彭 威,李云欣,翁詩函,周若涵,潘 熙,李佳洋,韓寶瑜

(中國計量大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,浙江省生物計量及檢驗檢疫技術(shù)重點實驗室,杭州 310018)

雙翅目病媒昆蟲每年導(dǎo)致數(shù)百萬人和家畜感染寄生蟲和病毒，因而發(fā)展新型有效的防治技術(shù)顯得異常重要(Kassebaumetal.,2016)。昆蟲不育技術(shù)(sterile insect technique,SIT)是害蟲區(qū)域防治的主要技術(shù)之一。傳統(tǒng)的不育昆蟲技術(shù)概念最早由Knipling在20世紀40年代提出來，其主要策略是通過大量人工飼養(yǎng)靶標害蟲，經(jīng)過輻射處理后，連續(xù)釋放不育雄性個體，與野生靶標雌性害蟲個體交配，產(chǎn)生不育后代，將靶標害蟲種群數(shù)量控制在經(jīng)濟閾值之下，甚至徹底根除靶標害蟲(Knipling,1955)。但傳統(tǒng)的SIT由于使用輻照技術(shù)造成雄蟲在野外生存力和交配競爭力降低，而且缺乏有效的雌雄區(qū)分手段，因此在實踐中有諸多限制。SIT是一種更環(huán)保的廣譜化學(xué)殺蟲劑替代品，已成功應(yīng)用于多種害蟲的防治，但在釋放之前必須先將雌性移除，這導(dǎo)致其防治速度放慢。除了盡量減少釋放雌性所帶來的健康和經(jīng)濟風(fēng)險之外，模型和實驗結(jié)果還表明僅釋放雄性比同時釋放雄性和雌性更具成本效益(Knipling,1955;Rendonetal.,2004)。節(jié)約的成本可能是由于昆蟲大規(guī)模飼養(yǎng)的成本降低和田間釋放的雄性不會被同時釋放的雌性所吸引。

其他遺傳防治措施包括釋放攜帶顯性致死的昆蟲不育技術(shù)(release of insects carrying a dominant lethal,RIDL)和基于沃爾巴克氏體Wolbachia的昆蟲不相容技術(shù)(incompatible insect technique,IIT)。RIDL通過釋放攜帶可抑制的顯性致死轉(zhuǎn)基因雄蟲與野生雌蟲交配，導(dǎo)致后代在特定發(fā)育階段或特定性別中條件致死(Thomas,2000)。由于需要釋放大量轉(zhuǎn)基因個體使得其應(yīng)用成本相當昂貴，且四環(huán)素抑制系統(tǒng)會降低RIDL雄蟲的適應(yīng)性(Alpheyetal.,2010)。IIT通過釋放攜帶與野生雌蚊不同沃爾巴克菌型的雄蚊，從而誘發(fā)胞質(zhì)不相容，使雌蚊不育(Sinkins,2004;Panagiotis and Bourtzis,2007)。IIT雖然不會降低雄蚊的競爭交配力和生存力，但是在田間條件下嚴格要求沒有感染的雌性被釋放是極其困難的。模型實驗顯示，釋放只有一小部分感染W(wǎng)olbachia的雌性會導(dǎo)致種群替代而不是種群滅絕。雌性蚊子能傳播病原菌，任何遺傳控制策略中都不能容忍雌性污染。在這些遺傳防治措施的應(yīng)用中，性別分離是指將雄性和雌性進行分離，更確切地說是移除雌性。性別分離一方面依賴于性二態(tài)差異的機械分離，另一方面可以利用更復(fù)雜的技術(shù)來調(diào)控基因表達，從而在發(fā)育過程中條件性地將雌蟲雄性化或殺死雌性。

昆蟲性別決定和發(fā)育已被多次闡述，主要關(guān)注特定種或?qū)偌靶詣e調(diào)控分子機制(Alphey,2014;Gillesetal.,2014;Bernardinietal.,2018)。在本文中，我們對雙翅目昆蟲最近開發(fā)的所有性別分離策略進行綜述，關(guān)注的對象不僅包括蚊子在內(nèi)的病媒昆蟲，還包括其他雙翅目農(nóng)業(yè)重要性害蟲，這些新的性別分離技術(shù)可以完善基于靶標性別決定的昆蟲不育防治技術(shù)。本文側(cè)重于性別分離方法的可操作性，對目前正在進行的性別分離技術(shù)進行了比較，探討了大規(guī)模飼養(yǎng)中每項技術(shù)創(chuàng)新的優(yōu)缺點。

1 雙翅目昆蟲大規(guī)模釋放中的性別分離現(xiàn)狀

目前大多數(shù)針對實蠅害蟲的遺傳防治策略沒有進行性別分離。例如，澳大利亞和泰國果實蠅屬Bactrocera大規(guī)模飼養(yǎng)設(shè)施每周能生產(chǎn)數(shù)以千萬計的沒有移除雌性的果實蠅(Orankanoketal.,2007;Fansonetal.,2014)。通過每周釋放1 500萬頭不育對旋麗蠅Cochliomyiahominivorax對巴拿馬-哥倫比亞邊境的對旋麗蠅進行防治，其中沒有大規(guī)模的性別分離策略(Scottetal.,2017)。而隨著不育對旋麗蠅生產(chǎn)規(guī)模的增加，一種基于四環(huán)素抑制系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因品系導(dǎo)致雌蟲在蛹期雌性特異性致死，從而實現(xiàn)蛹期性別分離用于對旋麗蠅的防治，預(yù)計每年可節(jié)省超過100萬美元(Conchaetal.,2016)。到目前為止，只有地中海實蠅Ceratitiscapitata和墨西哥實蠅Anastrephaludens兩種農(nóng)業(yè)重要性實蠅在大規(guī)模飼養(yǎng)中采用性別分離策略，極大提高了釋放效率(Augustinosetal.,2017)。

在必須進行性別分離的情況下，耗時的方法通常是唯一可行的選擇。蚊亞科包括伊蚊屬Aedes和庫蚊屬Culex，性二態(tài)表現(xiàn)為蛹大小不一致，已經(jīng)對伊蚊采用基于蛹的大小進行機械性別分離(Papathanosetal.,2018)。在意大利SIT防治中，利用金屬篩對200萬頭白紋伊蚊Aedesalbopictus雄蟲進行了性別分離，該方法僅回收了26%～29%的雄蟲，雌蟲污染仍約為1.2%(Bellinietal.,2013)。基于雌雄蛹大小的Fay-Morlan玻璃分選機，對中國兩個島上的白紋伊蚊進行了昆蟲不相容技術(shù)和不育技術(shù)相結(jié)合的實驗，釋放了超過1.97億頭雄蚊。雄蚊恢復(fù)較多，雌蚊污染率約為0.3%(Zhengetal.,2019)。利用基于性二態(tài)的方法對留尼旺島的白紋伊蚊和法屬波利尼西亞的埃及伊蚊Aedesaegypti和波利尼西亞伊蚊Aedespolynesiensis進行防治，從而控制登革熱的發(fā)生。目前按蚊性別分離方法是基于蚊蛹人工識別，每小時只能對500頭蚊蛹進行性別分離(Papathanosetal.,2018)。這導(dǎo)致工期非常長，很難獲得害蟲不育防治中所需的蚊蟲數(shù)量。采采蠅Glossinamorsitansmorsitans雌雄蟲均以血液為食，可作為錐蟲的載體。釋放少量錐蟲殺滅劑處理的采采蠅雄蟲可以通過成蟲人工分離，而大量釋放可以利用雌蛹羽化早于雄蛹進行分離(Bouyeretal.,2014;Secketal.,2015)?；诖朴加鸹缬谛塾嫉男詣e分離方法生產(chǎn)了500萬頭須舌蠅Glossinapalpalisgambiensis雄蟲，用于消除塞內(nèi)加爾的須舌蠅(Secketal.,2015)。

在蛹期或成蟲期進行性別分離需要對雌雄幼蟲進行飼喂，在不育防治釋放中只需要雄蟲，因而雌蟲被丟棄只僅保留雄蟲。此外，增加幼蟲密度會降低其適應(yīng)性并減緩雌雄幼蟲發(fā)育(Agnewetal.,2002)。因此，在昆蟲發(fā)育早期移除雌蟲有利于避免雌雄之間的競爭(Phucetal.,2007)。在飼養(yǎng)數(shù)百萬頭害蟲時，早期的性別分離可以節(jié)省大量的時間、勞動力和金錢。在大規(guī)模飼養(yǎng)蚊蟲中，早期的性別分離可以降低雌蚊飼咬工人的風(fēng)險。釋放性別分離后的不育雄性個體，通過與野外靶標雌性害蟲個體交配，產(chǎn)生不育后代，能夠降低靶標害蟲種群密度，甚至徹底根除靶標害蟲。

2 雙翅目昆蟲性別決定及分化機制

雙翅目昆蟲具有多種機制決定性別和分化(圖1)。模式物種黑腹果蠅Drosophilamelanogaster是XX/XY染色體性別決定系統(tǒng)，雌性個體雙倍劑量的X染色體連接信號元件(X chromosome-linked signal elements,XSE)作為初始性別決定因子啟動Sexlethal(Sxl)基因的表達，SXL蛋白指導(dǎo)transformer(tra)和doublesex(dsx)基因mRNA前體進行雌性特異剪切(traf,dsxf)，雌性特異DSX蛋白指導(dǎo)雌性分化。XY個體單倍劑量的XSE不足以啟動Sxl基因的表達，導(dǎo)致tra和dsx基因mRNA前體進行雄性特異剪切(tram,dsxm)，產(chǎn)生雄性特異DSX蛋白指導(dǎo)雄性分化(Erickson and Quintero,2008;Lucchesi and Kuroda,2015;Vicoso and Bachtrog,2015)。在家蠅Muscadomestica中，性別決定系由雄性決定因子maledeterminer(Mdmd)的存在與否來決定。在XY雄性胚胎中，父本繼承的Mdmd阻止合子中母本tra正向反饋調(diào)控表達，導(dǎo)致tra和dsx基因進行雄性特異剪切，進而實現(xiàn)雄性決定和雄性性別分化。在XX雌性胚胎中，缺少Mdmd基因，來源于母本的tra基因產(chǎn)物在雌性中建立一個自動調(diào)控通路，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生有功能的TRA蛋白，TRA蛋白指導(dǎo)dsx進行雌性特異剪切，完成雌性性別決定和分化(Sharmaetal.,2017)。地中海實蠅性別決定基本信號是位于Y染色體的雄性決定因子Maleness-onthe-Y(MoY) (Meccarielloetal.,2019)。Y染色體連接的MoY阻止合子中tra基因活化，導(dǎo)致tra基因進行雄性特異剪切，引起雄性發(fā)育。XX胚胎由于缺乏MoY基因，tra雌性特異自動調(diào)節(jié)回路被激活產(chǎn)生功能蛋白，推動雌性性別發(fā)育(Paneetal.,2002;Gabrielietal.,2010)。蚊子性別是由位于Y染色體上的雄性決定因子調(diào)控的，埃及伊蚊、岡比亞按蚊Anophelesgambiae和斯氏按蚊Anophelesstephensi雄性決定基因Nix,Yob和Guy1調(diào)控dsx基因進行雄性別特異性剪切和表達，實現(xiàn)雄性性別發(fā)育。雌性缺少Nix,Yob和Guy1基因，導(dǎo)致dsx基因進行雌性特異性剪切和表達，從而實現(xiàn)雌性性別發(fā)育(Halletal.,2015;Criscioneetal.,2016;Krzywinskaetal.,2016)。

圖1 雙翅目昆蟲性別決定途徑(Erickson and Quintero,2008;Hall et al.,2015;Criscione et al.,2016; Krzywinska et al.,2016;Sharma et al.,2017;Meccariello et al.,2019)Fig.1 Sex determination pathways in dipteran insects (Erickson and Quintero,2008;Hall et al.,2015;Criscione et al.,2016; Krzywinska et al.,2016;Sharma et al.,2017;Meccariello et al.,2019)dsxf：doublesex轉(zhuǎn)錄本的雌性特異性亞型 Female-specific isoform of the doublesex transcript;dsxm:doublesex轉(zhuǎn)錄本的雄性特異性亞型Male-specific isoform of the doublesex transcript;traf:transformer轉(zhuǎn)錄本的雌性特異性亞型Female-specific isoform of the transformer transcript;tram:transformer轉(zhuǎn)錄本的雄性特異性亞型Male-specific isoform of the transformer transcript.

3 雙翅目昆蟲性比失衡性別分離策略

鑒定昆蟲雌性性別發(fā)育關(guān)鍵的基因，從而破壞其性別決定途徑的防治策略已在多種害蟲中得以應(yīng)用，利用RNA干擾(RNA interference,RNAi)、clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9 (CRISPR/Cas9)敲除和轉(zhuǎn)基因技術(shù)，在昆蟲胚胎發(fā)育早期對性別決定關(guān)鍵基因進行調(diào)控可以產(chǎn)生雄性偏向的種群(表1)。性別完全分離成本效益較低的方法是生產(chǎn)包括雄蟲和部分雌蟲雄性化組成的種群，通過以上方法生產(chǎn)的雄性化雌蟲通常是不育。在飼養(yǎng)設(shè)施中，這些雌蟲仍將與雄蟲競爭食物和空間，在田間釋放該種群防治害蟲時效率更高。地中海實蠅轉(zhuǎn)基因品系在熱激啟動子調(diào)控下表達雙鏈RNA靶向性別決定關(guān)鍵基因tra，產(chǎn)生95%雄性和5%雙性后代，大多數(shù)基因型雌性(XX)發(fā)育為雄性表型，并且是可育的(Sacconeetal.,2007)。橘小實蠅Bactroceradorsalis胚胎期干擾性別決定關(guān)鍵基因tra和tra-2的表達，導(dǎo)致后代出現(xiàn)96%的雄性和4%的不能交配的不育雙性個體(Liuetal.,2015)。通過將埃及伊蚊幼蟲浸泡在dsRNA混合物中或者飼喂表達dsRNA的細菌，干擾tra-2基因表達，導(dǎo)致后代存活率約為50%以及高達97.6%的雄性性別偏向(Hoangetal.,2016)。干擾埃及伊蚊dsx基因雌性亞型后，97%的后代為雄性表型，3%為不育雌性且喪失吸血沖動(Whyardetal.,2015)。在岡比亞按蚊生殖細胞系中過表達Yob基因獲得雄性偏向性轉(zhuǎn)基因品系，該品系后代75%為雄性，25%為雄性化的不育雌性，表現(xiàn)出生存能力降低和不同程度兩性性表型缺陷，表明通過轉(zhuǎn)基因優(yōu)化構(gòu)建能使基因型雌性完全轉(zhuǎn)化為功能性雄性(Krzywinska and Krzywinski,2018)。利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除加勒比按實蠅Anastrephasuspensatra-2的表達，導(dǎo)致后代42%為雄性、47%為雙性個體、11%為雌性，而只有13%個體存活至成蟲期，這為在加勒比按實蠅中開發(fā)轉(zhuǎn)基因條件性別系統(tǒng)提供了可能(Li and Handler,2019)。Yob基因是岡比亞按蚊雄性性別決定因子，調(diào)控dsx基因雄性特異性剪切。胚胎期注射YobmRNA導(dǎo)致后代全部發(fā)育為雄性表型(Krzywinskaetal.,2016)。在埃及伊蚊中通過調(diào)控雄性決定因子Nix基因的表達，實現(xiàn)了基因型雌性向雄性表型的轉(zhuǎn)化(Aryanetal.,2019)，表明利用昆蟲雄性決定因子的條件性表達來構(gòu)建雄性性別品系將是未來的發(fā)展方向。最近，Kandul等(2019)在黑腹果蠅中開發(fā)出一種生產(chǎn)100%不育雄性化的系統(tǒng)，該系統(tǒng)將表達Cas9蛋白品系與同時表達β-微管蛋白基因(β-tub)和CRISPR靶標基因sxl品系雜交，可以實現(xiàn)F1代性別分離，獲得的雄蟲不育且具有和野生型相同的交配競爭力。

4 雙翅目雌性條件性致死分離策略

雌性條件性致死通常用于獲得性別品系，而其中一部分致死系統(tǒng)是基于四環(huán)素抑制系統(tǒng)雌性特異性表達(表1)。四環(huán)素抑制系統(tǒng)的核心是四環(huán)素反式激活因子(tetracycline-repressible transactivator,tTA)，tTA是含有能序列特異識別四環(huán)素來抑制DNA結(jié)合特性的一類融合蛋白。當受到上游啟動子的調(diào)控，tTA會結(jié)合到下游特異受體序列，啟動效應(yīng)致死基因的表達。在四環(huán)素存在條件下，tTA不能結(jié)合受體，因而不會實現(xiàn)下游效應(yīng)致死基因的表達。一方面tTA調(diào)控致死基因的表達，另一方面tTA自身能夠觸發(fā)致死。基于四環(huán)素抑制系統(tǒng)構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因性別品系在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基中飼養(yǎng)時，昆蟲表現(xiàn)出正常的孵化率和雌雄性比。缺少四環(huán)素導(dǎo)致雌性致死，昆蟲只有50%的孵化率且僅后代都為雄性(Schetelig and Handler,2012;Ogaugwuetal.,2013;Yanetal.,2017)。加勒比按實蠅開發(fā)了基于四環(huán)素抑制的胚胎性別系統(tǒng)，利用胚胎特異啟動子啟動促凋亡細胞致死基因雌性特異表達，導(dǎo)致胚胎發(fā)育過程中雌性死亡，轉(zhuǎn)基因后代80%～100%為雄性。在大規(guī)模實驗中，利用四環(huán)素系統(tǒng)成功孵化30 000頭轉(zhuǎn)基因胚胎，獲得100%的雄性后代，表明其可以應(yīng)用于加勒比按實蠅大規(guī)模飼養(yǎng)(Schetelig and Handler,2012)。利用tra基因性別特異性剪接調(diào)控致死基因的表達，成功構(gòu)建地中海實蠅雌性致死品系(Fuetal.,2007)。在橄欖果實蠅Bactroceraoleae建立的顯性致死釋放系統(tǒng)(RIDL)品系通過攜帶性別特異性熒光，導(dǎo)致雄蟲不育且雌性條件性致死。通過每周釋放該轉(zhuǎn)基因品系雄蟲，能夠在室內(nèi)試驗中有效消除橄欖果實蠅野生種群(Antetal.,2012)。利用tra基因雌性特異性剪切和促凋亡細胞致死基因相結(jié)合的方法，成功構(gòu)建銅綠蠅Luciliacuprina和對旋麗蠅四環(huán)素抑制的雌性特異性致死系統(tǒng)(Yan and Scott,2015;Conchaetal.,2016)。其中一種對旋麗蠅目前正在接受大規(guī)模飼養(yǎng)項目的評估(Scottetal.,2017)。

表1 雙翅目昆蟲性別分離方法及其機制Table 1 Sex separation methods for dipteran insects and their mechanisms

續(xù)表1 Table 1 continued

actin-4基因雌性特異性表達系統(tǒng)已在多種蚊子中用于條件性表達致死效應(yīng)因子。由于actin-4在雌性飛行相關(guān)肌肉中特異表達，條件性表達系統(tǒng)所獲得的表型是不具備飛行能力的雌性，并不會導(dǎo)致雌性致死。埃及伊蚊、白紋伊蚊和斯氏按蚊中已開發(fā)出這樣一個系統(tǒng)，在缺少四環(huán)素的情況下導(dǎo)致無飛行能力的表型(Fuetal.,2010;Labbéetal.,2012;Marinottietal.,2013)。盡管該系統(tǒng)在實驗室研究中是有效的，但是四環(huán)素會影響斯氏按蚊腸道微生物群落并損害其適應(yīng)性，導(dǎo)致在野外無意釋放的雌性斯氏按蚊更容易感染惡性瘧原蟲(Sharmaetal.,2013)。將狄氏劑抗性等位基因易位至阿拉伯按蚊AnophelesarabiensisY染色體，導(dǎo)致雄蚊抗狄氏劑，而雌蚊對狄氏劑敏感，從而實現(xiàn)雌雄蚊分離(Yamadaetal.,2012,2013a)。Lebon等(2018)在白紋伊蚊中開發(fā)出類似的狄氏劑抗性品系，其性別分離效率達到98%。鑒于只有雌蚊吸食血液，在血餐中添加有毒物質(zhì)也能實現(xiàn)阿拉伯按蚊性別分離，其雌蚊在取食含伊維菌素的血餐4 d后死亡，而雄蚊取食后沒有損傷(Yamadaetal.,2013b)。由于伊維菌素隨糞便排出，導(dǎo)致所有飼養(yǎng)設(shè)備的污染，這是該系統(tǒng)用于大規(guī)模飼養(yǎng)應(yīng)用中的主要缺陷。

5 雙翅目昆蟲可視化性別分離策略

性別自動分離已在多種害蟲中得到應(yīng)用(表1)，如在橘小實蠅、楊桃實蠅Bactroceracarambolae、瓜實蠅Zeugodacuscucurbitae和墨西哥實蠅中通過對蛹顏色決定基因的突變構(gòu)建了遺傳性別品系(GSS) (McInnisetal.,2004;Isasawinetal.,2012,2014;Zepeda-Cisnerosetal.,2014)。通過該方法能達到100%性別分離，在田間試驗中，這些遺傳性別品系表現(xiàn)出良好的競爭力(McInnisetal.,2007;Isasawinetal.,2012;Orozco-Dávilaetal.,2015)。由于突變與染色體易位相關(guān)，品系中的個體是半不育的。在難以發(fā)現(xiàn)或調(diào)控顏色突變的情況下，利用性別特異性啟動子調(diào)控?zé)晒鈽擞浀鞍讈韺崿F(xiàn)性別分離是可行的。在斯氏按蚊、埃及伊蚊和阿拉伯按蚊中，利用與β2-微管蛋白基因啟動子連鎖的標記實現(xiàn)了蚊蟲晚期幼蟲和蛹階段的性別分離(Catterucciaetal.,2005;Smithetal.,2007;Nolanetal.,2011)。Condon等(2007)在地中海實蠅幼蟲晚期階段建立了兩個高熒光表達的轉(zhuǎn)基因性別品系，其蛹的性別自動篩選分離準確率為97.5%～100%。

利用岡比亞按蚊精子特異性β2-微管蛋白啟動子表達增強型綠色熒光蛋白(EGFP)，從而在4齡幼蟲階段將雄蚊分離(Catterucciaetal.,2005)。Magnusson等(2011)在岡比亞按蚊1齡幼蟲階段開發(fā)出另一種性別分離標記，該品系的雄蟲攜帶含有雌性特異性dsx基因內(nèi)含子的EGFP報告基因，由于dsx基因進行雄性特異剪切使得EGFP報告基因得以表達。而將綠色熒光蛋白(GFP)插入岡比亞按蚊Y染色體，雄蚊表達綠色熒光蛋白，而雌蚊表達紅色熒光蛋白(Bernardinietal.,2014)。攜帶X染色體標記的性別品系和攜帶Y染色體標記的性別品系通過雜交產(chǎn)生非轉(zhuǎn)基因的雄蚊種群，從而在避免釋放轉(zhuǎn)基因品系的前提下將雄蚊分離出來。此外，Bernardini等(2017)通過種間雜交將岡比亞按蚊Y染色體表達的熒光標記滲入阿拉伯按蚊。在銅綠蠅中開發(fā)了一種在雌性幼蟲中過表達熒光標記報告基因的轉(zhuǎn)基因品系，從而實現(xiàn)早期幼蟲性別分離(Lietal.,2014)。

基于成像技術(shù)的非轉(zhuǎn)基因性別分離策略也在開發(fā)中，并且在基因改造受限制的物種中得到應(yīng)用(表1)。利用基于雌雄性別二態(tài)性的近紅外(NIR)成像技術(shù)能對野生型白足舌蠅Glossinapallidipes(WT)蛹進行性別分離，且準確率為80%～100% (Dowelletal.,2005;Moran and Parker,2016)。結(jié)合性別二態(tài)性和成像技術(shù)對多種按蚊和伊蚊開發(fā)出雌雄蛹自動分揀器，其雌蚊污染率小于1%。對阿拉伯按蚊的分揀效率不高，但對伊蚊的分揀能實現(xiàn)65%～98%的雄蚊恢復(fù)，展示出其優(yōu)異的性能(Zacarésetal.,2018)。基于白紋伊蚊雌雄蚊化蛹時間的差異，Bellini等(2018)開發(fā)出一種新的非轉(zhuǎn)基因性別分離方法，他們經(jīng)過10代的雌雄蚊化蛹時間的差異篩選出雌蚊和雄蚊的品系，該品系28%的早期蛹中99%為雄蚊。該系統(tǒng)表明其他表型可以作為基于遺傳操作的性別分離策略的未來研究方向。

6 小結(jié)與展望

盡管昆蟲不育技術(shù)(SIT)在害蟲防治中已使用長達60年，但并未被公眾廣泛熟知，尤其是在攜帶致病菌的種群之中。對正在防治白紋伊蚊試驗的法國La Reunion島上居民進行的一項民意調(diào)查顯示，只有34%的居民了解昆蟲不育技術(shù)。當獲悉昆蟲不育技術(shù)的應(yīng)用原則時，61%的人支持釋放野生型輻照不育雄性。相較于利用雌雄性二態(tài)特征，釋放基因改造過的蚊蟲面臨更多反對意見。由于公眾缺少SIT相關(guān)專業(yè)知識所引起的擔憂，導(dǎo)致一些害蟲防治項目被迫取消(Panjwani and Wilson,2016)。Antonelli等(2015)發(fā)現(xiàn)，公眾輿論對轉(zhuǎn)基因蚊蟲不同術(shù)語的態(tài)度各不相同。即使是遺傳狀態(tài)相關(guān)性不高的不育昆蟲，釋放轉(zhuǎn)基因品系比釋放通過傳統(tǒng)方法突變獲得的品系更令人擔憂。當Oxitec公司在加勒比地區(qū)進行田間試驗釋放轉(zhuǎn)基因蚊蟲時，科學(xué)界本身也提出了擔憂(Phucetal.,2007;Antonellietal.,2015;Panjwani and Wilson,2016)。相似的情況是，一些政府反對在其領(lǐng)土上釋放轉(zhuǎn)基因昆蟲，因而科學(xué)家們在開發(fā)昆蟲不育新技術(shù)時不得不考慮以上種種擔憂。

雌性條件性致死系統(tǒng)雖然無需初始成本，但仍需化學(xué)藥劑如狄氏劑、四環(huán)素的日常處理成本以及處理污染的飼養(yǎng)用水。由于雌蚊能叮咬并傳播病原菌，因此規(guī)?；男詣e分離方案必須使雌性移除率達到99%以上。大多數(shù)早期和晚期性別分離方法都依賴于轉(zhuǎn)基因技術(shù)?；谵D(zhuǎn)基因技術(shù)的性別分離策略的飼養(yǎng)成本效率是可觀的，但由于公眾消極認知或監(jiān)管禁令導(dǎo)致其實際應(yīng)用受到限制。盡管伊蚊蛹分揀機和白足舌蠅近紅外成像的發(fā)展速度和成本受到抑制，但是這兩種技術(shù)仍不失為一種切實可行的方案(Moran and Parker,2016;Zacarésetal.,2018)。當必須規(guī)避轉(zhuǎn)基因方法時，基于蛹顏色相關(guān)等位基因如stripe或redeye突變的傳統(tǒng)遺傳性別品系(genetic sexing strains,GSS) (McInnisetal.,2004;Isasawinetal.,2012,2014)，對雌雄蛹的自動分離是行之有效的(Seawrightetal.,1982;Mukiama,1985)。最近，Ndo等(2018)在按蚊中分離出一種溫度致死性突變，也可用于構(gòu)建其遺傳性別品系。在允許使用轉(zhuǎn)基因技術(shù)的情況下，利用四環(huán)素反式激活因子(tTA)調(diào)控促凋亡基因的表達能夠?qū)е露喾N害蟲早期發(fā)育階段雌性特異性致死(Schetelig and Handler,2012;Ogaugwuetal.,2013;Yanetal.,2017)。發(fā)育晚期性別分離策略雌雄分離階段偏晚，但是結(jié)合釋放攜帶顯性致死的昆蟲不育技術(shù)(RIDL)可以實現(xiàn)釋放的雌性幼蟲在死亡前和野生幼蟲競爭食物和空間，從而提高害蟲防治效率。當釋放同等競爭力和同等數(shù)量的昆蟲時，RIDL系統(tǒng)比傳統(tǒng)昆蟲不育技術(shù)(SIT)更有效(Blacketal.,2011)。在本綜述中，我們沒有對X染色體斷裂系統(tǒng)導(dǎo)致的性比失衡(Galizietal.,2014,2016)進行討論，是由于這個品系產(chǎn)生的是非條件性雄性性別偏向種群。但是X染色體斷裂系統(tǒng)對于大規(guī)模室內(nèi)試驗中遺傳調(diào)控仍是十分有效的(Facchinellietal.,2019)。如果這種性比失衡品系可以實現(xiàn)規(guī)?；曫B(yǎng)，其釋放效率可比SIT高16～3 000倍，比RIDL高2～70倍(Schliekelmanetal.,2005)。

雙翅目雌雄性別分離在過去15年中受到了諸多關(guān)注，提出的包括性比失衡、雌性條件性致死和昆蟲可視化性別分離策略由于分離效率的差異，其防治效果高低不一。性別分離策略中分離技術(shù)、治理成本和品系特征等因素會影響公眾和政府對實施這些害蟲不育防治技術(shù)的可行性和可接受性。性別分離新策略不僅需要滿足分離效率要求，而且還需滿足社會和監(jiān)管機構(gòu)的驗收標準。近年來相繼在埃及伊蚊、岡比亞按蚊、斯氏按蚊、家蠅和地中海實蠅中鑒定出雄性性別決定基因Nix,Yob,Guy1,Mdmd和MoY，極大豐富和完善了雙翅目昆蟲性別決定和分化分子機制，通過對這些雄性決定基因改造改變昆蟲性別，使其性別分化向著有利于人類的方向發(fā)育，如：使害蟲種群全部產(chǎn)生雄性后代，導(dǎo)致其不能繁衍，發(fā)展不依賴輻射處理的昆蟲不育防治技術(shù)(SIT)；或使天敵種群全部產(chǎn)生雌性后代，擴大害蟲天敵的種群數(shù)量，為害蟲天敵的遺傳改良提供有效途徑。特別是發(fā)展基于CRISPR/Cas9的基因驅(qū)動系統(tǒng)進行害蟲性別分離，將加快害蟲遺傳調(diào)控和不育防治技術(shù)的發(fā)展。