邵陽(yáng) 楊俊鋒 馬勇 徐辰 董赟 吳毛 王善付 殷杰 張素 王建偉

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)常見(jiàn)于嚴(yán)重脊柱外傷后，近些年數(shù)據(jù)顯示，其發(fā)生概率逐年上升。脊髓損傷的發(fā)生涉及到機(jī)體各個(gè)系統(tǒng)，且并發(fā)癥復(fù)雜、嚴(yán)重，治療療程長(zhǎng)、所需費(fèi)用高，效果也不甚滿意，目前也沒(méi)有有效方法可恢復(fù)脊髓損傷后的運(yùn)動(dòng)功能。因此，極高的致殘率、不理想的復(fù)健效果給自身及國(guó)家?guī)?lái)了沉重負(fù)擔(dān)。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)在治療脊髓損傷方面，有較好的療效，中藥復(fù)方脊髓康是其中的代表制劑。研究發(fā)現(xiàn)，中藥復(fù)方脊髓康在能夠清除氧自由基、改善損傷局部的炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)其免疫應(yīng)答、減少細(xì)胞凋亡，有效改善神經(jīng)生長(zhǎng)環(huán)境，促進(jìn)脊髓神經(jīng)元的再生[1-3]。

研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocyte，AS)，是目前促進(jìn)脊髓損傷復(fù)健的熱點(diǎn)。當(dāng)脊髓損傷發(fā)生時(shí)，AS相關(guān)的神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(Glial fibrillary acidicprotein，GFAP)高度表達(dá)，從而對(duì)神經(jīng)再生產(chǎn)生物理屏障；活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞還可以分泌抑制性的細(xì)胞外基質(zhì)分子如硫酸軟骨素蛋白聚糖(Chondroitin sulfate proteoglycans，CSPG)等一大類蛋白多糖，抑制損傷后神經(jīng)再生，從而對(duì)神經(jīng)再生產(chǎn)生一種化學(xué)障礙，因此如何抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞，成為促進(jìn)脊髓神經(jīng)功能修復(fù)的關(guān)鍵。我們擬建立脊髓損傷大鼠模型，設(shè)立不同組別，研究中藥復(fù)方脊髓康對(duì)脊髓損傷大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)的影響，觀察GFAP在不同治療組中的表達(dá)程度。

1 材料與方法

1.1 大鼠及藥物制備

清潔級(jí)雌性SD大鼠，120只，體重220～300 g。無(wú)錫市血液病防治研究所提供，大鼠生產(chǎn)許可證：SCXK(蘇)2017-0007，適應(yīng)性飼養(yǎng)7天。

中藥復(fù)方脊髓康為南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬無(wú)錫附院的傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)方(國(guó)家發(fā)明專利號(hào)：ZL200910026193.7)，實(shí)驗(yàn)用藥由無(wú)錫市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科煎制，分為高、中、低三種濃度湯劑(2.5 g/mL、1.25 g/mL、0.625 g/mL)。冷藏備用。處方：生黃芪30 g、丹參20 g、川芎10 g、赤芍12 g、當(dāng)歸尾12 g、水蛭10 g、蜈蚣1條、制大黃10 g、澤瀉10 g、茯苓10 g、枳實(shí)10 g、厚樸10 g、肉蓯蓉10 g、淫羊藿10 g、地鱉蟲(chóng)10 g、車前子包15 g、益智仁10 g。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

共120只SD大鼠，隨機(jī)分配，共六組，每組20只(選取標(biāo)本時(shí)、隨機(jī)挑選10只)。包括假手術(shù)組、模型組、脊髓康不同劑量組(高濃度、中濃度、低濃度)和強(qiáng)的松組。

1.3 模型制備

本方案采用改良Allen法打擊大鼠T9-T11節(jié)段脊髓。成功造模，可見(jiàn)大鼠脊髓局部組織充血水腫，下肢肌肉痙攣、抽動(dòng)，直至癱瘓。所有實(shí)驗(yàn)SD大鼠，積極預(yù)防感染，術(shù)后1～3天，予青霉素腹腔注射。加強(qiáng)護(hù)理，每日兩次按摩膀胱，促進(jìn)排尿。加強(qiáng)觀察，預(yù)防術(shù)后并發(fā)癥、降低死亡率。

1.4 標(biāo)本采集

各組大鼠分別于3天、7天、14天三個(gè)時(shí)間點(diǎn)組，進(jìn)行標(biāo)本采集。以脊髓損傷大鼠造模損傷區(qū)為中心，逐層切開(kāi)、分離肌肉組織，取出病損區(qū)域脊髓組織，10 mm左右，免疫組化實(shí)驗(yàn)取材后，放置于福爾馬林溶液4℃冰箱保存。RT-PCR實(shí)驗(yàn)取材后，即刻送回實(shí)驗(yàn)室，-70℃冰箱保存。

1.5 觀測(cè)指標(biāo)

1.5.1 斜板實(shí)驗(yàn)、肌力檢測(cè)評(píng)價(jià) 斜板實(shí)驗(yàn)：將SD大鼠置于傾斜木板頂端，觀察其下落角度。以其能夠靜止于板上的最大角度為指標(biāo)；隨機(jī)抽取3只SD大鼠，在規(guī)定時(shí)間點(diǎn)，完成斜板實(shí)驗(yàn)測(cè)試。肌力：按改良的Tarlov標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)脊髓損傷后肌力情況；分為五個(gè)等級(jí)：1分，大鼠后肢未見(jiàn)肌肉收縮；2分，大鼠后肢可見(jiàn)肌肉收縮，無(wú)關(guān)節(jié)活動(dòng)；3分，后肢肌肉收縮、無(wú)法站立；4分，能站立，但行走不能；5分，大鼠后肢肌力正常。各組大鼠術(shù)前均為5分。隨機(jī)抽取3只SD大鼠，在規(guī)定時(shí)間點(diǎn)，完成肌力測(cè)試。

1.5.2 免疫組化法觀察GFAP的表達(dá) 按照實(shí)驗(yàn)步驟，取得各時(shí)間點(diǎn)標(biāo)本，行組織梯度脫水、浸蠟、包埋等處理。行標(biāo)本切片，隨機(jī)選取3份樣本用于檢測(cè)。對(duì)切片洗滌、加入抗體、增強(qiáng)、復(fù)染等相關(guān)操作后，運(yùn)用高倍顯微鏡觀察染色的陽(yáng)性表達(dá)情況。

1.5.3 RT-PCR法測(cè)定脊髓組織中GFAP mRNA表達(dá) 由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行引物設(shè)計(jì)并合成，經(jīng)BLAST引物驗(yàn)證并預(yù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，熔解曲線均為單一峰形，未見(jiàn)其他峰值。具體序列見(jiàn)表1。

表1 基因序列表

由相關(guān)公司進(jìn)行引物設(shè)計(jì)并合成，根據(jù)熒光定量PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)，按照qRT-PCR反應(yīng)體系加樣、操作，按兩步法進(jìn)行PCR反應(yīng)程序。以管家基因GAPDH作為內(nèi)參基因，分析GFAP在脊髓組織中的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 中藥方對(duì)SCI大鼠斜板實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，脊髓損傷大鼠經(jīng)中藥復(fù)方脊髓康治療后，術(shù)后第7天起脊髓康(中、高劑量組及強(qiáng)的松組)斜板實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)較模型組明顯增加(P<0.05)。第14天各給藥組大鼠斜板實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)較模型組明顯增加(P<0.05)，中藥各劑量組治療效果與強(qiáng)的松組相似。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠脊髓斜板實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

2.2 中藥復(fù)方脊髓康對(duì)脊髓損傷大鼠雙后肢神經(jīng)功能評(píng)分的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，脊髓損傷大鼠經(jīng)中藥復(fù)方脊髓康治療后，術(shù)后第7天及第14天雙后肢神經(jīng)功能評(píng)分較模型組明顯增加(P<0.05)，治療效果與強(qiáng)的松組相似。其中中藥復(fù)方脊髓康中等劑量組與強(qiáng)的松組在術(shù)后第3天時(shí)的評(píng)分較模型組增加(P<0.05)，低劑量及高劑量組未見(jiàn)明顯差別。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠雙后肢神經(jīng)功能評(píng)分分)

2.3 免疫組化法觀察GFAP蛋白的表達(dá)

假手術(shù)組鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)AS散在分布，未見(jiàn)明顯肥大、增生，形態(tài)正常。模型組鏡下觀察，可見(jiàn)神經(jīng)纖維損傷，AS反應(yīng)性活化明顯，視野下密集分布，形態(tài)肥大。與模型組相比，強(qiáng)的松組視野下觀察到的AS活化明顯受到抑制，數(shù)量較少，但形態(tài)存在變化，肥大、增生。觀察中藥組可見(jiàn)活化的AS較少，與強(qiáng)的松組相比，星形細(xì)胞有部分肥大。見(jiàn)圖1。

注：本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果僅表明脊髓康能夠發(fā)揮作用。具體組間差異并不明確，故中藥組僅選一組作為示例。

2.4 RT-PCR法測(cè)定脊髓組織中GFAP mRNA表達(dá)

術(shù)后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，模型組GFAP mRNA表達(dá)量最高，且與各給藥組的差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且隨著時(shí)間延長(zhǎng)，在術(shù)后14天，模型組GFAP mRNA表達(dá)量達(dá)到頂峰，明顯高于其他組別(P<0.01)。與強(qiáng)的松組相比，脊髓康高、低劑量組GFAP mRNA相對(duì)表達(dá)量偏高，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，脊髓康中劑量組在術(shù)后3天，GFAP mRNA與強(qiáng)的松組相比未見(jiàn)明顯差異(P=0.064)。強(qiáng)的松組、脊髓康高、中、低劑量組在3天、7天、14天各時(shí)間點(diǎn)GFAP mRNA均呈動(dòng)態(tài)表達(dá)，脊髓損傷3天時(shí)至最高峰，之后逐漸下降。見(jiàn)表4。

3 討論

脊髓損傷的發(fā)生涉及到機(jī)體各個(gè)系統(tǒng)，且并發(fā)癥復(fù)雜、嚴(yán)重，治療療程長(zhǎng)、所需費(fèi)用高，效果也不甚滿意，目前也沒(méi)有有效方法可恢復(fù)脊髓損傷后的運(yùn)動(dòng)功能。AS在體內(nèi)一般存在形式有靜止與活化兩種。當(dāng)SCI發(fā)生時(shí)，AS將由靜止態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨瘧B(tài)?；罨腁S會(huì)促使下游部分脫氫酶同工酶活性將顯著增強(qiáng)，GFAP的表達(dá)水平也明顯升高，AS形態(tài)將顯著增大。當(dāng)受到損傷、缺血等刺激時(shí)，AS將不斷有絲分裂，體積變大，數(shù)量增多，形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。

表4 各組大鼠脊髓組織中GFAP mRNA表達(dá)鼠數(shù)3)

AS在脊髓損傷后的病理變化與以下情況有關(guān)：(1)接觸抑制作用減弱：細(xì)胞間相互接觸可以促進(jìn)細(xì)胞周期素依賴性酶抑制劑P21蛋白的表達(dá)，同時(shí)可對(duì)pRb蛋白的磷酸化產(chǎn)生抑制作用，促使AS再次進(jìn)入細(xì)胞周期。(2)高分子量葡萄糖胺聚糖透明質(zhì)酸(HA)可以使AS保持在靜止態(tài)，對(duì)AS的增殖起到抑制作用；當(dāng)SCI時(shí)，HA的降低會(huì)促使AS的繼發(fā)性增長(zhǎng)。(3)脊髓損傷位置的AS還可經(jīng)旁分泌、自分泌細(xì)胞因子來(lái)促使自身增殖。AS在白介素21B、睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的刺激下將會(huì)由靜止態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨瘧B(tài)；然后在成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-α等的作用下進(jìn)入到細(xì)胞周期；再通過(guò)腫瘤壞死因子-γ、腫瘤壞死因子-α等作用形成膠質(zhì)瘢痕。(4)黏蛋白C不僅能增值A(chǔ)S，也能一直AS，但未活化AS在長(zhǎng)期作用下，會(huì)自行活化。

目前，AS已成為脊髓損傷治療、修復(fù)神經(jīng)元的潛在重要靶點(diǎn)之一。脊髓損傷后病損區(qū)域神經(jīng)元持續(xù)生長(zhǎng)、神經(jīng)功能有效恢復(fù)的關(guān)鍵點(diǎn)，總結(jié)起來(lái)有以下幾方面：(1)能夠提供神經(jīng)元生長(zhǎng)的底物；(2)具有促進(jìn)病損區(qū)域神經(jīng)元生長(zhǎng)的相關(guān)因子；(3)抑制膠質(zhì)瘢痕增生形成所造成的屏障阻隔[4-6]。主流觀點(diǎn)認(rèn)為[7-11]，脊髓損傷后病損區(qū)域星形膠質(zhì)細(xì)胞形成的“物理性屏障”及“化學(xué)系屏障”，是阻礙神經(jīng)元再生及神經(jīng)功能恢復(fù)的關(guān)鍵元兇?；诖死碚?，大量國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)中醫(yī)藥展開(kāi)研究，以此明確其對(duì)于星形膠質(zhì)細(xì)胞的作用及意義。因此，如何調(diào)控AS，同時(shí)減輕繼發(fā)性脊髓損傷，是脊髓損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)的突破口之一[12-14]。

大量針對(duì)GFAP的研究已經(jīng)明確了其作為AS活化的代表性產(chǎn)物，能夠反映膠質(zhì)細(xì)胞活化程度。而CSPG因其能夠改善局部微環(huán)境，改善繼發(fā)性脊髓損傷，而同樣受到關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，脊髓損傷后，脊髓損傷區(qū)域內(nèi)可見(jiàn)CSPG表達(dá)上升[15-16]，治療后感覺(jué)與運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)效果與之密切相關(guān)。鞠躬等[17]研究發(fā)現(xiàn)，在脊髓損傷后，CSPG是阻礙神經(jīng)修復(fù)的關(guān)鍵因素，CSPG會(huì)結(jié)合周圍不同細(xì)胞外基質(zhì)，抑制神經(jīng)再生。有學(xué)者采用干細(xì)胞移植、鞘內(nèi)注射硫酸軟骨素酶ABC等多種手段[18-19]，降低CSPG的表達(dá)，可明顯改善脊髓損傷預(yù)后，促進(jìn)運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。目前研究報(bào)道大多認(rèn)為，CSPG導(dǎo)致的繼發(fā)性神經(jīng)功能受損由糖胺聚糖鏈介導(dǎo)[20]。因此，去除糖胺聚糖鏈或可促進(jìn)功能康復(fù)。

我們對(duì)造模大鼠進(jìn)行研究，設(shè)立實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組，研究中藥復(fù)方脊髓康對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的作用效果及其內(nèi)在機(jī)制。發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的標(biāo)志行產(chǎn)物，GFAP在脊髓損傷區(qū)域呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，這一病理變化符合既往研究結(jié)果。

此次研究證實(shí)，中藥復(fù)方脊髓康能夠促進(jìn)脊髓損傷大鼠運(yùn)動(dòng)及感覺(jué)功能的恢復(fù)，隨著中藥濃度的增加，其療效有增加趨勢(shì)。針對(duì)脊髓損傷大鼠脊髓損傷區(qū)域取材，行免疫組化及RT-PCR，可以明確大鼠脊髓損傷后損傷區(qū)域GFAP表達(dá)明顯增高。在進(jìn)行藥物干預(yù)后，脊髓康各組及強(qiáng)的松組在GFAP表達(dá)上明顯低于模型組，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；脊髓康組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)比較，可以發(fā)現(xiàn)脊髓康中等劑量組在療效上優(yōu)于低劑量組及高劑量組，因此掌握合適的濃度也是提高療效的關(guān)鍵點(diǎn)。

綜上所述，中藥復(fù)方脊髓康能夠促進(jìn)脊髓損傷大鼠斜板實(shí)驗(yàn)和雙后肢神經(jīng)功能評(píng)分改善；通過(guò)免疫組化及RT-PCR法觀察，脊髓康組和激素組都能抑制GFAP表達(dá)，控制膠質(zhì)瘢痕形成，減輕脊髓損傷后繼發(fā)性損傷。