王正亮,朱杭鋒,潘海波,俞曉平

(中國(guó)計(jì)量大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,浙江省生物計(jì)量及檢驗(yàn)檢疫技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,杭州 310018)

絲氨酸蛋白酶抑制劑(serine protease inhibitor,serpin) 是廣泛存在于昆蟲(chóng)體內(nèi)一類(lèi)結(jié)構(gòu)保守、功能多樣的蛋白酶抑制劑超家族，參與調(diào)控蟲(chóng)體生長(zhǎng)發(fā)育、激素分泌和免疫應(yīng)答等諸多重要生理過(guò)程(趙麗芳等,2016;Meekinsetal.,2017)。Serpin分子量大小一般在40～50 kD，蛋白質(zhì)序列N末端存在serpin的特有結(jié)構(gòu)域，C末端存在由大約20個(gè)氨基酸殘基組成的反應(yīng)中心環(huán)(reactive center loop,RCL)。Serpin的靶蛋白酶識(shí)別切割RCL的活性裂解位點(diǎn)并與之共價(jià)結(jié)合，以不可逆的自殺性機(jī)制失活，從而阻斷蛋白酶水解級(jí)聯(lián)過(guò)程，抑制免疫應(yīng)答反應(yīng)(Huntington,2011)。鑒于其重要的免疫調(diào)控功能，昆蟲(chóng)serpin一直備受?chē)?guó)內(nèi)外研究者關(guān)注(Ooietal.,2015;魏川川等,2017;朱笑婷等,2017;Shakeeletal.,2019)。

在昆蟲(chóng)中，serpin最初從家蠶Bombyxmori血淋巴中分離獲得，之后又在煙草天蛾Manducasexta體內(nèi)被檢測(cè)到，主要通過(guò)抑制絲氨酸蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而負(fù)調(diào)控Toll信號(hào)通路和酚氧化酶原激活通路，以防止過(guò)量的抗菌肽表達(dá)和過(guò)度的黑化反應(yīng)對(duì)昆蟲(chóng)自身造成的傷害(Zhaoetal.,2012;Li Betal.,2017;Li Metal.,2018)。目前相關(guān)研究主要集中在一些隸屬雙翅目和鱗翅目的模式昆蟲(chóng)中。如黑腹果蠅Drosophilamelanogaster全基因組含有29個(gè)serpin基因，功能研究顯示其中Spn43Ac通過(guò)參與Toll信號(hào)通路而調(diào)節(jié)宿主的先天性免疫反應(yīng)，Spn27A能有效抑制酚氧化酶原級(jí)聯(lián)反應(yīng)而調(diào)控宿主應(yīng)對(duì)外來(lái)入侵物的防御響應(yīng)(Levashinaetal.,1999;Ligoxygakisetal.,2002)。在煙草天蛾中，serpin1J和serpin5分別通過(guò)抑制宿主血淋巴蛋白酶HP8和HP6而對(duì)Toll信號(hào)通路進(jìn)行負(fù)調(diào)控，與果蠅Spn27A同源的serpin3則可通過(guò)抑制酚氧化酶原的激活而阻斷黑化反應(yīng)的進(jìn)程(Zhuetal.,2003;Anetal.,2011)。然而，針對(duì)其他科目的昆蟲(chóng)，特別是一些重要農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)中serpin的免疫調(diào)控功能研究較少，相關(guān)研究有待加強(qiáng)。

褐飛虱Nilaparvatalugens隸屬半翅目(Hemiptera)飛虱科(Delphacidae)，是我國(guó)水稻上的主要害蟲(chóng)，不僅直接吸食水稻汁液，造成枯干倒伏(即“虱燒”)，而且還能傳播水稻病毒病，對(duì)水稻生產(chǎn)造成毀滅性損失(呂進(jìn)等,2013)。微生物防治是當(dāng)前褐飛虱綜合防控中的優(yōu)選策略(陳列忠等,2006;Jinetal.,2011)。然而，其防效在很大程度上受到宿主昆蟲(chóng)自身免疫防御系統(tǒng)的制約，極大限制了相關(guān)微生物農(nóng)藥的開(kāi)發(fā)及規(guī)?；瘧?yīng)用(Lu and St Leger,2016;Qu and Wang,2018)。因此，研究褐飛虱的免疫調(diào)控機(jī)制對(duì)于開(kāi)發(fā)褐飛虱生物防治技術(shù)工作具有重要理論和現(xiàn)實(shí)意義。本研究以褐飛虱為研究對(duì)象，對(duì)其免疫調(diào)控因子Nlserpin4基因進(jìn)行克隆鑒定和生物學(xué)信息分析，并利用qRT-PCR分析該基因的時(shí)空表達(dá)譜以及病原真菌誘導(dǎo)表達(dá)模式，以期為深入研究褐飛虱serpin的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)，也為利用serpin基因進(jìn)行褐飛虱蟲(chóng)害治理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx(chóng)和病原真菌

供試褐飛虱種群為本實(shí)驗(yàn)室保存建立，于人工氣候室內(nèi)(溫度24±1℃、相對(duì)濕度70%±5%、光周期16L∶8D)以TN1水稻苗飼養(yǎng)，維持種群。金龜子綠僵菌Metarhiziumanisopliae菌株Ma456于PDA(馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基)斜面上4℃保存，25℃培養(yǎng)傳代。

1.2 褐飛虱RNA提取及cDNA合成

取羽化24 h內(nèi)的褐飛虱成蟲(chóng)30頭，首先使用75%的酒精表面消毒蟲(chóng)體3次，每次3 min，再用無(wú)菌蒸餾水清洗5遍。蟲(chóng)體后晾干置于研缽中用液氮研磨均勻。采用Trizol法提取褐飛虱總RNA，并用微量紫外分光光度計(jì)(NanoDrop ND-2000,美國(guó))和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的質(zhì)量和濃度。以檢測(cè)合格后的RNA為模板，使用PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa，日本)試劑盒參照說(shuō)明書(shū)合成cDNA，并于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 Nlserpin4基因克隆及測(cè)序

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室測(cè)得的褐飛虱轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，結(jié)合GenBank中褐飛虱全基因組信息，篩選獲得一條注釋為褐飛虱絲氨酸蛋白酶抑制劑serpin的cDNA序列，命名為Nlserpin4。使用Primer Premier 5設(shè)計(jì)Nlserpin4擴(kuò)增引物cS4F(5′-ATGGTGGTCTTCAAA CAAATGGTTC-3′)和cS4R(5′-TCAATTTCCAGTATA TTTTCCACTG-3′)，以1.2節(jié)所得褐飛虱cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系:cDNA模板 2 μL,dNTPs (10 mmol/L) 4 μL,正反向引物(10 μmol/L)各1 μL，10×Buffer(含Mg2+) 5 μL,Taq酶0.5 μL,ddH2O補(bǔ)充至50 μL。擴(kuò)增程序:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,55℃復(fù)性30 s,72℃延伸1.5 min,35個(gè)循環(huán);72℃延伸7 min。PCR反應(yīng)完成后，用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物數(shù)量及分子量大小。目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)割膠回收后與pMD18-T載體(TaKaRa,日本)連接，并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中。將菌液(100 μL)涂布于含氨芐的(100 μg/mL)并涂有IPTG及X-gal的LB瓊脂板上，37℃倒置培養(yǎng)24 h后進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子送上海桑尼測(cè)序有限公司測(cè)序。

1.4 Nlserpin4基因及編碼蛋白質(zhì)序列分析

利用ORF Finder(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder)預(yù)測(cè)Nlserpin4基因的開(kāi)放閱讀框，并翻譯獲得氨基酸序列；運(yùn)用BLASTP(http:∥ blast..ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)比對(duì)NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)一步確認(rèn)目標(biāo)基因，并獲得同源序列；用SMART Server(http:∥smart.embl-heidelberg.de/)分析編碼蛋白序列中的保守結(jié)構(gòu)域；用NetNGlyc1.0 Server(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)進(jìn)行糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)；用ProtParam(http:∥web.expasy.org/protparam/)對(duì)編碼蛋白質(zhì)的分子量和等電點(diǎn)進(jìn)行分析；用SignalP-5.0 Server(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析信號(hào)肽序列；通用MEGA X軟件以鄰接(neighbor-joining,NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，經(jīng)1 000次重復(fù)抽樣檢測(cè)其置信度(Kumaretal.,2018)。

1.5 Nlserpin4基因時(shí)空表達(dá)特征分析

收集褐飛虱不同發(fā)育時(shí)期(卵、1-5齡若蟲(chóng)以及羽化24 h的雌雄成蟲(chóng))樣品，其中卵300粒，1-2齡若蟲(chóng)分別50頭，3-4齡若蟲(chóng)分別40頭，5齡若蟲(chóng)30頭，初羽化雌雄成蟲(chóng)分別為20頭。褐飛虱不同組織(血淋巴、脂肪體、腸道和剩余蟲(chóng)體)樣品取自5齡若蟲(chóng)。隨機(jī)選取100頭褐飛虱5齡若蟲(chóng)，首先用75%的酒精表面消毒蟲(chóng)體3次，每次3 min，再用無(wú)菌蒸餾水清洗5遍，晾干蟲(chóng)體。用解剖鑷在體視顯微鏡下解剖收集脂肪體、腸道和剩余蟲(chóng)體。通過(guò)切胸足法收集血淋巴，收集的血淋巴置于冰浴的放有少量苯硫脲晶體的離心管中，并加入等體積的PBS(pH 7.4)，4℃下13 000 r/min離心10 min，棄上清(張藝馨,2014)。各樣品RNA提取和cDNA合成步驟同1.2節(jié)。根據(jù)Nlserpin4基因cDNA序列，設(shè)計(jì)一對(duì)定量PCR引物qS4F(5′-CGTAGAACAA CCACAACTG-3′)和qS4R(5′-ATCTCTTGTCCTGCG TTAT-3′)。qRT-PCR分析采用SYBR? Premix Ex TaqTMII試劑盒，反應(yīng)體系(20 μL):2×SYBR? Premix Ex TaqTMII 10 μL,上下游引物(10 μmol/L)各1 μL,適量稀釋的cDNA 2 μL和ddH2O 6 μL。擴(kuò)增程序:95℃預(yù)變性30 s,進(jìn)入40個(gè)擴(kuò)增循環(huán)(95℃變性5 s,60℃退火34 s)；融解曲線(xiàn)：95℃ 15 s,60℃ 1 min,95℃ 15 s。以褐飛虱RPS11基因作為內(nèi)參，正向引物RPS11-F:5′-ATGGCCGACATTCT TCCAGGTCC-3′；反向引物RPS11-R:5′-CCGATCGT GTGGCGTTGAAGGG-3′。其反應(yīng)體系和程序同上。每個(gè)組織或齡期樣品設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù)。Nlserpin4基因在褐飛虱不同發(fā)育時(shí)期和不同組織中的相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCt法(Livak and Schmittgen,2001)計(jì)算,其中以不同發(fā)育時(shí)期和組織中的最低表達(dá)量為基數(shù)，數(shù)值設(shè)為1。

1.6 Nlserpin4基因的金龜子綠僵菌誘導(dǎo)表達(dá)模式分析

將病原真菌金龜子綠僵菌分生孢子以0.02% Tween-80水溶液制成1×107孢子/mL濃度的懸液，用顯微注射法接種5齡褐飛虱若蟲(chóng)，接種體積為10 nL，接種3批次，每批次注射100頭，以注射相同體積的0.02% Tween-80水溶液為對(duì)照。分別于0 h(未接種),接種后6,12,24和48 h后收集蟲(chóng)體，用75%的酒精表面消毒蟲(chóng)體3次，每次3 min，再用無(wú)菌蒸餾水清洗5遍，晾干蟲(chóng)體備用。樣品RNA提取和cDNA合成步驟同1.2節(jié)。qRT-PCR程序和基因相對(duì)表達(dá)量計(jì)算方法(2-ΔΔCt)同1.5節(jié)，以未注射組的表達(dá)量為基數(shù)，其值設(shè)為1。

1.7 數(shù)據(jù)分析

利用繪圖軟件 Graphpad Prism 7.0作圖。利用DPS軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析與處理，計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤(Tang and Zhang,2013)。利用單因素方差分析(one-way ANOVA)及Tukey氏HSD (Tukey’s honestly significant difference)法對(duì)Nlserpin4基因在褐飛虱不同發(fā)育時(shí)期、不同組織以及病原真菌不同誘導(dǎo)時(shí)間下的表達(dá)量進(jìn)行比較分析，差異顯著性水平為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 Nlserpin4基因的克隆鑒定及序列特征

以褐飛虱cDNA 為模板擴(kuò)增得到的產(chǎn)物經(jīng)過(guò)測(cè)序和序列分析，結(jié)果顯示：褐飛虱Nlserpin4基因cDNA序列(GenBank登錄號(hào):MN822802)全長(zhǎng)1 227 bp，編碼408個(gè)氨基酸，分子量大小為45.91 kD，等電點(diǎn)6.23。SMART預(yù)測(cè)顯示Nlserpin4氨基酸序列在第39-408位氨基酸殘基之間含有一個(gè)serpin家族特有的保守性結(jié)構(gòu)域。NetNGlyc1.0預(yù)測(cè)表明Nlserpin4蛋白無(wú)糖基化位點(diǎn)。信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果顯示Nlserpin4包含一個(gè)長(zhǎng)度為23個(gè)氨基酸信號(hào)肽序列(圖1)。多序列比對(duì)顯示，與其他昆蟲(chóng)serpin相似，Nlserpin4在C末端具有RCL區(qū)，其中第367位苯丙氨酸(Phe)和第368位丙氨酸(Ala)之間為預(yù)測(cè)的被靶蛋白酶特異性識(shí)別的活性裂解位點(diǎn)(圖2)。

圖1 褐飛虱Nlserpin4基因cDNA序列及其編碼氨基酸序列Fig.1 cDNA sequence and the coded amino acid sequence of Nlserpin4 of Nilaparvata lugens下劃線(xiàn)部分為信號(hào)肽序列;RCL區(qū)以陰影顯示，其中活性裂解位點(diǎn)以黑框表示;星號(hào)為終止密碼子。Signal peptide sequence is underlined.The RCL region is shaded and the active cleavage site is marked with box.Asterisk indicates the termination codon.

圖2 褐飛虱Nlserpin4與其他昆蟲(chóng)同源蛋白質(zhì)序列RCL區(qū)多序列比對(duì)Fig.2 Multiple sequence alignment of the RCL region of Nlserpin4 from Nilaparvata lugens with those of homologous serpins from other insect speciesSeripn蛋白來(lái)源物種Origin species of serpins:Apserpin4:豌豆蚜Acyrthosiphon pisum;Sfserpin4:蔗黃偽毛蚜Sipha flava;Nlserpin4:褐飛虱Nilaparvata lugens;Clserpin4:溫帶臭蟲(chóng)Cimex lectularius;Lhserpin4:阿根廷蟻Linepithema humile;Oaserpin4:寄生樹(shù)黃蜂Orussus abietinus;Btserpin4:煙粉虱Bemisia tabaci;Bmserpin4:家蠶Bombyx mori.RCL區(qū)預(yù)測(cè)活性裂解位點(diǎn)以陰影顯示;星號(hào)和冒號(hào)分別代表完全保守的和大部分相似的的氨基酸。The predicted active cleavage site in the RCL region is shaded.Asterisk and colon indicate completely conserved and partially similar amino acids,respectively.

2.2 Nlserpin4蛋白的序列比對(duì)及進(jìn)化樹(shù)

利用Blast同源性搜索比對(duì)，發(fā)現(xiàn)Nlserpin4蛋白與褐飛虱全基因組中預(yù)測(cè)的serpin-4 (GenBank登錄號(hào):AGK40928)氨基酸序列完全一致。Nlserpin4氨基酸序列與蔗黃偽毛蚜Siphaflavaserpin4(GenBank登錄號(hào):XP_025406327)的一致性最高，為40.26%。其次為與溫帶臭蟲(chóng)Cimexlectulariusserpin4(GenBank登錄號(hào):XP_014251604)，兩者氨基酸序列一致性為39.95%。采用MEGA6.0軟件以鄰接法將Nlserpin4與其他17種昆蟲(chóng)的serpin構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果顯示：包括褐飛虱Nlserpin4在內(nèi)所有半翅目昆蟲(chóng)serpin聚為一支，并與膜翅目昆蟲(chóng)serpin互為姐妹群，與鱗翅目昆蟲(chóng)家蠶Bombyxmoriserpin4親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖3)。

圖3 基于氨基酸序列采用鄰接法構(gòu)建的褐飛虱和其他昆蟲(chóng)serpin蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(1 000次重復(fù))Fig.3 Phylogenetic tree of serpin proteins from Nilaparvata lugens and other insects based on amino acid sequences by neighbor-joining method (1 000 replicates)

2.3 Nlserpin4基因時(shí)空表達(dá)特征

褐飛虱Nlserpin4基因在宿主不同發(fā)育時(shí)期和若蟲(chóng)不同組織部位中的表達(dá)量如圖4所示。結(jié)果表明，Nlserpin4基因在褐飛虱的卵期、若蟲(chóng)期和雌雄成蟲(chóng)中均有表達(dá)，且在成蟲(chóng)期表達(dá)量顯著高于卵期和若蟲(chóng)期(P<0.05)。雄成蟲(chóng)中Nlserpin4表達(dá)量最高，分別是雌成蟲(chóng)、卵和若蟲(chóng)期表達(dá)量(1-5齡若蟲(chóng)期表達(dá)量的平均值)的1.5,5.0和6.8倍。Nlserpin4表達(dá)量在1-3齡若蟲(chóng)中無(wú)顯著性差異(P>0.05)，此后隨齡期增加而顯著上升，如4齡和5齡若蟲(chóng)中Nlserpin4表達(dá)量較低齡若蟲(chóng)期表達(dá)量(1-3齡若蟲(chóng)期表達(dá)量的平均值)分別增加了2.1和3.2倍(圖4:A)。Nlserpin4基因在5齡若蟲(chóng)脂肪體、血淋巴、腸道和剩余蟲(chóng)體中均有表達(dá)，且在剩余蟲(chóng)體組織中表達(dá)量最高。此外，在血淋巴中Nlserpin4表達(dá)量顯著高于腸道和脂肪體(P<0.05),分別是腸道和脂肪體中表達(dá)量的2.5和2.9倍(圖4:B)，但Nlserpin4表達(dá)量在5齡若蟲(chóng)腸道和脂肪體中差異不顯著(P>0.05)。

圖4 Nlserpin4在褐飛虱不同發(fā)育時(shí)期(A)和5齡若蟲(chóng)不同組織(B)中的表達(dá)模式Fig.4 Expression profiles of Nlserpin4 during different developmental stages (A) and different tissues of the 5th instar nymphs (B) of Nilaparvata lugensE:卵Egg;N1- N5:分別為 1-5齡若蟲(chóng)1st-5th instar nymph,respectively;FA:雌成蟲(chóng)Female adult;MA:雄成蟲(chóng)Male adult;F:脂肪體Fat body;G:腸道Gut;H:血淋巴Hemolymph;C:剩余蟲(chóng)體Carcass.圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，柱上不同字母表示不同發(fā)育階段或不同組織間基因表達(dá)量差異顯著(P<0.05,one-way ANOVA檢驗(yàn))。Data in the figure are mean±SE,and different letters above bars indicate significant difference in the gene expression level among different developmental stages or tissues (P<0.05,one-way ANOVA test).

2.4 金龜子綠僵菌侵染后Nlserpin4的表達(dá)模式

用金龜子綠僵菌分生孢子懸液(1×107孢子/mL)顯微注射接種褐飛虱5齡若蟲(chóng)，檢測(cè)誘導(dǎo)不同時(shí)間后褐飛虱Nlserpin4的表達(dá)量，結(jié)果如圖5所示。與對(duì)照組(注射0.02% Tween-80水溶液)相比，病原真菌誘導(dǎo)(處理組)48 h內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)Nlserpin4表達(dá)量均呈顯著下調(diào)(P<0.05)；在金龜子綠僵菌刺激6 h后，Nlserpin4表達(dá)量最低，僅為對(duì)照的50%水平(P<0.05)；隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加，Nlserpin4表達(dá)量呈回升趨勢(shì)，如誘導(dǎo)24 h和48 h后其表達(dá)量顯著上升，分別是誘導(dǎo)6 h時(shí)的1.4和1.6倍，但與對(duì)照組相比依然是下調(diào)，且差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)(圖5)。

圖5 金龜子綠僵菌(1×107孢子/mL孢子懸液)侵染褐飛虱5齡若蟲(chóng)后Nlserpin4的誘導(dǎo)表達(dá)模式Fig.5 Expression pattern of Nlserpin4 in the 5th instar nymphs of Nilaparvata lugens after infection with Metarhizium anisopliae (1×107 conidia/mL spore suspension)CK:對(duì)照組(注射0.02% Tween-80) Control group (injected with 0.02% Tween-80);Treatment:處理組Treatment group.圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，柱上不同字母表示不同時(shí)間點(diǎn)間基因表達(dá)量差異顯著(P<0.05,one-way ANOVA檢驗(yàn))。Data in the figure are mean±SE and different letters above bars indicate significant difference in the gene expression level among different time post injection (P<0.05,one-way ANOVA test).

3 討論

Serpin是一類(lèi)廣泛分布于動(dòng)物、植物和微生物中的蛋白酶活性調(diào)節(jié)劑，參與調(diào)節(jié)生物體內(nèi)一系列重要的生理和病理過(guò)程(Lucasetal.,2018;Cohenetal.,2019)。近年來(lái)，serpin家族成員及其生物學(xué)功能已經(jīng)在許多昆蟲(chóng)中被分離和鑒定，但相關(guān)研究主要集中于一些模式昆蟲(chóng)，如果蠅、蚊和家蠶(Gulleyetal.,2013;Gaoetal.,2018;Katsukawaetal.,2018)，而對(duì)于飛虱科重要農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)的相關(guān)研究則相對(duì)貧乏。本研究成功從水稻重要害蟲(chóng)褐飛虱中克隆了Nlserpin4基因的全長(zhǎng)cDNA序列，利用生物信息學(xué)手段分析了其序列特征，并通過(guò)qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)了其時(shí)空表達(dá)譜和病原真菌誘導(dǎo)表達(dá)模式。

氨基酸序列分析顯示，Nlserpin4與已鑒定的其他物種serpin一樣，具有保守的serpin結(jié)構(gòu)域(第39-408位氨基酸殘基)(圖1)，表明Nlserpin4屬于serpin 超家族成員。目前研究發(fā)現(xiàn)，很多昆蟲(chóng)serpin在N端具有信號(hào)肽序列，如在25個(gè)小菜蛾P(guān)lutellaxylostellaserpin中，11個(gè)具有信號(hào)肽序列(Linetal.,2017)。SignalP預(yù)測(cè)顯示Nlserpin4在蛋白質(zhì)N端(第1-23位氨基酸殘基)亦存在信號(hào)肽，表明其可能是分泌型蛋白。此外，與柞蠶Antheraeapernyiserpin6和亞洲玉米螟Ostriniafurnacalisserpin2具有糖基化位點(diǎn)(曾軍等,2017;趙雅,2018)不同，NetNGlyc1.0預(yù)測(cè)Nlserpin4氨基酸序列中不存在糖基化位點(diǎn)，表明其可能是非糖基化蛋白。多序列比對(duì)顯示，Nlserpin4具有serpin蛋白家族典型的RCL區(qū)，且含有能被靶標(biāo)蛋白酶識(shí)別的活性裂解位點(diǎn)(圖2)。RCL區(qū)作為捕獲靶蛋白酶的“誘餌”，決定了serpin 抑制活性的專(zhuān)一性(Huntington,2011)。一般認(rèn)為，serpin通過(guò)其RCL區(qū)與靶蛋白酶以酯鍵共價(jià)結(jié)合后被靶蛋白酶裂解，進(jìn)而引起自身構(gòu)象發(fā)生轉(zhuǎn)變。Serpin構(gòu)象改變繼而導(dǎo)致靶標(biāo)蛋白酶的構(gòu)象變化，從而發(fā)揮蛋白酶活性抑制功能(Gettins,2002)。由系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果可知，Nlserpin4與同屬半翅目昆蟲(chóng)的serpin4聚為一支，其中與蔗黃偽毛蚜和溫帶臭蟲(chóng)serpin4的親源關(guān)系最近，而與鱗翅目昆蟲(chóng)家蠶serpin4親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖3)，該結(jié)果與Blastp比對(duì)結(jié)果一致，表明serpin4在半翅目昆蟲(chóng)中具有相對(duì)保守的進(jìn)化特性，其聚類(lèi)關(guān)系在一定程度上反映其親緣關(guān)系。

Nlserpin4在褐飛虱各發(fā)育階段均有表達(dá)，成蟲(chóng)期表達(dá)量顯著高于其他齡期，1-3齡若蟲(chóng)期表達(dá)量顯著低于卵期和高齡若蟲(chóng)期(圖4:A)，表明Nlserpin4在褐飛虱具有齡期表達(dá)特異性。Serpin的齡期特異性表達(dá)模式同樣見(jiàn)于其他昆蟲(chóng)中，如煙粉虱serpin在卵期和成蟲(chóng)期表達(dá)量最高，其他齡期表達(dá)量則較低(馮佳穎,2016)。家蠅Muscadomesticaserpin基因SP2和SP16在2齡和3齡幼蟲(chóng)中呈普遍的高表達(dá)，而在卵期和成蟲(chóng)期表達(dá)量相對(duì)較低(魏川川等,2017)。Nlserpin4在褐飛虱各組織部位亦均有轉(zhuǎn)錄，但在不同組織部位的表達(dá)水平差異顯著。定量PCR結(jié)果顯示Nlserpin4在褐飛虱5齡若蟲(chóng)血淋巴中表達(dá)量最高，在腸道中次之，在脂肪體中的表達(dá)量較低(圖4:B)。類(lèi)似的表達(dá)模式同樣見(jiàn)于其他昆蟲(chóng)serpin的研究，如家蠶serpin6的表達(dá)量在不同組織部位從高到低排列為血淋巴>腸道>脂肪體(Lietal.,2017)。然而，此表達(dá)模式與煙草天蛾serpin4基因不同，煙草天蛾serpin4在脂肪體中的表達(dá)水平明顯高于其在血淋巴中的表達(dá)水平(Tong and Kanost,2005)?？梢?jiàn)，褐飛虱Nlserpin4的表達(dá)特征具有明顯時(shí)空特異性，這表明其在褐飛虱生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中可能發(fā)揮重要調(diào)控作用。

諸多研究表明，昆蟲(chóng)serpin主要通過(guò)抑制絲氨酸蛋白酶的活性來(lái)負(fù)調(diào)控酚氧化酶原激活系統(tǒng)和其他有關(guān)防御通路(如Toll通路)的蛋白酶水解級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而抑制病原微生物誘導(dǎo)下過(guò)度的免疫防御反應(yīng)對(duì)昆蟲(chóng)自身造成傷害(Yuanetal.,2017;Wangetal.,2019)。目前關(guān)于serpin在昆蟲(chóng)-病原微生物互作過(guò)程中的表達(dá)調(diào)控研究主要以“昆蟲(chóng)-病原細(xì)菌”為研究模型。如煙草天蛾受大腸桿菌Escherichiacoli刺激后，幼蟲(chóng)血淋巴中serpin4的表達(dá)量顯著上升，其表達(dá)產(chǎn)物可抑制絲氨酸蛋白酶的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而阻斷黑色素的合成(Tong and Kanost,2005)。昆蟲(chóng)病原真菌以其體壁接觸侵染致死模式在防治刺吸式口器害蟲(chóng)方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)(Laceyetal.,2015)。解析刺吸式口器害蟲(chóng)與病原真菌之間免疫防御與免疫逃避的“攻防”關(guān)系對(duì)于開(kāi)發(fā)基于病原真菌的褐飛虱生物防治新技術(shù)具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。本研究檢測(cè)了Nlserpin4在褐飛虱注射接種病原真菌后的誘導(dǎo)表達(dá)模式(圖5)，結(jié)果顯示金龜子綠僵菌處理褐飛虱初期(6 h)Nlserpin4基因表達(dá)量顯著下調(diào)，表明褐飛虱免疫防御反應(yīng)可能被注射進(jìn)入宿主血淋巴的病原真菌顯著激活；隨接種時(shí)間的延長(zhǎng)Nlserpin4基因表達(dá)量呈現(xiàn)回升趨勢(shì)，這可能是為了緩解由病原真菌誘導(dǎo)的免疫防御反應(yīng)的持續(xù)激活。由此可見(jiàn)，Nlserpin4在褐飛虱免疫防御病原真菌過(guò)程中扮演重要調(diào)控分子的角色，但其是如何調(diào)控宿主信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑以及免疫應(yīng)答反應(yīng)的，暫不清楚，還有待于進(jìn)一步研究。