張麗，楊志波

(1.湖南中醫(yī)藥大學研究生院，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院皮膚科，湖南 長沙 410005)

特應性皮炎(Atopic Dermatitis，AD)是臨床上常見的一種皮膚屏障破壞，免疫功能失調的疾病[1]，據研究表明AD在發(fā)達國家兒童的發(fā)病率達到15%～30%[2]，發(fā)展中國家的患病率也在逐年上升，常好發(fā)于嬰幼兒時期。目前有許多治療特應性皮炎的方法，包括支持性護理、外用皮質激素、口服具有鎮(zhèn)靜止癢作用的抗組胺藥物、光療、系統治療等，但缺少一種理想的治療方法。中醫(yī)藥因其簡、便、廉、效的優(yōu)點，逐漸被臨床醫(yī)生廣泛應用。其中出自《丹溪心法》的玉屏風散，雖僅由黃芪、白術、防風三味藥組成，但在臨床上治療蕁麻疹、濕疹、帶狀皰疹等皮膚疾病療效佳。周光澤等[3]研究表明玉屏風顆粒聯合鹽酸西替利嗪治療AD較單一使用抗組胺藥的有效率更高，治療4周后患者皮損SCORED評分、瘙癢程度評分以及影響睡眠程度積分明顯降低。李雪嬌[4]應用皮下注射塵螨浸液聯合維生素E外用保濕、口服氯雷他定以及玉屏風散顆粒進行臨床試驗研究，發(fā)現特異性免疫治療聯合玉屏風顆粒可顯著降低AD的復發(fā)率。研究發(fā)現玉屏風散之所以對過敏性疾病療效較好，可能與其具有調節(jié)免疫的功能相關。劉文杰等[5]發(fā)現玉屏風散治療脾虛濕蘊的AD患者可有效提高患者的細胞免疫功能，治療后測得患者血清CD4+、CD4+/CD8+比例較治療前降低，CD8+數值顯著增加。而特應性皮炎與免疫失衡及遺傳易感性關系密切，因此我們推測玉屏風散有可治療特應性皮炎的潛在作用靶點與機制。本文擬通過網絡藥理學的方式，探討玉屏風散治療特應性皮炎的作用機制，為實驗及臨床提供一定的依據。

1 方法

1.1 篩選玉屏風散的化學成分及靶點

在中藥系統藥理學數據庫分析平臺[6](Traditional Chinese Medicine Pharmacology,TCMSP)中篩選玉屏風散(黃芪、白術、防風)的化學成分和相關靶點，篩選條件為生物利用度(Oral bioavailability，OB)>30和類藥性(Drug likeness，DL)>0.18篩選出符合以上條件的有效化學成分以及相關靶點。利用Uniprot數據庫和美國國家技術信息中心數據庫(NCBI)限定物種為“Homo Sapiens”，將之前檢索的相關靶點轉換成相對應的基因，得到靶點基因名稱。

1.2 獲取AD的相關靶點

在GeneCards數據庫(http://www.genecards.org/)中以“atopic dermatitis”為檢索詞搜索相關靶點。

1.3 構建PPI網絡

在STRING數據庫(http://string-db.org/)中輸入篩選出的中藥作用于AD的靶點名，限定物種為“Homo Sapiens”，設置最低相互作用評分為中等置信度(“high confidence(0.700)”)，得到玉屏風散作用于AD的PPI網絡(靶蛋白相互作用網絡)。

1.4 篩選關鍵靶點

將STRING數據庫中得到的PPI網絡導入Cytoscape 3.7.1，使用“Network Analyzer”對PPI網絡進行拓撲分析，選取自由度(Degree)、介數(Betweenness)、中心性(Closeness)大于平均值的靶點為關鍵靶點，進一步分析其藥理作用。

1.5 GO功能分析

在cytoscaope軟件中使用插件cluego，選擇Functional Analysis，限定物種為“Homo Sapiens”，選擇Celluar component、Biological process、Molecular function，設定僅顯示P-Value值<0.05。

1.6 KEGG通路富集分析

在DAVID 6.8數據庫(https://david.ncifcrf.gov/)導入玉屏風散與AD的交集基因，輸入靶基因名稱，限定物種為“Homo Sapiens”，將靶基因名修正為官方名稱，進行KEGG通路富集分析，在統計計算R項目運行clusterProfiler代碼[7]，得到KEGG富集結果。

2 結果

2.1 玉屏風散化合物和靶點的篩選

在TCMSP中分別輸入黃芪、白術、防風，限定OB>30，DL>0.18的條件后，得到化合物共46個，具體見表1，逐一在uniprot對應后得到305個靶點。

2.2 AD的相關靶點

從GeneCards數據庫中檢索到1 210個相關靶點基因。

2.3 網絡構建及分析結果

將305個化合物靶點與1 210個AD相關靶點基因進行映射，得到47個共同靶點基因，對應玉屏風散中24個候選化合物。其中黃芪對應12個，防風11個，白術1個，見表1。

2.4 PPI網絡構建

將映射的得到的47個交集靶點導入STRING數據庫進行PPI網絡分析(圖1)。網絡中發(fā)生蛋白相互作用的靶點有47個(2個靶點未發(fā)生蛋白相互作用)，見圖1。在cytoscape上進行拓撲后，得出PPI網絡中各節(jié)點的平均自由度為15.617，平均介數為0.016，平均中心度數0.589，自由度、介數、中心度超過平均值的有16個，具體見表2。推測這些靶點是玉屏風散治療AD的關鍵靶點。

表1 玉屏風散中篩選后化合物成分

圖1 玉屏風散治療AD靶蛋白PPI網絡圖

2.5 GO功能分析

47個藥物-疾病交集基因影響了240個生物學過程(P<0.01)，選取P值排名前20的功能信息，見表3。結果顯示玉屏風散活性成分主要富集在氧化還原過程，信號轉導，RNA聚合酶II啟動子的轉錄，細胞對乙醇、營養(yǎng)、脂多糖的反應，細胞增殖，細胞對氨基酸、雌二醇、藥物、寒冷的反應等。在分子功能方面，牽涉到蛋白質結合、酶結合、轉錄因子結合、泛素蛋白連接酶結合、蛋白質異二聚化活性、蛋白激酶結合、氧化還原酶核心、DNA結合、氧結合等。在細胞組成方面，主要存在細胞質、細胞膜、質膜、線粒體、細胞外空間、核質、細胞外外泌體、細胞質的核周區(qū)域等。

表2 玉屏風散關鍵靶點的基本信息

2.6 KEGG富集通路分析結果

通過David數據庫中的KEGG通路富集分析發(fā)現，該47個靶點顯著富集在113調通路上(P<0.05)，其中前20條主要通路包括，AGE-RAGE信號通路、流體剪切應力和動脈粥樣硬化、TNF信號通路、前列腺癌、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染、麻疹、HIF-1信號通路、人巨細胞病毒感染、IL-17信號通路、Toll樣受體、細胞凋亡、催乳素信號通路、癌癥中的蛋白多糖、乙型肝炎、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥、PI3K-Akt信號通路、結直腸癌、MAPK信號通路、松弛素信號通路、內分泌抵抗、EB病毒感染。具體見表4。

3 討論

AD是一種的慢性炎癥性皮膚病。本病主要以長期的皮膚瘙癢、紅斑伴有苔癬樣變?yōu)樘卣?。由于長期的瘙癢嚴重影響患者的生活及睡眠質量，Kaaz K等評估了10名AD及銀屑病患者后發(fā)現AD患者的PSQI總分為(8.3±4.2)分，銀屑病患者的PSQI總分(8.1±4.8)分，AD患者的瘙癢程度較銀屑病患者更重[8]。目前對AD并無可取得滿意療效特殊治療的方法。而中藥具有多成分、多靶點的特點，其作用機制也更為復雜。本研究中主要借助網絡藥理學方法以及各大數據庫，探討了玉屏風散對AD的作用機制的預測研究。結果表明，玉屏風散和AD的交集基因共47個。差異基因富集的生物學功能、途徑以及細胞定位主要涉及蛋白質結合、酶結合、轉錄因子結合、蛋白質異二聚化活性、氧化還原酶活性、蛋白復合物的集合、蛋白磷酸酶結合等分子功能。主要參與的生物過程有氧化還原過程、Fc-epsilon受體信號穿襖途徑、信號轉導、異生素代謝過程、對脂多糖、氨基酸以及雌二醇和藥物的反應、細胞增殖、凋亡過程的負調節(jié)、脂質代謝過程等。

表3 藥物-疾病交集基因的GO富集功能信息

表4 藥物-疾病交集基因的KEGG富集功能信息

KEGG富集通路分析表明20條通路與AD發(fā)病顯著相關，目前研究較為豐富的主要是腫瘤壞死因子(TNF)信號通路、IL-17信號通路、磷酸肌醇3激酶(PI3k-Akt)信號通路以及TH17細胞的分化、Toll樣受體(Toll like receptors,TLRs)信號通路。近期研究表明，AD的發(fā)病與遺傳、皮膚屏障功能受損、免疫的失衡以及微生物的定植關系密切，其中免疫反應失常有至關重要的作用。Th17細胞作為CD4+T細胞亞群可以分泌白介素-17、IL-17F、IL-21等細胞因子[9]，IL-17F、IL-21被證明在自身免疫和組織炎癥中具有關鍵作用。這些細胞因子可以促進細胞存活和增殖，從而促進包括皮膚組織再生[10]。IL-17，是在AD患者發(fā)炎部位常見的高水平細胞因子，在皮膚疾病當中可以誘導黏附分子和趨化因子的表達，支持細胞滲透到皮膚，從而加重炎癥反應和組織破壞[11]。任小麗等[12]運用ELISA測定輕中度AD患者外周血TH17細胞比例、IL-17以及IL-17F時發(fā)現病情重的患者外周血TH17細胞比例較輕中度患者水平高，提示IL-17與TH17細胞在AD的發(fā)病中有重要影響。TNF-α是關鍵的促炎因子，參與細胞運動、細胞周期以及細胞凋亡等各個階段，與角質形成細胞分泌的因子構成促進炎癥的細胞因子網絡，調控以AD為代表的炎癥性皮膚病的發(fā)生[13]。PI3k/Akt信號通路是由膜受體酪氨酸酶激活啟動的，參與多種生物學過程，調控細胞凋亡、免疫T細胞的增殖與活化，常在不同癌癥中異常激活[14]，魏明等[15]對38例AD患者進行T細胞PI3k和Akt活性的監(jiān)測，試驗組新鮮分離出的外周T細胞PI3k和Akt的活性明顯高于對照組，提示AD患者外周血T細胞存在PI3k/Akt活化異常，患者的外周血中存在激活該通路的細胞因子。TLRs信號通路是人類模式識別受體家族中最具特征性的成員，可識別檢測多種病原體相關的分子模式[16]，可激活相關信號通路，激發(fā)免疫細胞發(fā)生免疫反應，誘導皮膚炎癥，樹突狀細胞的成熟，以及通過激活Th1或Th17細胞來發(fā)展抗菌防御。TLR-2和TLR-4信號中的缺陷可能促進Th2反應，從而導致AD發(fā)展。Antiga E等[17]研究發(fā)現經過他克莫司或氫化可的松治療的AD患者，TLR-1高表達，TLR-2低表達。AD患者外周血可發(fā)生TLRs的表達異常。TLRs基因多態(tài)性與AD的發(fā)病與病情的發(fā)展存在相關關系[18]。

玉屏風散是傳統醫(yī)學中的經典方劑，由黃芪、防風、白術、甘草四味藥物組成，是補氣固表的代表方劑。現代研究表明玉屏風散中以芒柄花素[19]、升麻素苷、毛蕊異黃酮苷、升麻素、補骨脂素等成分為主[20]，有抗菌、調節(jié)免疫以及抗感染的作用，現廣泛運用于治療過敏性疾病以及呼吸系統疾病。劉文杰[21]研究發(fā)現玉屏風散治療嬰兒期AD患者效果顯著。姚露等[22]通過研究玉屏風散的主要有效成分對小鼠AD模型中的炎癥小體的表達，發(fā)現芒柄花素可有效抑制MC903誘導的AD小鼠模型中NLRP3和IL-33的表達，從而對玉屏風散對治療AD的細胞分子學以及信號通路進行了初步的實驗探討。本研究則通過網絡藥理學的研究方式，對中醫(yī)經典方劑玉屏風散治療AD進行了作用機制的預測，以及從細胞分子層面初步分析了玉屏風散治療AD的依據。接下來會依據此研究行進一步臨床及細胞實驗研究，研究玉屏風散治療AD的多通路以及多靶點的機制，爭取對臨床使用玉屏風散治療AD提供明確的科學依據。