蘇惠娟 劉 丹 閆 堃 張 超 王文雅,2 袁其朋*

(1.北京化工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 北京 100029; 2.北京化工大學(xué) 廈門北化生物產(chǎn)業(yè)研究院, 廈門 361000;3.濟南市濟陽區(qū)綜合檢驗檢測中心, 濟南 251400)

引 言

葡萄籽是葡萄酒和葡萄汁工業(yè)的主要副產(chǎn)物，含有多種活性物質(zhì)。來源于葡萄籽的多酚——原花青素，具有很好的藥理學(xué)功能，如抗氧化性、抗菌性、抗炎性等[1]，因此葡萄籽原花青素在食品、制藥、醫(yī)療保健等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。葡萄籽中的原花青素主要由單體兒茶素(C)/表兒茶素(EC)及其二聚體，三聚體和高聚體組成，最高可達(dá)十五聚體[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)葡萄籽中65%的原花青素聚合度n大于5[3]，即由5個以上的單體聚合而成，然而關(guān)于原花青素生物利用率的研究顯示，只有聚合度小于5的原花青素才能被人體吸收利用[4-7]。故雖然原花青素有很好的生物活性，但多數(shù)大分子原花青素不能被人體吸收利用，因此將高聚原花青素(n≥5)轉(zhuǎn)化為能被人吸收的低聚原花青素(n<5)或單體是提高其吸收率和推動葡萄籽高附加值利用的重要途徑之一。目前，國內(nèi)外常用的原花青素解聚方法主要有弱酸法[3]、單體鏈斷裂劑法[8]、酸式鹽法[9]、催化劑加氫裂解法[10]、堿裂解法[11]等。上述方法由于普遍存在生產(chǎn)成本高、對設(shè)備要求苛刻，或者有毒性氣體產(chǎn)生等問題，不適用于食品生產(chǎn)過程。酸堿水解法是目前使用較多的原花青素解聚方法，但是由于其潛在的環(huán)保問題和較多的副產(chǎn)物，也亟須改進和提升。利用酶蛋白降解高聚物具有條件溫和、底物特異性強、副產(chǎn)物少等特點，如果能利用生物酶解聚高聚原花青素制備低聚原花青素，將對原花青素的解聚和葡萄籽的高附加值利用產(chǎn)生巨大的推動作用。對于降解原花青素的酶目前尚未有文獻報道，因此本文的研究目的即是從已有的生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫中尋找和挖掘能夠降解原花青素的酶，并對其降解能力進行表征，為酶法解聚原花青素提供研究方法和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗原料

大腸桿菌購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒載體(pETDuet- 1/pMAL/pZE)為本實驗室保存；金黃色葡萄球菌購自中國科學(xué)院微生物研究中心。

限制性內(nèi)切酶和T4連接酶，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；DNA聚合酶及其他PCR反應(yīng)相關(guān)試劑，寶生物工程(大連)有限公司；DNA Marker和蛋白Marker，北京博邁德生物技術(shù)有限公司；涉及的DNA電泳試劑，Biomatik公司；異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，純度大于98%，上海賽百勝公司；蛋白SDS- PAGE電泳相關(guān)試劑，Amresco公司。

純度大于95%的原花青素，天津市尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司；純度大于98%的表兒茶素、兒茶素、原花青素二聚體 B1和原花青素二聚體 B2，成都曼思特生物科技有限公司；其他相關(guān)化學(xué)試劑購買自北京化學(xué)試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

V- 5100B紫外分光光度計，上海元析儀器有限公司；LC- 20AT液相色譜儀(RP- HPLC)，日本島津公司；2- 16KL冷凍離心機，德國Sigma公司；WS600+蛋白電泳儀，河北萬生博朗電子有限公司；01C714超聲波細(xì)胞破碎儀，寧波新芝生物科技有限公司；EPS- 100核酸電泳儀，上海天能科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1高聚原花青素提取

參照文獻[12]中的方法并略作改動，提取制備原花青素樣品中聚合度較高的組分。用超純水溶解葡萄籽原花青素樣品，于容量瓶中定容，隨后在分液漏斗中用乙酸乙酯反復(fù)萃取3次，收集水相并旋干得粗品。用甲醇將粗品溶解后，加入氯仿充分混合靜置，然后離心收集固體，加少量甲醇重新溶解后，將溶液轉(zhuǎn)移至雞心瓶中45 ℃旋干，得到的固體即為高聚原花青素樣品。

1.3.2酶解體系

酶解體系參照Devenish等[13]的方法并稍作改動。將200 mmol/L磷酸緩沖液、酶液與適量的原花青素或精制高聚原花青素固體充分混勻后，在搖床中震蕩反應(yīng)一段時間，其中反應(yīng)體系的總體積為1 mL。反應(yīng)結(jié)束后，檢測反應(yīng)體系中的單體和二聚體原花青素含量。

1.3.3原花青素中單體和二聚體含量測定

本文用來表征原花青素酶解后單體和二聚體含量變化的兩種單體標(biāo)品分別是兒茶素和表兒茶素，兩種二聚體標(biāo)品分別為原花青素B1、B2。采用LC- 20AT液相色譜儀，測定條件如下：流動相為乙腈(A)和0.5%磷酸水溶液(B)，按照表1所示的條件進行梯度混合洗脫；色譜柱為 Diamonsil- C18 色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫設(shè)為35 ℃，流速采用0.7 mL/min，上樣量20 μL，使用二極管陣列檢測器，檢測波長280 nm。

表1 RP- HPLC的梯度洗脫條件Table 1 The RP- HPLC gradient elution conditions

1.3.4基因工程菌構(gòu)建

基因工程菌構(gòu)建過程中所涉及的工程菌的培養(yǎng)轉(zhuǎn)化、重組酶蛋白的提取等分子生物學(xué)方法均參照Sambrook等[14]的研究方法，其中載體構(gòu)建用到的引物如表2和表3所示。

表2 擴增大腸桿菌來源nanA基因所用引物Table 2 Primers for amplifying the nanA gene from Escherichia coli

表3 擴增金黃色葡萄球菌來源nanA基因所用引物Table 3 Primers for amplifying the nanA gene from Staphylococcus aureus

1.3.5數(shù)據(jù)分析

所有實驗重復(fù)3次，利用Origin 2017對實驗數(shù)據(jù)進行分析，數(shù)據(jù)結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 降解酶的基因篩選

原花青素各單元間主要由C4→C8和C4→C6兩種連接方式連接(圖1)，而高聚原花青素降解為低聚原花青素的過程也主要依靠聚合物單體間連接鍵的斷裂。因此通過在酶學(xué)數(shù)據(jù)庫中尋找底物與原花青素結(jié)構(gòu)類似的裂解酶，就有可能挖掘篩選到原花青素降解酶。裂解酶是國際酶學(xué)委員會(IEC)劃分的六大類酶中的一類，在Enzyme Database- BRENDA數(shù)據(jù)庫搜索，發(fā)現(xiàn)能夠斷裂C—C鍵的酶很多，達(dá)上千個。將底物結(jié)構(gòu)類似、來源于原核生物、有文獻報告該酶已經(jīng)被成功重組表達(dá)等因素作為進一步篩選的條件，最終篩選到了N-乙酰神經(jīng)氨酸裂解酶(N-acetylneuraminate lyase, NAL)。NAL能將1分子的N-乙酰神經(jīng)氨酸降解為兩個低分子量的產(chǎn)物[15]；同時，N-乙酰神經(jīng)氨酸與原花青素的結(jié)構(gòu)類似，具有相似的官能團(圖1)，在六元環(huán)結(jié)構(gòu)中都含有一個環(huán)氧基團，NAL裂解N-乙酰神經(jīng)氨酸的位置在環(huán)氧基團附近，這與高聚原花青素降解過程中單體之間C—C連接鍵斷裂的原理類似。鑒于上述這些相似性，選擇來源于大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的N-乙酰神經(jīng)氨酸裂解酶作為進一步研究原花青素降解的目標(biāo)酶。

2.2 N-乙酰神經(jīng)氨酸裂解酶的重組表達(dá)

將來源于金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的NAL基因分別命名為SananA和EcnanA，它們的基因全序列可以從美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)中檢索獲得，基因編號分別為NC_007795(SananA)和NC_000913(EcnanA)。據(jù)文獻報道這兩種酶在大腸桿菌中已表達(dá)，因此大腸桿菌被選作宿主來表達(dá)NAL。圖2為重組質(zhì)粒載體的構(gòu)建過程，pETDuet- 1、pMAL和pZE分別對應(yīng)高拷貝質(zhì)粒、中拷貝質(zhì)粒和弱啟動子質(zhì)粒，由金黃色葡萄球菌及大腸桿菌的基因組PCR擴增得到SananA和EcnanA基因片段，而后將兩種片段分別整合至上述3種不同的質(zhì)粒中，得到6種重組質(zhì)粒，通過優(yōu)化質(zhì)粒的構(gòu)建達(dá)到高表達(dá)可溶性蛋白的目的。

從圖3可以看出，SananA和EcnanA在3種不同的質(zhì)粒中均獲得了較高水平的表達(dá)，其中SananA和EcnanA在pETDuet- 1質(zhì)粒中可溶性表達(dá)量最大，SananA- pETDuet- 1重組質(zhì)粒表達(dá)出的蛋白量最多。盡管在SananA- pETDuet- 1重組質(zhì)粒的細(xì)胞破碎液沉淀中也存在著大量不溶性的目標(biāo)蛋白，但是其可溶性蛋白的表達(dá)量是最大的。進一步將SananA- pETDuet- 1和EcnanA- pETDuet- 1質(zhì)粒表達(dá)的蛋白進行純化，圖4表明純化后獲得了大量純度較高的SnNAL(SananA對應(yīng)的NAL蛋白)和EcNAL(EcnanA對應(yīng)的NAL蛋白)。

2.3 NAL降解原花青素的性能

2.3.1NAL粗酶液降解原花青素的效果

用2.2節(jié)構(gòu)建的6種重組質(zhì)粒表達(dá)的蛋白制備粗酶液進行原花青素降解試驗，嘗試使用文獻[13]的反應(yīng)條件，設(shè)置溫度為50 ℃，pH=8.0，反應(yīng)1 h，反應(yīng)過程中進行氮氣保護，以避免降解產(chǎn)物被氧化。鑒于低聚原花青素非常不穩(wěn)定，此處利用含有單體和二體的原花青素(未經(jīng)處理的粗品)作為酶的底物，以期達(dá)到更為有效的篩選酶的目的，利用酶處理前后原花青素單體和二聚體含量的差值(積累量)來評價體系中酶的降解效率。結(jié)果如圖5所示，與原花青素初始樣品相比，1號反應(yīng)體系有明顯的單體和二聚體積累，說明NAL具有降解高聚原花青素的能力；2～6號反應(yīng)體系無明顯的單體和二聚體積累，甚至還有積累量降低的情況。與7號對照組的結(jié)果進行對比分析，推測大腸桿菌菌體破碎液中可能含有降解單體和二聚體的成分，導(dǎo)致某些反應(yīng)體系中單體和二聚體積累量比原花青素初始樣品對應(yīng)物含量還低。為排除大腸桿菌菌體破碎液對酶降解高聚原花青素的影響，選擇純化后SnNAL和EcNAL蛋白進行降解實驗，進一步研究NAL對高聚原花青素的降解效果。

2.3.2NAL純化產(chǎn)物降解高聚原花青素的效果

將SananA- pETDuet- 1和EcnanA- pETDuet- 1質(zhì)粒表達(dá)的蛋白進行純化(圖4)，用純化后的SnNAL酶和EcNAL酶降解高聚原花青素。酶解過程為：配制10 mg/mL的高聚原花青素溶液，加入純化后酶，在溫度50 ℃、pH=8.0條件下反應(yīng)1 h。

從表4中的結(jié)果可以看出，NAL的確能將高聚原花青素降解為單體和二聚體，而且當(dāng)所用酶含量相同時，SnNAL酶和EcNAL酶降解高聚原花青素產(chǎn)生的單體和二聚體的量無顯著差異，這說明這兩種酶降解高聚原花青素的能力相似?？紤]到金黃色葡萄球菌來源的SnNAL相較于大腸桿菌來源的EcNAL在SananA- pETDuet- 1質(zhì)粒中可溶性蛋白表達(dá)量更多，因此接下來的優(yōu)化實驗選SnNAL作為高聚原花青素的降解酶。

表4 純化后SnNAL和EcNAL的降解效果Table 4 Degradation results for purified SnNAL and EcNAL

2.4 NAL降解高聚原花青素條件的優(yōu)化

參照已有的研究[13]，將反應(yīng)溫度設(shè)定在50 ℃，因為在此溫度下原花青素較為穩(wěn)定且溶解性好，但50 ℃時pH對NAL影響較大。因此之后的實驗將pH、反應(yīng)時間和NAL蛋白濃度對高聚原花青素降解的影響作為優(yōu)化重點。

2.4.1pH

為研究pH對N-乙酰神經(jīng)氨酸裂解酶降解原花青素的影響，設(shè)置如圖6、7所示的pH范圍，將含有單體和二聚體的原花青素(未經(jīng)處理的粗品)作為酶的底物，在質(zhì)量濃度為50 μg/mL的原花青素溶液中加入NAL，使酶質(zhì)量濃度為0.17 mg/mL，反應(yīng)1 h，測定在不同pH下單體和二聚體積累量的變化，同時設(shè)置不加酶的反應(yīng)體系為空白對照，考察pH對原花青素降解產(chǎn)物穩(wěn)定性的影響。

如圖6、7所示，含NAL的體系在實驗的pH范圍內(nèi)起初隨著pH的升高，單體和二聚體積累量呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢，當(dāng)pH達(dá)到10時，單體和二聚體積累量達(dá)到最大值，但是當(dāng)pH大于10時，單體和二聚體積累量迅速下降，說明N-乙酰神經(jīng)氨酸裂解酶的活性在高pH下被抑制，同時單體和二聚體分子穩(wěn)定性差，在堿性條件下可能被降解為更小的分子。由于在極端pH條件下高聚原花青素不穩(wěn)定，故將空白緩沖溶液作為對照組。由實驗數(shù)據(jù)可知，對照組除了在pH為4的酸性條件下單體和二聚體有少許積累，以及在pH為11和12條件下單體和二聚體發(fā)生了降解外，其他pH下空白溶液對單體和二聚體沒有太大影響，最終將pH=10確定為最優(yōu)條件。

2.4.2反應(yīng)時間

反應(yīng)時間的優(yōu)化范圍設(shè)置如圖8所示。在pH=10，反應(yīng)溫度為50 ℃的條件下，在質(zhì)量濃度為10 mg/mL的高聚原花青素溶液中加入質(zhì)量濃度為0.17 mg/mL的NAL進行反應(yīng)，每隔一段時間取樣測定單體和二聚體的含量。結(jié)果顯示，反應(yīng)8 h時單體積累量最高，4 h時二聚體積累量達(dá)到最高；單體和二聚體的積累量達(dá)到最高值后，進一步延長反應(yīng)時間，積累量則呈現(xiàn)下降趨勢。推測出現(xiàn)該現(xiàn)象是單體、二聚體分子不穩(wěn)定降解的結(jié)果，但具體反應(yīng)機制還需進一步深入研究。綜合考慮降解過程中低聚原花青素的積累量，將最優(yōu)反應(yīng)時間設(shè)為8 h。

2.4.3NAL添加量

選擇反應(yīng)溫度50 ℃、反應(yīng)時間8 h、pH=10的酶解條件，在質(zhì)量濃度為10 mg/mL的高聚原花青素溶液中添加不同量的酶(表5)，測定NAL添加量對酶降解效果的影響。結(jié)果表明，在酶添加質(zhì)量濃度區(qū)間為0.09～0.35 mg/mL時，隨著酶濃度的提高單體和二聚體的積累量逐漸增加，當(dāng)添加酶的質(zhì)量濃度大于0.35 mg/mL時單體和二聚體的積累量增加不明顯。因此確定最佳的酶添加質(zhì)量濃度為0.35 mg/mL，在該濃度條件下可得到35.67 mg/g單體和14.49 mg/g二聚體。

表5 SnNAL蛋白濃度對單體和二聚體積累量的影響Table 5 Effect of SnNAL concentration on the yields of monomers and dimers

3 結(jié)論

本文利用生物酶法降低原花青素的聚合度，首先通過基因篩選方法，找到金黃色葡萄球菌來源的SananA和大腸桿菌來源的EcnanA基因用于酶法降解高聚原花青素的研究；然后通過構(gòu)建6種不同的重組菌株來優(yōu)化目標(biāo)蛋白的表達(dá)，結(jié)果表明，將SananA基因構(gòu)建到pETDuet- 1質(zhì)粒，獲得的可溶性蛋白表達(dá)量最優(yōu)。隨后，純化SananA- pETDuet- 1表達(dá)的NAL酶，并對其降解原花青素的條件進行優(yōu)化，確定較優(yōu)的酶解反應(yīng)條件為：反應(yīng)溫度50 ℃、pH=10、反應(yīng)時間8 h、酶添加量0.35 mg/mL，在此條件下得到的單體積累量為35.67 mg/g，二聚體積累量為14.49 mg/g。

上述研究結(jié)果表明利用生物酶法降解高聚原花青素制備低聚原花青素的思路可行，且具有條件溫和、底物特異性強、副產(chǎn)物少等特點。但從實驗結(jié)果可以看出，本文篩選到的NAL的酶解效率與傳統(tǒng)的酸堿水解法相比還有很大差距。因此，未來的研究中可以對已有酶進行定向進化以提高酶解效率，或從基因庫中篩選更多的相同底物譜的酶，從而尋找出解聚原花青素效率更高的酶。