歐福勇 李珍麗 姚曉喜

423000 郴州市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內科(歐福勇、姚曉喜)，耳鼻喉科(李珍麗)

以發(fā)病率高、致殘率高為特點的頸動脈粥樣硬化(carotid atherosclerosis，CAS)是導致患者腦卒中和短暫性腦缺血發(fā)作的主要原因之一。其主要病理改變在于頸動脈內膜大量脂質沉積，血管內皮細胞功能障礙等進而導致動脈血管內膜增生、血管重構等惡性血管事件的發(fā)生[1]。研究表明，頸動脈血管內皮細胞損傷是CAS的始動環(huán)節(jié)[2]。因此，尋找有效的保護頸動脈血管內皮細胞的手段對于CAS的治療具有重大意義。微小RNA(microRNA，miR)是具有調控功能的非編碼RNA，參與調節(jié)血管內皮細胞的生物性能[3]。已經(jīng)證實，miR-217、miR-34a參與調節(jié)內皮細胞的凋亡過程[4]。而近年來，miR-146a對血管內皮細胞的保護作用引起關注。Anzola等[5]研究證實，miR-146a能夠調控腸道微血管內皮細胞抵抗炎癥反應。Wang等[6]研究顯示，miR-146a在由糖尿病引起的神經(jīng)性血管重構中發(fā)揮關鍵作用。但有關miR-146a對頸動脈內皮細胞的作用尚未見報道。Janus激酶2/信號轉導與轉錄激活子1(janus activated kinase 2/signal transducer and activator of transcription 1，JAK2/STAT1)通路是細胞內重要的信號轉導通路，參與調控細胞生長、分化、增殖和凋亡等病理生理過程[7]。Gregersen等[8]報道，STAT1在CAS中存在表達異常的現(xiàn)象。本研究通過構建CAS動物模型，探討miR-146a和STAT1對頸動脈內皮細胞生理功能的影響，以期為臨床研究提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗生物 4月齡清潔級雄性新西蘭白兔40只，體重(2.0±0.2)kg，由我院實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號：SYXK(湘)2018-0008，動物使用許可證號：SYXK(湘)2018-0007；依照我院實驗動物管理辦法，室溫21℃～25℃下，濕度維持在60 %左右，自然光照、標準飼料、自由飲水、單籠飼養(yǎng)1周后用于實驗。

MiR-146a模擬物miR-146a-mimics及miR-146a模擬物陰性對照miR-146a-mimics-NC由上海吉瑪技術有限公司設計完成。

1.1.2 試劑及主要儀器 LipofectamineTMRNAiMAX轉染試劑(德國QIAGEN公司)；全蛋白抽提試劑盒(日本TOYOBO公司)；PBS緩沖溶液、EdU試劑盒(美國Invitrogen公司)；雙熒光素酶測定試劑盒Ⅰ、Ⅲ型膠原兔多克隆抗體(美國Abcamn公司)；麻醉劑、JAK2抗體、磷酸化STAT1(p-STAT1)抗體(美國Jackson公司)；反轉錄試劑盒、Western blot試劑盒(美國Sigma公司)；Transwell小室(美國R&D公司)；TUNEL試劑盒(美國Amresco公司)。

YJ-875A醫(yī)用凈化工作臺(北京六一儀器廠)；LIOOS600T熒光顯微鏡(日本尼康公司)；Bio-rad凝膠成像系統(tǒng)(Bio-rad公司)；-80℃深冷冰箱(德國維根斯公司)；Leica RM2135組織切片機(德國Leica公司)；高速低溫離心機(北京六一儀器廠)；qRT-PCR儀(美國Palo Alto公司)。

1.2 方法

1.2.1 構建頸動脈粥樣硬化動物模型及實驗分組將40只新西蘭白兔按隨機數(shù)字表法分成4組，每組10只，分別為：假手術組(sham組)、模型組、miR-146a-mimics-NC組(對照組)和miR-146a-mimics組(實驗組)。

準確量取2.5 μL的LipofectamineTMRNAiMAX分別與9 μL的miR-146a-mimics-NC、miR-146a-mimics混合均勻，37℃下靜置2 h。通過尾靜脈分別注射7 μL混合液到對照組和實驗組動物體內，注射速度維持在2 μL/min，留針時長5 min，sham組和模型組注射等劑量的生理鹽水。注射完畢24 h后，采用150 g 2%L-蛋氨酸飼料喂養(yǎng)配合頸總動脈球囊損傷法構建頸動脈粥樣硬化模型[9]。具體操作如下：sham組采用標準飼料喂養(yǎng)，模型組、對照組和實驗組每日均使用150 g 2%L-蛋氨酸喂養(yǎng)，喂養(yǎng)2周后，施以球囊損傷造成頸內動脈內膜損傷，繼續(xù)以150 g/d 2%L-蛋氨酸喂養(yǎng)4周。球囊損傷手術如下：術前12 h禁食不禁水，耳緣靜脈注射1 ml/kg 3%戊巴比妥鈉麻醉，兔板固定在手術臺上，常規(guī)方法頸部備皮，沿頸正中線切開皮膚，剝離左側頸總動脈，用虹膜剪在頸總動脈遠心端剪開一個V型切口將直徑為0.67 mm的球囊插入血管內，使用微型注射器來回抽插注入空氣擴張球囊，抽插距離不超過1.5 cm，抽插3次后撤出球囊，使用無菌7-0結扎線在頸正中線切口近心端處結扎頸外動脈，同時松開所有血管鉗，觀察頸動脈內血流正常且無出血點，縫合頸部皮膚，術畢每日1次靜脈注射80萬單位青霉素注射液防止感染，連續(xù)3次。sham組只剝離頸內動脈，不進行球囊擴張和結扎，余同模型組。

1.2.2 HE染色檢測CAS病理改變 喂養(yǎng)4周后，實驗兔均禁食12 h后處死，剝離各組動物的頸內動脈，80%的組織標本進行液氮封存，20%的組織標本，56℃水浴1 h，生理鹽水沖洗10 min，10%甲醛溶液固定1 h，石蠟包埋10 min，切片，蒸餾水清洗3次，HE染色，光鏡下觀察CAS病變程度。

1.2.3 原代培養(yǎng)各組動物頸動脈的血管內皮細胞取出20%各組組織標本，將標本上的脂肪、結締組織剔除干凈，使用微型剪在顯微鏡下將其剪成若干3 mm×3 mm的小片，內皮向下貼入培養(yǎng)瓶中，置入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)4 h后，向培養(yǎng)瓶中加入含有滅活的10%FBS、peillin G、STC的DMEM培養(yǎng)基，在細胞密度達85%后，0.25%胰蛋白酶消化傳代進行后續(xù)實驗。

1.2.4 EdU標記實驗檢測各組細胞的增殖情況調整各組細胞濃度，以5×104個/孔接種于6孔培養(yǎng)板中，置入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)，細胞培養(yǎng)2 h后，10%甲醛固定并進行EdU實驗，操作嚴格按照試劑盒操作要求進行。

1.2.5 Transwell小室檢測各組細胞的遷移 調整各組細胞濃度，以5×104個/孔接種于24孔無血清培養(yǎng)板中，置入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)24 h，用DMEM重懸細胞至細胞濃度為3×105個/L，將250 μL的細胞懸液加入Transwell上室，同時在Transwell下室中添加500 μL濃度為10%的FBS培養(yǎng)液，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)12 h，PBS漂洗后用棉棒擦Transwell小室內部，4%甲醛固定，0.1%結晶紫室溫避光染色10 min，置于倒置熒光顯微鏡下觀察并統(tǒng)計穿過基底膜材料Matrigel細胞數(shù)。

1.2.6 小管形成實驗檢測各組細胞的血管生成能力 在96孔培養(yǎng)板上平鋪一層新鮮Matrigel溶膠，迅速轉移進無菌培養(yǎng)箱設定37℃，待Matrigel溶膠凝固后，將人臍靜脈內皮細胞以1×104個/ml接種在96孔板中，然后分組同上，分別加入各組細胞的培養(yǎng)上清液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，倒置光學顯微鏡下觀察人臍靜脈內皮細胞的血管生成情況并拍照記錄。

1.2.7 TUNEL染色檢測各組細胞的凋亡 調整各組細胞濃度，以5×104個/孔接種于6孔培養(yǎng)板中，置入37℃、5 %CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)，10%甲醛固定，二甲苯浸洗兩次，梯度乙醇浸洗5 min，風干后3%過氧化氫-甲醇浸泡10 min，PBS漂洗3次，每次3 min，然后4℃預冷乙醇上進行如下操作：0.1% TritonX-100、0.1%緩沖液處理2 min，PBS漂洗3次，每次3 min，加入TUNEL反應混合液，加封口膜在暗濕盒中反應1 h，溫度37℃，PBS漂洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，熒光顯微鏡進行觀察。

1.2.8 qRT-PCR檢測miR-146a和STAT1蛋白的mRNA表達 取出10%組織標本，采用常規(guī)方法提取各組實驗動物頸動脈組織標本細胞的RNA，并利用比色法和瓊脂糖凝膠電泳法測定RNA濃度和檢測RNA完整性[10]。采用多基因梯度進行實時定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)，根據(jù)引物設計原則，進行引物序列設計，反應過程：(1)預變性：75℃，120 s；(2)變性：90℃，5 min；(3)退火：60℃，60 s；(4)延伸72℃，30 s；(5)PCR儀采集熒光信號40個循環(huán)。GAPDH作為內參(上游引物為5’-CACATGGCCTCCAAGGA-3’，下游引物為5’-TCCCCTCTTCAAGGGGT-3’)，目的基因miR-146a(上游引物為5’-GGACAATTTGGGCTAGA-3’，下游引物為5’-ACGTAGTTCTCCTGGCA-3’)，STAT1的mRNA(上游引物為5’-AGACAAATGGGCTACA-3’，下游引物為5’-AAAGCTGAGTTTGCGGA-3’)。目的基因相對表達量用2-△△CT表示。

1.2.9 熒光素酶報告基因分析 采用RT-PCR技術從新西蘭白兔的星形膠質細胞基因組中選擇性擴增目的蛋白STAT1的3’-非翻譯區(qū)(3’-untranslated region，UTR)序列，一方面用于構建雙熒光素酶報告基因分析(luciferase reporter gene)中的載體pGL3(pGL3-STAT1-WT)，另一方面構建突變型重組質粒(pGL3-STAT1-MUT)，將人胚胎腎細胞(HEK293)按25%左右密度接種在36孔培養(yǎng)板中，待細胞培養(yǎng)24 h后，在培養(yǎng)板上將miR-146a-mimics和miR-146a-mimics-NC與空載質粒及上述質粒分別進行轉染操作。轉染完成24 h后，嚴格按照雙熒光素酶測定試劑盒說明書進行操作測定樣本的熒光素酶活性，而螢火蟲熒光素酶/海腎熒光素酶活性值即為報告基因活性。

1.2.10 Western blot檢測各組標本中JAK2、p-STAT1蛋白的表達 取出10%各組組織標本，按照常規(guī)提取目標蛋白JAK2和p-STAT1，加入RIPA組織裂解液中勻漿器打碎，冰上裂解30 min后，離心獲得上清，采用BCA試劑盒檢測蛋白濃度，每個樣品取50 μg，然后進行SDS-PAGE電泳、PVDF轉膜、加入封閉液TBST，維持4℃過夜孕育，然后分別加入1∶1 500一抗(JAK2、p-STAT1)，孕育1 h，洗滌加入抗辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG(1∶10 000)，加入ECL顯色30 min，以GAPDH作為內參表示蛋白相對表達水平。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 HE染色檢測各組實驗兔的CAS病理改變

HE染色結果如圖1所示，sham組兔的頸動脈顏色均勻，柔軟且富有彈性，管腔通暢，內膜光滑，內皮細胞結構完整，胞核性狀規(guī)則的定位在細胞中央，內膜、中膜以及外膜界限清晰，內膜細胞形狀規(guī)整多為扁平狀，中膜細胞多為橢圓形的平滑肌細胞，膠原和彈力纖維組織環(huán)繞周圍；模型組兔的頸動脈顏色發(fā)白或略顯黃色，管壁明顯增厚，僵硬度增加，管腔表面失去光澤，管腔內可見粥樣或纖維斑塊，以致管腔狹窄，內膜可見白色條紋或黃白色斑塊，內皮細胞脫落明顯，脂質泡沫細胞增生明顯，中層平滑肌細胞分布紊亂，性狀不規(guī)整，泡沫細胞大量填充，彈力纖維缺失、斷裂、溶解明顯，膠原纖維大量形成；對照組兔的頸動脈顏色黃白相間，彈性缺失，內膜細胞增厚明顯，泡沫狀的細胞大量填充；實驗組兔的頸動脈顏色略顯紅潤，彈性明顯恢復，內膜細胞性狀較模型組明顯好轉，平滑肌細胞排列趨于規(guī)則，泡沫細胞的數(shù)量明顯減少，管腔內的薄層脂斑沉積明顯減少。

2.2 EdU標記實驗檢測各組細胞的增殖情況

EdU標記實驗直接反映細胞內DNA合成能力進而代表細胞的增殖能力。本研究中EdU標記實驗結果如圖2 所示，與sham組相比，模型組細胞內DNA合成能力明顯下降；與模型組相比，實驗組細胞內的DNA合成能力明顯增強，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)。模型組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

與sham組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05

2.3 Transwell小室檢測各組細胞的遷移

Transwell小室檢測結果如圖3所示，與sham組相比，模型組細胞遷移數(shù)量明顯下降；與模型組相比，實驗組細胞的遷移數(shù)量明顯上升，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)。模型組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

A：sham組；B：模型組；C：對照組；D：實驗組；與sham組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05

2.4 小管形成實驗檢測各組細胞的血管生成能力

血管生成主要是內皮細胞的活化、發(fā)芽、增殖、遷移和管樣結構形成的復雜的細胞生理過程。本研究中小管形成實驗結果如圖4所示，與sham組相比，模型組細胞小管形成數(shù)量明顯下降；與模型組相比，實驗組細胞小管形成數(shù)量明顯上升，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)。模型組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

A：sham組；B：模型組；C：對照組；D：實驗組；與sham組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05

2.5 TUNEL染色檢測各組細胞的凋亡

TUNEL染色結果如圖5所示，與sham組相比，模型組細胞凋亡數(shù)量明顯上升；與模型組相比，實驗組細胞凋亡數(shù)量明顯下降，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)。模型組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.6 Western blot檢測各組標本中JAK2、p-STAT1蛋白的表達

Western blot檢測各組標本中JAK2和p-STAT1的蛋白表達水平如圖6所示，與sham組相比，模型組JAK2和p-STAT1的表達明顯升高(均為P<0.05)；與模型組相比，實驗組JAK2和p-STAT1表達明顯下降(均為P<0.05)。模型組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

A：sham組；B：模型組；C：對照組；D：實驗組；與sham組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05

2.7 qRT-PCR檢測各組標本中miR-146a和STAT1蛋白的mRNA表達

qRT-PCR檢測各組標本中miR-146a和STAT1的mRNA表達水平如圖7所示，與sham 組比較，模型組miR-146a的表達水平明顯降低，而STAT1的mRNA表達水平明顯升高(均為P<0.05)；轉染miR-146a-mimics后，與模型組相比，實驗組miR-146a的表達水平明顯升高，而STAT1的mRNA表達水平明顯降低(均為P<0.05)；模型組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

A：sham組；B：模型組；C：對照組；D：實驗組；與sham組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05

2.8 熒光素酶報告基因分析

miR-146a與STAT1蛋白和mRNA的表達的變化趨勢存在一定的負向關系，在生物信息網(wǎng)站(www.microrna.org)上查詢miR-146a(3’ uuggguaccuu-AAGUCAAGAG-u 5’)和STAT1(5’ acaauuauuuu-UACAGUUCUC-c 3’)存在結合位點。采用雙熒光素酶報告基因分析來觀察二者的關系結果如圖8所示，轉染miR-146a后，野生型STAT1的熒光素酶活性被抑制(P<0.05)，突變型STAT1的熒光素酶活性無明顯變化(P>0.05)，表明miR-146a與STAT1具有靶向調控關系。

圖8 雙熒光素酶報告基因檢測結果(n=10)

3 討論

CAS是一種頸動脈壁的具有潛在致死性的炎癥疾病，是機體全身動脈硬化的重要部分，血管內皮損傷是其基礎病理改變。CAS的病因尚未完全闡明，年齡、肥胖、高血壓、高血脂、糖尿病、遺傳、生活方式等均可導致CAS的發(fā)生[11]。目前臨床上治療CAS主要通過外科手段如置入頸動脈血管成形支架手術、頸動脈粥樣斑塊切除手術及經(jīng)皮腔內動脈成形術等來干預CAS的進程[12]。但這些治療手段均對頸總動脈的血管內皮細胞帶來二次損傷，使病灶位置出現(xiàn)動脈狹窄等嚴重病變[13]。因此，開展針對CAS的靶向治療的研究在臨床上具有重大研究意義。

絕大多數(shù)針對CAS的靶向治療的研究處于實驗室階段。研究證實，miRNA不僅在CAS的細胞增殖與凋亡、自噬與分化中扮演重要角色，還可作為調控因子影響CAS的各個階段，如內皮細胞功能障礙、血管平滑肌細胞的表型轉換等[14]。Magenta等[15]研究發(fā)現(xiàn)，miR-200c在CAS的診斷中具有特異性。黃楦檳等[16]研究表明，過表達的miR-21直接推動CAS的發(fā)生、發(fā)展及惡性轉化。miR-146a是定位在5號染色體上的具有免疫調控功能的小分子RNA[17]。研究表明，在如類風濕性關節(jié)炎、膿毒癥等疾病中miR-146a能直接作用于炎癥因子受體負調控炎癥和免疫反應，抑制免疫過度，發(fā)揮細胞保護作用[18]。近來研究表明，miR-146a與血管的生物性能關系密切。Li等[19]研究表明，在單核細胞和巨噬細胞中增強miR-146a的表達，能明顯增強內皮細胞的抗炎癥反應。Wu等[20]研究證實，miR-146a通過調控核因子κB的表達來參與冠心病大鼠血管平滑肌的凋亡。Fang等[21]則證實，miR-146a聯(lián)合內皮干細胞作用減少急性冠心病動物模型的細胞凋亡。Shen等[22]報道，在頸動脈球囊損傷的動物模型中miR-146a的表達異常。本研究構建CAS動物模型后，提取組織標本頸內動脈內皮細胞，研究結果表明過表達miR-146a能明顯提高內皮細胞的增殖、遷移能力以及血管生成能力，明顯降低了內皮細胞的凋亡率。這與之前的研究結果一致。

JAK/STAT信號通路能將細胞膜感受到的信號直接傳導進細胞核內，瞬間激活靶基因的轉錄，直接參與調控細胞的增殖、分化、轉移、凋亡等生理活動[23]。STATs是JAKs激酶的底物，在細胞受到刺激(如損傷、高氧、高糖等因素)磷酸化后能直接與DNA結合，瞬時將酪氨酸信號耦聯(lián)放大，發(fā)揮轉錄調控作用。研究表明，p-STAT1在白細胞相關抗原、協(xié)同刺激因子、趨化因子等炎癥基因的調控中發(fā)揮關鍵作用，促進炎癥反應的發(fā)生發(fā)展[24]。葛會生等[25]研究證實，激活JAK2/STAT1通路嚴重損傷內皮細胞的生物學功能。本研究中qRT-PCR和Western blot結果表明，在CAS模型組中STAT1的mRNA和p-STAT1表達升高，STAT1信號被激活，內皮損傷明顯。通過生物信息網(wǎng)站預測miR-146a與STAT1存在靶向結合位點，熒光素酶報告基因分析證實miR-146a靶向調控STAT1的表達，Western blot結果表明過表達miR-146a后，p-STAT1的表達明顯下降。表明miR-146a通過靶向調控STAT1的表達，來保護CAS中內皮細胞的生物學功能。

綜上所述，本實驗證實了miR-146a和STAT1在頸動脈粥樣硬化中存在表達異常的現(xiàn)象，過表達miR-146a，能夠抑制STAT1的表達，發(fā)揮其保護頸動脈內皮細胞的功能。但miR-146a是否還通過其他信號通路影響頸動脈粥樣硬化還需進一步的研究。本研究中對從頸動脈粥樣硬化大白兔模型的頸內動脈分離出的血管內皮細胞進行了一系列的細胞實驗，獲得了較為明顯的實驗結果，但在體內實驗中miR-146a的靶向作用能否緩解動物的動脈粥樣硬化癥狀仍需深入考量。

利益沖突：無