentages of CRT membrane expression and the secretion of HMGB1 after 24 h hyperthermia

本研究先是應(yīng)用流式細胞術(shù)及ELISA試驗檢測不同溫度（39、42、45 ℃）處理3株口腔鱗狀細胞癌細胞系后，CRT膜表達比例及HMGB1分泌的改變。結(jié)果顯示，CAL27細胞及Tca8113細胞中，隨溫度升高，CRT膜表達比例及HMGB1分泌量均增加，其中，39、42 ℃組與對照組相比，CRT膜表達比例的升高無統(tǒng)計學(xué)意義；而45 ℃組CRT膜表達率的升高，較其他組兩兩比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。這與Adkins等[17]的研究結(jié)果相一致，即：高溫?zé)岑熆烧T導(dǎo)腫瘤細胞表達DAMPs。Adkins等[17]隨后將經(jīng)高溫?zé)岑熖幚砗蟮哪[瘤細胞與DCs共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞被依賴于細胞表面CRT的樹突狀細胞有效吞噬，并誘導(dǎo)了更高水平的CD8+T細胞的活化與增殖，發(fā)揮抗腫瘤作用。然而，SCC-15細胞經(jīng)熱療處理后，CRT膜表達比例雖隨溫度升高而增加，但無論與對照組比較還是溫度組間兩兩比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，這是否與該細胞株熱敏感性較差相關(guān)，仍需進一步探討研究。

本研究結(jié)果中，隨著溫度升高，CRT膜表達比例以及HMGB1分泌量均增加，但并非溫度越高越好、時間越長越好。熱療后腫瘤細胞會以不同的方式死亡，死亡方式的不同受溫度、熱處理時間、腫瘤細胞類型和細胞周期階段等影響。大量的研究證實，當(dāng)溫度大于44 ℃時，細胞以晚期凋亡為主，且壞死細胞數(shù)目顯著增多。臨床常用的也是被廣泛認可的基礎(chǔ)熱療有效溫度是43 ℃，本研究僅作體外細胞系探討，當(dāng)應(yīng)用于體內(nèi)實驗時，過高的溫度和過長的作用時間，由于不可避免的熱擴散，會嚴重損害周圍的健康組織，給患者帶來極大的不適。值得關(guān)注的是，隨著近年來光熱療法及磁熱療法等前沿?zé)岑熓侄蔚某掷m(xù)發(fā)展，高溫?zé)岑煹呐R床應(yīng)用已成為可能。

圖 2 口腔鱗狀細胞癌細胞經(jīng)熱化療處理24 h后CRT膜表達比例變化及HMGB1分泌情況Fig 2 Changes of the percentages of CRT membrane expression and the secretion of HMGB1 after 24 h thermo-chemotherapy

圖 3 口腔鱗狀細胞癌細胞經(jīng)熱化療處理24 h后凋亡細胞比例變化Fig 3 Changes of the percentages of apoptotic cells after 24 h thermo-chemotherapy

研究進一步探討了熱化療對細胞凋亡、CRT膜表達及HMGB1分泌的影響。結(jié)果證實了熱化療聯(lián)合在誘導(dǎo)CRT膜表達及HMGB1分泌方面的作用明顯優(yōu)于單純化療組，熱化療聯(lián)合應(yīng)用在誘導(dǎo)免疫原性調(diào)強方面可能具有協(xié)同作用。

通過查閱文獻，筆者分析認為，熱化療對CRT膜表達及HMGB1分泌的影響較單純化療組更為顯著，可能與以下途徑相關(guān)。1）內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路：CRT與HMGB1共同參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK/EIf2α/ATF4通路，HMGB1通過介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的PERK/EIf2α/ATF4信號通路誘導(dǎo)細胞凋亡[18]；而EIf2α激酶的磷酸化是CRT由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)至細胞膜表面轉(zhuǎn)位的必要條件[19]。由此，本實驗中，熱化療后CRT膜表達的增多以及HMGB1分泌的增多，可能是由熱化療啟動PERK/EIf2α/ATF4信號通路所調(diào)控。

2）凋亡途徑：熱化療后Bcl-2、Bax、Bak及caspase[20-21]等凋亡相關(guān)蛋白表達發(fā)生改變，并可能通過影響EIF2α酶的磷酸化，進而影響CRT由胞內(nèi)至細胞膜表面的轉(zhuǎn)位以及HMGB1的分泌。結(jié)合本實驗研究結(jié)果，熱化療后CRT膜表達的增多以及HMGB1分泌的增多，可能是由于熱化療后凋亡蛋白表達上調(diào)間接引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所致。

3）JNK-CRT-依賴途徑：Chang等[22]在其研究中發(fā)現(xiàn)Norch信號可以調(diào)控CRT的的表達，其主要是通過JNK-CRT-依賴途徑發(fā)揮作用；而王琳等[23]的研究曾發(fā)現(xiàn)，熱化療可以激活JNK信號通路。由此推論，熱化療后CRT膜表達的增多以及HMGB1分泌的增多，可能與熱化療激活JNK-CRT-依賴途徑有關(guān)。

綜上所述，熱療、PYM化療及熱化療聯(lián)合均能在誘導(dǎo)口腔鱗狀細胞癌細胞凋亡的同時促使DAMPs表達從而增強口腔鱗狀細胞癌細胞免疫原性，熱化療聯(lián)合應(yīng)用在凋亡誘導(dǎo)及誘導(dǎo)DAMPs表達方面效果均明顯優(yōu)于單純化療。這為增強口腔鱗狀細胞癌細胞免疫原性提供了一種新的方法，也為免疫治療聯(lián)合熱化療治療口腔鱗狀細胞癌提供了新的思路。然而，要證實熱化療可通過增強口腔鱗狀細胞癌細胞免疫原性的途徑介導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng)，后續(xù)仍需通過與DCs共培養(yǎng)等方式檢測其對免疫細胞成熟的影響，并通過進一步動物實驗及體內(nèi)實驗，驗證其介導(dǎo)抗腫瘤免疫應(yīng)答的能力。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。