郭洪壯，胡月明，王輝，涂宗財(cái),2,3*

1(南昌大學(xué)，食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌，330047)2(江西師范大學(xué)，國(guó)家淡水魚(yú)加工技術(shù)研發(fā)專(zhuān)業(yè)中心，江西 南昌，330022)3(江西師范大學(xué)，江西省淡水魚(yú)高值化利用工程技術(shù)研究中心，江西 南昌，330022)

CompositionofcalciuminthebonesoffourmajorChinesecarps

GUO Hongzhuang1,HU Yueming1,WANG Hui1,TU Zongcai1,2,3*

1(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)2 (National R&D Center for Freshwater Fish Processing (Nanchang), Jiangxi Normal University, Nanchang 330022, China)3(Engineering Research Center for Freshwater Fish High-value Utilization of Jiangxi Province, Jiangxi Normal University, Nanchang 330022, China)

Keywordsfour major Chinese carps; Raman spectroscopy; X-ray photoelectron spectroscopy; X-ray diffraction; the composition of fish bone calcium

我國(guó)是世界淡水漁業(yè)大國(guó)，青魚(yú)、草魚(yú)、鰱魚(yú)、鳙魚(yú)作為傳統(tǒng)“四大家魚(yú)”，養(yǎng)殖歷史十分悠久，其產(chǎn)量一直位居前列，直到今天，仍然是我國(guó)淡水魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖的主體魚(yú)類(lèi)[1]。2017年全國(guó)淡水魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖產(chǎn)量2 540.98萬(wàn)t，其中草魚(yú)、鰱魚(yú)、鳙魚(yú)位居前三[2]，青魚(yú)雖產(chǎn)量較低，但因其口感優(yōu)良，也深受消費(fèi)者喜愛(ài)。

魚(yú)骨是魚(yú)體中軸骨(頭骨和脊骨)、附肢骨(奇鰭骨和偶鰭骨)和魚(yú)刺的總稱(chēng)[3]，占魚(yú)體總質(zhì)量的10%～15%[4]，在魚(yú)體中主要起支撐與保護(hù)功能。作為魚(yú)類(lèi)加工過(guò)程中產(chǎn)生的下腳料之一，魚(yú)骨常被當(dāng)成加工廢料處理，隨意傾倒和掩埋，嚴(yán)重污染環(huán)境，或者用作生產(chǎn)飼料和肥料，經(jīng)濟(jì)效益很低。因此為了提高魚(yú)骨的利用價(jià)值，在食品工業(yè)中，魚(yú)骨常被加工成各種補(bǔ)鈣產(chǎn)品，如活性鈣[5]、螯合鈣[6]等，但是魚(yú)骨鈣的組成形式尚未探究清楚，研究者們一般將其簡(jiǎn)單定義為羥基磷灰石，更為詳細(xì)的組成形式鮮見(jiàn)報(bào)道。前人報(bào)道，人骨中的鈣鹽主要以結(jié)晶的磷灰石(60%)和無(wú)定形的CaHPO4(40%)形式存在[7]，而魚(yú)骨的鈣鹽還未有這樣的探索?！八拇蠹音~(yú)”魚(yú)骨是重要的高值化加工原料，不同魚(yú)骨鈣的組成形式對(duì)其加工利用存在一定的影響，例如酸法是最常用的利用魚(yú)骨鈣的方法，而在1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓、25 ℃下，CaHPO4的溶解度約是Ca3(PO4)2的68倍[8]，其與酸反應(yīng)的速率與產(chǎn)物也不一致。

因此，本文以“四大家魚(yú)”魚(yú)骨為原料，通過(guò)紅外光譜、掃描電鏡、拉曼光譜、X射線光電子能譜(X-ray photoelectron spectroscopy, XPS)、X射線衍射(X-ray diffraction,XRD)等手段，結(jié)合光譜學(xué)、食品學(xué)、材料學(xué)等方向內(nèi)容對(duì)其魚(yú)骨鈣的組成形式進(jìn)行研究，以期能夠詳細(xì)分析出“四大家魚(yú)”魚(yú)骨鈣的組成形式，為魚(yú)骨鈣的綜合利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青魚(yú)、草魚(yú)、鰱魚(yú)、鳙魚(yú)各3條，江西省南昌市江大南路菜市場(chǎng)，體重規(guī)格均為2～3 kg，取其脊骨；氯仿、H2O2、無(wú)水乙醇(分析純)，西隴科學(xué)股份有限公司；甲醇(分析純)，國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Nicolet 5700型傅里葉紅外光譜儀，美國(guó)熱電尼高力公司；JSM 6701F型場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡帶能譜儀，日本電子公司；ESCALAB250Xi型X射線光電子能譜儀，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；LabRAM HR型激光拉曼光譜儀，法國(guó)Jobin Yvon公司；D8 Advance型X射線衍射儀，德國(guó)Bruker公司；SXL-1002型程控箱式電爐,上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 紅外光譜

魚(yú)骨初步破碎后于V(氯仿)∶V(甲醇)=1∶1溶液中完全浸沒(méi)6 h，再經(jīng)超純水清洗，60 ℃烘箱中烘干12 h，研磨成粉。采用壓片法對(duì)魚(yú)骨粉進(jìn)行紅外光譜分析，取適量魚(yú)骨粉與KBr共同壓片，放入紅外光譜儀測(cè)量，測(cè)量參數(shù)為儀器分辨率4 cm-1、掃描累加32次、掃描范圍4 000～400 cm-1。

1.3.2 掃描電鏡

魚(yú)骨初步破碎后于V(氯仿)∶V(甲醇溶液)=1∶1中完全浸沒(méi)6 h，再用體積分?jǐn)?shù)為30%的H2O2浸泡48 h，使用雙蒸水于超聲機(jī)內(nèi)清洗2 h，無(wú)水乙醇脫水，真空冷凍干燥，取若干顆粒噴金后放入掃描電鏡觀察。

1.3.3 XPS

魚(yú)骨初步破碎后于V(氯仿)∶V(甲醇溶液)=1∶1中完全浸沒(méi)6 h，再經(jīng)超純水清洗，60 ℃烘箱中烘干12 h，研磨成粉。將適量魚(yú)骨粉放入樣品臺(tái)正中間，用X射線光電子能譜儀測(cè)量，測(cè)量參數(shù)為源槍類(lèi)型Al靶(1 486.6 eV)、光斑650 μm、 掃描步長(zhǎng)0.100 eV，結(jié)果用XPSPEAK41軟件分析。

1.3.4 拉曼光譜

魚(yú)骨初步破碎后于V(氯仿)∶V(甲醇溶液)=1∶1中完全浸沒(méi)6 h，再經(jīng)超純水清洗，60 ℃烘箱中烘干12 h，研磨成粉。將適量魚(yú)骨粉放在樣品室內(nèi)，用拉曼光譜儀測(cè)量，測(cè)量參數(shù)為激發(fā)波長(zhǎng)632.8 nm、光譜儀焦長(zhǎng)800 mm、掃描頻移范圍300～3 500 cm-1，結(jié)果用PeakFit v4.12軟件(Systat 公司，美國(guó))分析。

1.3.5 XRD

魚(yú)骨經(jīng)900 ℃灰化8 h后研磨成粉。將適量魚(yú)骨粉放入樣品臺(tái)正中間，用X射線衍射儀測(cè)量，測(cè)量參數(shù)為光源Cu-Kα(λ=1.540 56 nm)、檢測(cè)電壓40 kV、電流80 mA、掃描角度5°～80°、掃描步長(zhǎng)2 °/s，結(jié)果用X′Pert HighScore Plus軟件(帕納科公司，荷蘭)分析。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

同種魚(yú)的3條魚(yú)骨作為3個(gè)平行，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次；文中需要繪制的圖均使用Originpro 8.0軟件進(jìn)行繪制；數(shù)據(jù)利用SPSS 17.0軟件(SPSS Inc, Chicago, Illinois, USA)中的Duncan’s test進(jìn)行顯著性分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅外光譜分析

圖1 四種魚(yú)骨的紅外光譜圖Fig.1 Infrared spectra of four kinds of fish bones

2.2 掃描電鏡分析

魚(yú)骨經(jīng)過(guò)脫脂、脫蛋白處理后，通過(guò)掃描電鏡可以看到骨中鈣鹽的形貌，結(jié)果如圖2所示。首先可以看到鰱魚(yú)骨上出現(xiàn)了許多孔洞，這可能是因?yàn)轹桇~(yú)骨中膠原蛋白含量比較高[10]，與鈣鹽結(jié)合的較多，膠原蛋白被過(guò)氧化氫脫去形成孔洞。另外4種魚(yú)骨的鈣鹽都存在多種形貌，前人報(bào)道骨中不同類(lèi)型鈣鹽的形貌是不同的，以羥基磷灰石為代表的晶體鈣鹽多以片狀形式存在[11]，非晶體鈣鹽多以無(wú)定形的CaHPO4形式存在，這說(shuō)明4種魚(yú)骨的鈣都可能以羥基磷灰石與無(wú)定形的CaHPO4的形式存在。

1-青魚(yú)；2-草魚(yú)；3-鰱魚(yú)；4-鳙魚(yú)；a-放大100倍；b-放大500倍；c-放大1 000倍圖2 四種魚(yú)骨的掃描電鏡圖Fig.2 Scanning electron microscope of four kinds of fish bones

2.3 XPS分析

XPS可以根據(jù)譜圖中各種元素的特征峰位，確定魚(yú)骨中各種元素的化學(xué)價(jià)態(tài)。圖3為4種魚(yú)骨的XPS全譜掃描圖。通過(guò)4種魚(yú)骨Ca、O、P的特征峰位，Ca 2p特征峰處于350.6與347.0 eV，O 1s特征峰處于531.0 eV，P 2p特征峰處于133.0 eV附近，可以確定4種魚(yú)骨中Ca，O，P的價(jià)態(tài)分別為+2，-2和+5價(jià)[12]，磷酸鹽以正磷酸鹽的形式存在。

圖3 四種魚(yú)骨的XPS全譜掃描圖Fig.3 XPS full-spectrum scanning images of four kinds of fish bones

通過(guò)對(duì)4種魚(yú)骨XPS譜圖上Ca、P的特征峰進(jìn)行擬合分析，利用其峰面積進(jìn)行計(jì)算，可以得出4種魚(yú)骨的Ca、P兩種元素原子數(shù)的比值(Ca/P)，結(jié)果如表1所示。已知純羥基磷灰石中Ca/P約為1.67，4種魚(yú)骨的Ca/P都比1.67小，依次為青魚(yú)骨1.40、草魚(yú)骨1.38、鰱魚(yú)骨1.25、鳙魚(yú)骨1.27，這說(shuō)明4種魚(yú)骨中都存在一定量的無(wú)定形CaHPO4，致使P元素原子數(shù)增多，Ca/P減小。

表1 四種魚(yú)骨鈣的Ca/P的比較Table 1 Comparison of Ca/P of four kinds of fish bones

經(jīng)過(guò)對(duì)Ca進(jìn)行窄譜掃描、荷電校正后得出4種魚(yú)骨Ca的精確峰位。4種魚(yú)骨Ca的峰位與峰間距存在一定的差異，其中草魚(yú)骨與其他3種魚(yú)骨的差異最為顯著，其峰位出現(xiàn)在347.05和350.70 eV處，均大于其他3種魚(yú)骨(圖4)。通常當(dāng)被測(cè)原子與電負(fù)性大的原子結(jié)合時(shí)，其原子核外電子云密度會(huì)減小，會(huì)導(dǎo)致其XPS峰向高結(jié)合能方向位移[13]。草魚(yú)骨峰位出現(xiàn)了整體向高結(jié)合能方向移動(dòng)的情況，可能是由于相比其他3種魚(yú)骨，草魚(yú)骨Ca存在的形式是不同的，羥基磷灰石OH-發(fā)生更多的F-取代，晶格畸變更明顯。

圖4 四種魚(yú)骨Ca的XPS窄譜掃描圖Fig.4 XPS Narrow Spectra of Ca of four kinds of fish bones

2.4 拉曼光譜分析

a-原始數(shù)據(jù)；b-處理圖圖5 四種魚(yú)骨的拉曼光譜及部分處理圖Fig.5 Raman spectra and partial treatment diagrams of four kinds of fish bones

表2 四種魚(yú)骨的比值與礦物結(jié)晶度的比較Table 2 Comparison of and mineral crystallinity of four kinds of fish bones

磷灰石是晶體，但骨中鈣也會(huì)以非晶體的無(wú)定形CaHPO4的形式存在[17]，礦物結(jié)晶度一定程度上可以代表磷灰石的含量，結(jié)果為青魚(yú)>草魚(yú)>鳙魚(yú)>鰱魚(yú)。

青魚(yú)骨與草魚(yú)骨的無(wú)定形CaHPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)接近40%，與成人骨較為接近，而鰱魚(yú)骨與鳙魚(yú)骨的無(wú)定形CaHPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過(guò)了60%，比人骨要高；磷灰石的含量是羥基磷灰石與碳酸磷灰石含量的加和，結(jié)果為青魚(yú)>草魚(yú)>鳙魚(yú)>鰱魚(yú)，該結(jié)果與拉曼光譜的結(jié)晶度數(shù)據(jù)一致；人骨中碳酸磷灰石質(zhì)量分?jǐn)?shù)在4%～8%[19]，而4種魚(yú)骨的碳酸磷灰石含量都超出許多，這可能與其生活習(xí)性有關(guān)。碳酸磷灰石與無(wú)定形CaHPO4的溶解度比羥基磷灰石要高，易被酸溶解，所以提取酸溶性鈣或熬制骨湯，鰱魚(yú)骨和鳙魚(yú)骨更為合適。

表3 四種魚(yú)骨的羥基磷灰石、碳酸磷灰石、無(wú)定形CaHPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)的比較 單位：%

2.5 XRD分析

灰化后的青魚(yú)、草魚(yú)、鰱魚(yú)、鳙魚(yú)骨尋出了相同的物相，只是含量有所不同。草魚(yú)骨中尋出了含量較多的硒磷灰石，含量較少的氯磷灰石，且羥基磷灰石含量最低，氟磷灰石含量最高，這與XPS的分析結(jié)果是基本一致的。草魚(yú)肉中含有硒元素，部分沉積到骨鈣中，提高了骨的硒含量，但氟元素含量比較高，一定量的氟會(huì)帶來(lái)許多病痛，大量的氟甚至?xí)?dǎo)致人中毒[21]，因此相比其他3種魚(yú)骨，對(duì)草魚(yú)骨的利用要慎重。

圖6 四種魚(yú)骨的XRD圖Fig.6 XRD patterns of four kinds of fish bones

表4 四種魚(yú)骨的磷灰石物相及各自質(zhì)量分?jǐn)?shù)的比較單位：%

羥基磷灰石由于具有獨(dú)特的生物相容性、骨傳導(dǎo)性和誘導(dǎo)性，被廣泛應(yīng)用于各種生物醫(yī)學(xué)材料中，魚(yú)骨為原料生產(chǎn)的羥基磷灰石純度較好、成本低廉，且研究者們對(duì)其進(jìn)行細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)無(wú)明顯毒性[22]。因此魚(yú)骨中的鈣不僅可以加工成補(bǔ)鈣產(chǎn)品，而且可以用作生產(chǎn)羥基磷灰石。

磷灰石在骨中以六方晶系的結(jié)構(gòu)存在，經(jīng)過(guò)搜索晶胞與修正晶胞后，得到4種魚(yú)骨的晶胞參數(shù)。其中青魚(yú)骨晶胞參數(shù)a=b=0.941 5 nm、c=0.686 9 nm、V=0.527 368 nm3；草魚(yú)骨a=b=0.940 5 nm、c=0.685 7 nm、V=0.525 309 nm3；鰱魚(yú)骨a=b=0.941 6 nm、c=0.687 6 nm、V=0.528 009 nm3；鳙魚(yú)骨a=b=0.941 5 nm、c=0.687 2 nm、V=0.527 527 nm3，可以看出,4種魚(yú)骨的晶胞參數(shù)大小是鰱魚(yú)>鳙魚(yú)>青魚(yú)>草魚(yú)，這可能與F-的取代有關(guān)，F(xiàn)-比OH-的體積要小，當(dāng)F-取代OH-時(shí)會(huì)使晶胞參數(shù)變小。本文參考的標(biāo)準(zhǔn)卡片01-084-1 998顯示純的羥基磷灰石的晶胞參數(shù)為a=b=0.941 7 nm、c=0.687 6 nm、V=0.527 910 nm3，與青魚(yú)、鰱魚(yú)、鳙魚(yú)骨灰化后的晶胞參數(shù)較為接近，因此這3種魚(yú)骨灰化得到的羥基磷灰石純度較高，可以作為一種優(yōu)質(zhì)的羥基磷灰石加工原料。

3 結(jié)論

本文創(chuàng)新性的利用多組光譜和掃描電鏡數(shù)據(jù)，結(jié)合光譜學(xué)、食品學(xué)、材料學(xué)等方向內(nèi)容，構(gòu)建了一種分析“四大家魚(yú)”魚(yú)骨鈣組成形式的方法。該方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確度高，能較詳細(xì)地分析出樣品的骨鈣組成形式，為魚(yú)骨鈣的綜合利用提供更多的科學(xué)依據(jù)，也為研究其他物種的骨鈣組成形式提供一定的參考。

青魚(yú)骨與草魚(yú)骨的無(wú)定形CaHPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)接近40%，與成人骨較為接近，而鰱魚(yú)骨與鳙魚(yú)骨的無(wú)定形CaHPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)均超過(guò)了60%，比人骨要高；4種魚(yú)骨的碳酸磷灰石含量都比人骨超出許多。根據(jù)碳酸磷灰石與無(wú)定形CaHPO4的含量，得出鰱魚(yú)骨和鳙魚(yú)骨更為適合提取酸溶性鈣或家用熬制骨湯。草魚(yú)骨不僅含有硒，也有許多氟，因此相比其他3種魚(yú)骨，草魚(yú)骨的利用要慎重。青魚(yú)、鰱魚(yú)、鳙魚(yú)骨灰化后的晶胞參數(shù)與純羥基磷灰石更為接近，因此這3種魚(yú)骨可以作為一種優(yōu)質(zhì)的羥基磷灰石加工原料。這些結(jié)果可以為“四大家魚(yú)”魚(yú)骨鈣的綜合利用提供一定的理論依據(jù)。