馬凱，蔡芳葉，黃永橋，吳新文，楊昌彪，李占彬*

1(貴州省分析測試研究院，貴州 貴陽， 550000)2(貴州醫(yī)科大學 神奇民族醫(yī)藥學院，貴州 貴陽， 550000)

Detectionofnineaminoglycosidesresiduesinhoneybyultra-performanceliquidchromatography-tandemmassspectrometry

MA Kai1,CAI Fangye2,HUANG Yongqiao1,WU Xinwen1,YANG Changbiao1,LI Zhanbin1*

1(Guizhou Academy of Testing and Analysis, Guiyang 550000, China)2(Shenqi Ethnic Medicine College of Guizhou Medical University, Guiyang 550000, China)

ABSTRACTUltra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) method was developed for the simultaneous detection of aminoglycosides (neomycin, amikacin, dihydrostreptomycin, streptomycin, hygromyxin B, kananmycin, gendamicin, tobramycin, spectinomycin). The residues of aminoglycosides in the honey were extracted with TCA buffer, enriched and cleaned up with HLB solid phase extraction column, and eluted with aqueous elution. And the ion-pairing reagent was added to the final extract and used to optimize the chromatography conditions. Moreover, the extracts were separated on reversed-phase chromatographic column using acetonitrile-water as mobile phase by gradient elution, and detected by liquid chromatography-mass spectrometry under multiple reaction monitoring mode via positive ion mode. All the analytes were calibrated by the external method. The results showed that the method has a good linear relationship in the range of 20-1 000 ng/mL. Moreover, the quantification limit of neomycin, dihydrostreptomycin, streptomycin, kanamycin, and tobramycin is 5 μg/kg; the quantification limit of amikacin, hygromycin B, gentamicin, and spectinomycin is 10 μg/kg. Within the linear range, three concentrations of addition experiments were carried out in the blank honey samples, the sample recovery rates ranged from 72.6%-109.4%, and the relative standard deviations were 2.13%-8.23%. The method developed here has the advantages of easy operation, high sensitivity and good filter effect. By avoiding the use of ion-pairing reagent in the mobile phase, the method could effectively reduce the pollution of mass spectrometer and better meet the detection requirements of the aminoglycoside residues in honey.

Keywordsaminoglycosides; honey; ultra performance liquid chromatograph-tandem mass spectrometry

氨基糖苷類抗生素(aminoglycosides, AGs)是一類含有氨基糖苷健的抗生素，具有廣譜抗菌性，臨床應用廣泛，主要用于治療革蘭氏隱性菌、綠膿桿菌的感染，目前已有數十個天然抗生素或半合成品種[1-2]。隨著養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，氨基糖苷類抗生素因其高效、低價，常常被用來治療或者添加到飼料中預防各種動物疾病[3-5]，是使用較為普遍的抗生素種類之一，但AGs同時具有一定的毒副作用，主要表現在腎毒性、耳毒性、神經肌肉毒性等[6]。在我國，AGs在養(yǎng)蜂業(yè)中被廣泛使用，主要是防治蜜蜂幼蟲病[7-9]。但是由于蜂農不科學的使用，可能導致蜂蜜及其蜂產品中AGs的殘留，消費者直接食用這類殘留超標的食品會帶來潛在的危害。美國FDA、歐盟委員會和日本厚生勞動省等相關管理機構對動物源性食品中常用的幾種AGs的殘留限量標準作出了規(guī)定[10-12]。我國在新頒布實行的GB 31650—2019中對AGs在動物源性食品中也有明確的限量要求[13]。

目前，針對AGs殘留的檢測方法主要有微生物法、酶聯(lián)免疫法、液相色譜法、氣相色譜-質譜法和液相色譜-串聯(lián)質譜法等[14-16]。液相色譜-串聯(lián)質譜法因其高通量、定性定量準確、靈敏度高，而被廣泛應用于此類抗生素的檢測。由于AGs極性較強，在反相色譜柱上保留很弱，其分離檢測仍然是此類藥物殘留檢測的難點之一。本研究以新霉素、阿米卡星、雙氫鏈霉素、鏈霉素、潮霉素B、卡那霉素、慶大霉素、妥布霉素、大觀霉素9種藥物作為研究對象，結合固相萃取小柱前處理凈化，選取乙腈-水體系作為流動相，在最終提取液中添加離子對試劑優(yōu)化色譜行為，采用反相色譜分離體系，建立了同時測定蜂蜜中9種氨基糖苷類藥物的超高效液相色譜-串聯(lián)質譜(ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry, UPLC-MS/MS)分析方法。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與裝置

超高效液相色譜-串聯(lián)質譜儀，美國安捷倫公司(Agilent 1290/6470)；高速離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司(L-500型)；電子天平(精確到0.01 g)，常熟市雙杰測試儀器廠；瓶口分液器,德國普蘭德公司；(UMV-2)多管旋渦混合器,北京普立泰科儀器有限公司；Milli-Q實驗室超純水制備系統(tǒng)(Milli-Q Intergra115)，美國Millipore公司產品；12管固相萃取裝置，美國SUPELCO公司；旋渦混合器(XW-80A型),蘇州江東精密儀器有限公司；移液器(規(guī)格10～100 μL、100～1 000 μL、1～5 mL)，大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司。

1.2 試劑與材料

乙腈(色譜純)，德國Merck公司;甲酸、七氟丁酸(色譜純)，上海安譜實驗科技股份有限公司;異丙醇(分析純)，天津市富宇精細化工有限公司;乙酸銨(優(yōu)級純)，山東西亞化學股份有限公司;乙二胺四乙酸二鈉、三氯乙酸(分析純)，成都市科龍化工試劑廠;NaCl(分析純)，成都金山化學試劑有限公司;HCl(優(yōu)級純)，國藥集團化學試劑有限公司;NaOH(分析純)，天津市科密歐化學試劑有限公司；CNW Poly-Sery HLB SPE 小柱(150 mg/6mL)，上海安譜實驗科技股份有限公司;有機微孔濾膜(0.22 μm),上海安譜實驗科技股份有限公司；妥布霉素、慶大霉素、卡那霉素、潮霉素B、阿米卡星、新霉素、大觀霉素、鏈霉素、雙氫鏈霉素混合標準溶液(100 μg/mL)，天津阿爾塔科技有限公司。

標準儲備液的制備：準確移取氨基糖苷類混合標準溶液，用水定容至刻度，配成質量濃度為10 μg/mL的標準儲備溶液，4 ℃避光可保存1個月。

樣品提取液的制備：準確稱取0.77 g乙酸銨，置于1 L的燒杯中，加入約900 mL水，溶解，用稀HCl溶液或NaOH溶液調節(jié)pH至4.0，然后分別加入0.15 g乙二胺四乙酸二鈉、5 g NaCl和20 g三氯乙酸，使固體溶解，混合均勻，并轉移至1 000 mL容量瓶中，定容至刻度。

1.3 樣品前處理方法

1.3.1 提取

稱取5 g(精確到0.01 g)樣品，置于50 mL聚丙烯離心管中，加入20 mL樣品提取液，置于多管旋渦混合器充分提取5 min；然后將樣品在4 200 r/min下離心5 min，收集上清液于另一聚丙烯離心管中，用稀HCl或NaOH溶液將上清液pH調節(jié)至6.5±0.5。

1.3.2 凈化

取HLB固相萃取小柱，預先以5 mL甲醇，5 mL水活化，然后將pH調節(jié)后的上清液全部過柱，控制上樣流速小于1 mL/min，棄去流出液，以5 mL水淋洗，棄去淋洗液并真空抽干2 min，用2 mLV(甲酸)∶V(異丙醇)∶V(水)=10∶5∶85洗脫液進行洗脫，收集洗脫液于聚丙烯刻度管中，加入20 μL七氟丁酸，并用洗脫液定容至2 mL，旋渦混勻后，過0.22 μm有機微孔濾膜，使用UPLC-MS/MS進行分析。

1.3.3 基質匹配工作曲線

取空白蜂蜜樣品，按1.3.1和1.3.2前處理方法，得到空白基質液，用空白基質液稀釋標準溶液，配制出20、50、125、250、500、1 000 ng/mL氨基糖苷類混合標準工作液，用UPLC-MS/MS分析后，經儀器軟件數據處理后，得到基質匹配工作曲線。

1.4 實驗條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse plus C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；流動相：A為0.1%甲酸水溶液(含0.5 mmol/L乙酸銨)，B為乙腈；流速0.3 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量2 μL；梯度洗脫程序：0～2 min(5%B)，2～2.5 min (5%B～8%B)，2.5～6 min(8%B～40%B)，6～6.5 min (40%B～90%B)， 6.5～8.5 min(90%B)，8.5～9.5 min(90%B～5%B)，9.5～11 min(5%B)。

1.4.2 質譜條件

電噴霧離子源(electron spray ionization,ESI)，多反應監(jiān)測模式，正離子掃描，毛細管電壓5 500 V，噴嘴電壓500 V，霧化氣壓力45 psi，干燥氣溫度300 ℃，干燥氣流速6 L/min，鞘氣溫度300 ℃，鞘氣流速10 L/min，Delta EMV值為600，氨基糖苷類藥物定性、定量離子、錐孔電壓、碰撞能量等參數列于表1。

表1 目標物的保留時間及質譜參數Table 1 Retention times and mass spectrometric parameters for the analytes

2 結果與分析

2.1 液相色譜條件的選擇

AGs易溶于水，極性強，在反相色譜柱幾乎無保留，目前液相色譜法主要是在流動相中使用離子對試劑，如庚烷磺酸鈉等，液質聯(lián)用法在流動相添加七氟丁酸、三氟乙酸等具有揮發(fā)性且能增強保留的物質。然而，這將帶來新的問題，如與質譜不兼容或者產生離子抑制效應(特別是對于負離子模式)等。隨著親水作用色譜的發(fā)展，有研究使用親水色譜柱進行氨基糖苷類藥物的分析[17-19]，但常規(guī)的HILIC柱與比反相色譜柱相比，流動相條件發(fā)生變化，重新平衡時間較長，在梯度洗脫程序中的平衡時間也相對較長，此外，為了縮短分析時間，提高藥物分離度，改善被分析物的峰形，需要使用高濃度鹽(100～200 mmol/L)做流動相，如甲酸銨或者乙酸銨等，但會使目標物產生較強的離子抑制現象，降低靈敏度。

本實驗將離子對試劑，如庚烷磺酸鈉和七氟丁酸等，添加到最終提取溶液中，以常規(guī)C18色譜柱(Agilent Eclipse plus C18)為分析柱，選取乙腈-0.1%甲酸水為流動相體系，考察9種AGs藥物的分離效果。實驗表明，最終提取溶液中添加磺酸鹽和七氟丁酸，都具有增強保留能力，提高各目標物的分離度，但七氟丁酸與磺酸鹽相比，沸點較低，易揮發(fā)，能改善質譜的電離效果，增強被分析物的響應，此外，在最終提取溶液中使用七氟丁酸，避免了在流動相中使用對質譜負離子模式的離子抑制效應。因此，本研究確定在最終提取液中添加七氟丁酸，以反相色譜柱為分析柱，通過優(yōu)化梯度洗脫條件，獲得了9種目標物的合適的保留時間和較好的峰形，如圖1所示。

2.2 質譜條件的優(yōu)化

AGs藥物結構中含有1個或者多個羥基和氨基，呈弱堿性，在質譜上有很強的正離子響應，同時該類藥物具有很強的極性，需采用電噴霧源進行質譜分析[20-21]。本實驗在正離子模式下，采用ESI離子源，將9種化合物的混合標準溶液配制成1 μg/mL進行母離子掃描，得到的母離子均為[M+H]+，優(yōu)化錐孔電壓，對得到的母離子進行子離子掃描，選擇響應較好的2個特征離子作為定量定性離子對，優(yōu)化碰撞能量，然后聯(lián)機液相色譜儀，優(yōu)化干燥氣溫度和流量，鞘氣溫度和流量，霧化氣壓力，毛細管電壓等質譜參數，見1.4.2所述。

本方法中阿米卡星與卡那霉素、雙氫鏈霉素與大觀霉素、潮霉素B與鏈霉素、慶大霉素與新霉素保留時間較為接近，但根據質譜檢測器的原理，對于不同質荷比的化合物具有質量分辨功能，若無法實現有效的色譜分離，也可通過目標物的特征離子對，實現專屬的測定。

2.3 樣品前處理的選擇

2.3.1 樣品的提取

與其他大多數抗生素不同，AGs藥物易溶于水，難溶于乙腈等有機溶劑，這些化合物無法使用乙腈或其他有機溶劑進行萃取，因此常采用低pH的緩沖鹽[22-23]進行提取。本研究中，使用含有三氯乙酸的緩沖鹽溶液將氨基糖苷類抗生素從樣品中萃取出來，并進一步利用有效的固相萃取凈化，除去殘留的三氯乙酸，減少共萃取干擾。

A-最終提取液中未添加七氟丁酸；B-最終提取液中添加七氟丁酸圖1 九種氨基糖苷類藥物特征離子色譜圖Fig.1 Chromatograms of 9 kinds of aminoglycoside

2.3.2 樣品的凈化與基質效應的考察

根據AGs藥物的結構特點，凈化時用到的通用型固相萃取柱主要有HLB柱和離子交換柱(如SCX、PCX、WCX、CBX等)[24-28]，由于離子交換柱多用于單個或者幾種藥物的檢測，而HLB柱對多種AGs藥物的凈化具有較好的效果。本實驗選擇HLB柱對提取液進行凈化處理，采用HLB固相萃取柱凈化時有推薦的活化、淋洗、洗脫方法，推薦的洗脫液一般為甲醇。由于AGs藥物為強極性化合物，水溶性極強，因此本研究嘗試采用水性洗脫液，添加洗脫能力較強的異丙醇，并降低洗脫液的pH值，考察對洗脫效果的影響，分別用體積分數1%、5%、10%、15%的甲酸水性洗脫液進行洗脫，使用量為5 mL，實驗發(fā)現，當洗脫液中甲酸的體積分數≥10%時，9種AGs可被洗脫，回收率均大于70%，如圖2所示。對洗脫液的使用量進行了考察，使用5 mL的水性洗脫液進行洗脫，按1 mL/管分別收集洗脫液，上機測定洗脫液中的目標物含量，結果顯示，收集的洗脫液第3管里目標物質含量已經很低，為節(jié)約分析時間，提高方法的靈敏度，洗脫液體積選擇為2 mL。

圖2 不同洗脫條件下AGs的回收率Fig.2 Recoveries of AGs under different elution conditions

比較了水性洗脫液和純甲醇洗脫液的凈化效果，其凈化效果評價方式主要是考察AGs的基質效應，基質效應(matrix effect，ME)的計算方法參考相關文獻[29-30]進行，即基質效應(ME)=A/B，其中A代表含有空白蜂蜜樣品基被分析物的離子響應值，B代表純溶劑中被分析物的相同濃度的離子響應值。若ME值為0.8～1.2時，基質效應不明顯；若ME值介于0.5～0.8或1.2～1.5時，則為中等程度的基質抑制或增強效應；當ME值<0.5或>1.5，表明基質效應較強。用純溶劑配制質量濃度為50 ng/mL的混合標準溶液，再用空白樣品提取液配制同濃度水平的基質匹配標準溶液，做6組平行，考察樣品基質對各藥物的基質效應，其結果如圖3所示。使用水性洗脫液洗脫目標物，除新霉素有較強的基質增強效應外，其他8種藥物ME值均在0.8～1.2，基質效應不明顯，而使用純甲醇作為洗脫溶劑，樣品基質對目標藥物均有較強的基質抑制或增強效應。結果表明，與有機型洗脫液相比，使用水性洗脫液洗脫AGs藥物時，固相萃取柱能保留大量的基質干擾成分，可使凈化效果得以提高。

圖3 不同洗脫溶劑下的氨基糖苷類藥物的基質效應Fig.3 Matrix effects of aminoglycoside in different elution solve

2.4 線性范圍與定量限

準確移取一定體積的混合標準儲備液，用1.3前處理方法得到的空白基質液稀釋，配制基質匹配標準曲線，按照已優(yōu)化的色譜和質譜條件進行分析，以混合標準溶液的質量濃度為橫坐標，各目標物定量離子峰面積為縱坐標，做線性回歸，結果顯示9種AGs在20～1 000 ng/mL范圍內，線性關系良好(R2>0.995)。

以不含待測組分的蜂蜜為空白樣品，采用空白樣品添加目標物，按照1.3前處理方法進行處理，并上機測定，以定量離子色譜峰的信噪比(S/N)≥10為方法的定量限，計算9種AGs的定量限，具體參數列于表2。

2.5 方法回收率與精密度

對蜂蜜樣品分別進行3個質量濃度水平(50、100、200 μg/kg)的空白加標回收實驗，每個添加水平取6個平行樣品，按1.3和1.4實驗條件進行前處理和測定，計算各個分析物的平均回收率和精密度。

由表3可以看出，被分析物的平均回收率在72.6%～109.4%，相對標準偏差為2.13%～8.23%，表明該方法的準確度和精密度良好，能夠滿足蜂蜜樣品中9種AGs藥物的檢測要求。

表2 九種AGs藥物的線性范圍、回歸方程、相關系數和定量限Table 2 Linear ranges, regression equations, correlation coefficients and LOQs of 9 AGs

表3 蜂蜜樣品中9種AGs藥物的回收率和相對標準偏差(n=6)Table 3 Recoveries and RSDs of 9 AGs in honey samples(n=6)

2.6 實際樣品測定結果

經過確認的方法應用于實際蜂蜜樣品的9種AGs藥物殘留量的測定，以考察該方法的適用性。選取了本實驗室在流通環(huán)節(jié)抽取的53批次的蜂蜜樣品作為檢測對象，其中有2批次樣品中鏈霉素有檢出，檢測值分別為29.7 μg/kg和62.1 μg/kg，其他8種AGs藥物均未檢出。檢測結果表明，鏈霉素作為殺菌類藥物在養(yǎng)蜂業(yè)中被使用。

3 結論

本研究使用三氯乙酸的緩沖鹽溶液提取目標物，以HLB固相萃取柱富集凈化，選擇水性洗脫液洗脫，在最終提取液中添加離子對試劑優(yōu)化色譜行為，選取乙腈-水體系作為流動相，采用反相色譜柱進行分離，建立了同時測定蜂蜜樣品中妥布霉素、慶大霉素、卡那霉素、潮霉素B、阿米卡星、新霉素、大觀霉素、鏈霉素、雙氫鏈霉素9種氨基糖苷類藥物殘留的超高效液相色譜串聯(lián)質譜法。該方法操作簡單，靈敏度高，凈化效果好，在流動相中避免使用離子對試劑，有效減少了對質譜儀的污染，各項目標參數均達到日常檢測的技術要求，能夠較好滿足蜂蜜中氨基糖苷類藥物殘留檢測的需要。