張良，何秀麗，鄭南，井宏穎，韓玉生*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；3.哈爾濱體育學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150008)

2型糖尿病所引起的胰導(dǎo)素抵抗(IR)使機(jī)體對(duì)胰島素的敏感性降低，臨床上改善胰島素抵抗的口服藥如二甲雙胍、羅格列酮和吡格列酮等存在各種副作用，不利于病人長(zhǎng)期服[1-2]。臨床與實(shí)驗(yàn)研究表明中藥御唐丸可有效降糖、降脂，改善 2 型糖尿病患者的胰島素抵抗，對(duì)糖尿病模型大鼠糖脂代謝具有明顯的改善作用[3-6]。本文研究御唐丸對(duì)糖尿病大鼠肝臟組織中 PI3Kp85和AKT2 蛋白和基因表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討其降糖的分子機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)Wistar大鼠80只，雄性，體質(zhì)量(200±20)g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)SCXK(黑)2013-0004。自由飲食，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物及試劑

御唐丸由西洋參、山藥、龜板、鹿茸、玉竹、葛根、烏梅、黃芪、麥冬、山萸肉、女貞子、白芍等組成，由黑龍江省中西醫(yī)結(jié)合研究所制劑室生產(chǎn)；二甲雙胍(北京京豐制藥，批號(hào)：H11021518)；高糖高脂飼料由25%膽固醇、5%蛋黃粉、10%豬油、20%蔗糖、62.5%基礎(chǔ)飼料等組成；鏈脲佐菌素(STZ),美國(guó)Sigma；胰島素ELISA檢測(cè)試劑盒、兔抗PI3Kp85和AKT2多克隆抗體，武漢博士德;PCR引物及抽提試劑等均由大連寶生物提供。

1.3 儀器

2135型組織切片機(jī)，德國(guó)菜卡；Moticam3000顯微攝影成像系統(tǒng)，美國(guó)Motic； DNM-9602型酶標(biāo)儀，北京普朗新技術(shù)有限公司；熒光定量PCR，美國(guó)ABI。

2 方法

2.1 模型制備及分組給藥

實(shí)驗(yàn)前檢測(cè)大鼠全血血糖，剔除血糖異常者，再隨機(jī)分為正常組(10只)和高糖高脂喂養(yǎng)組(60只)，分別予以普通飼料和高糖高脂飼料喂養(yǎng)8周。高糖高脂組大鼠禁食禁水12 h后，按30 mg/kg一次性腹腔注射1%STZ溶液，連續(xù)觀察3 d。篩選空腹血糖≥16.7 mmol/L者為模型制備成功。將造模成功大鼠再隨機(jī)分為模型組、二甲雙胍組，御唐丸低、中、高劑量組，繼續(xù)喂以高脂飼料。二甲雙胍組灌胃給予濃度為0.2 g/kg的二甲雙胍混懸液；御唐丸低、中、高劑量組分別灌胃給予濃度為 0.675、1.35、2.70 g/kg的御唐丸混懸液；正常組和模型組灌胃給予等體積的生理鹽水。干預(yù)4周后處死大鼠，留取血清及肝臟組織。

2.2 指標(biāo)檢測(cè)

2.2.1 大鼠空腹血糖(FBG)測(cè)定

大鼠尾尖取血，采用微量血糖測(cè)定儀進(jìn)行檢測(cè)，分別于造模前、造模后和治療后進(jìn)行監(jiān)測(cè)大鼠FBG變化。

2.2.2 大鼠空腹血清胰島素(FINS)測(cè)定

各組大鼠在末次給藥后禁食禁水12 h，取血分離血清，嚴(yán)格按ELISA試劑盒說(shuō)明書操作。

2.2.3 胰島素敏感系數(shù)(ISI)的測(cè)定

根據(jù)公式對(duì)各組大鼠ISI進(jìn)行分析[7]，ISI=Ln[1/(FINS×FBG)]，即FBG與FINS乘積倒數(shù)的自然對(duì)數(shù)。

2.2.4 免疫組化法檢測(cè)肝臟PI3Kp85a、AKT2蛋白表達(dá)

肝臟組織經(jīng)常規(guī)石蠟包埋后切片，PV二步法檢測(cè)PI3Kp85a、AKT2蛋白表達(dá)。Moticam3000顯微攝影成像系統(tǒng)在400倍視野下攝影，每組每例隨機(jī)選取3不同視野，采用Motic image 3.2圖像分析軟件進(jìn)行分析，以平均灰度值代表蛋白含量的多少。

2.2.5 RT-PCR法檢測(cè)PI3Kp85a、AKT2mRNA表達(dá)

液氮凍存的肝組織經(jīng)研磨后，提取總RNA，采用RT-PCR法檢測(cè)PI3Kp85a、AKT2mRNA表達(dá)。見(jiàn)表1。

表1 引物序列表

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 對(duì)大鼠空腹血糖(FBG)的影響

造模后各大鼠FBG顯著升高，與空白組相比較，有顯著性差異(P<0.01)；治療后各治療組FBG均有不同程度的降低，與模型組相比較，有顯著性差異(P<0.01)，其中以御唐丸高劑量組降低最為明顯。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠FBG比較

3.2 對(duì)大鼠空腹血清胰島素(FINS)的影

與空白組相比較，模型組FINS水平明顯降低，有顯著性差異(P<0.01)；各治療大鼠FINS均有不同程度的升高，與模型組相比較，有顯著性差異(P<0.01)其中以御唐丸高劑量組升高最為明顯。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠FINS比較

3.3 對(duì)大鼠胰島素敏感系數(shù)(ISI)的影響

模型組大鼠胰島素敏感系數(shù)明顯降低，與空白組相比較，有顯著性差異(P<0.01)；各治療大鼠胰島素敏感系數(shù)均有不同程度的升高，與模型組相比較，有顯著性差異(P<0.01)其中以御唐丸高劑量組升高最為明顯。見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠ISI比較

3.4 對(duì)大鼠肝臟PI3Kp85a、AKT2蛋白表達(dá)的影響

免疫組化結(jié)果顯示，PI3Kp85a、AKT2蛋白主要表達(dá)在肝細(xì)胞胞質(zhì)中，陽(yáng)性表達(dá)呈黃色或棕黃色顆粒狀。模型組大鼠肝組織中PI3Kp85a、AKT2蛋白相對(duì)含量明顯減少，與空白組相比較，有顯著性差異(P<0.01)；各治療大鼠肝組織中PI3Kp85a、AKT2蛋白相對(duì)含量均有不同程度的增加，與模型組相比較，有顯著性差異(P<0.05或0.01)其中以御唐丸高劑量組升高最為明顯。見(jiàn)表5。

表5 PI3Kp85a、AKT2免疫組織化學(xué)染色平均灰度值比較

3.5 對(duì)大鼠PI3Kp85a、AKT2mRNA表達(dá)的影響

RT-PCR結(jié)果顯示，模型組大鼠肝組織中PI3Kp85a、AKT2mRNA表達(dá)明顯減少，與空白組相比較，有顯著性差異(P<0.01)；各治療大鼠肝組織中PI3Kp85a、AKT2mRNA表達(dá)量均有不同程度的增加，與模型組相比較，有顯著性差異(P<0.01)其中以御唐丸高劑量組升高最為明顯。見(jiàn)表5。

表5 治療后各組大鼠PI3Kp85amRNA、AKT2mRNA表達(dá)

4 討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，糖尿病及其并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的病理基礎(chǔ)是機(jī)體內(nèi)糖脂代謝障礙[8-9]，不良的飲食習(xí)慣和生活方式是誘發(fā)糖尿病發(fā)病率逐年上升的重要原因，由于過(guò)量攝入高糖高脂食物，使機(jī)體脂質(zhì)代謝紊亂，導(dǎo)致胰島抵抗(IR)的發(fā)生[10]。IR是指機(jī)體中胰島素的生理效應(yīng)降低，或各種原因引起的組織對(duì)胰島素反應(yīng)能力下降。本實(shí)驗(yàn)采用高糖高脂飼料結(jié)合STZ誘導(dǎo)大鼠糖尿病模型，模擬人類2型糖尿病IR的病理過(guò)程，結(jié)果顯示FBG水平明顯升高，F(xiàn)INS水平明顯降低，胰島素敏感系數(shù)明顯降低，表明此方法制備的大鼠2型糖尿病模型產(chǎn)生了明顯的胰島素抵抗。經(jīng)御唐丸治療后，F(xiàn)BG水平有不同程度的降低，F(xiàn)INS水平也有不同程度的升高，胰島素敏感系數(shù)明為增強(qiáng)，表明御唐丸對(duì)胰島素抵抗具有顯著的改善作用。

胰島素必須與相應(yīng)的受體結(jié)合后，激活相關(guān)的級(jí)聯(lián)酶促反應(yīng)，產(chǎn)生一系列的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，才能最終發(fā)揮其生理效應(yīng)[11]，其中PI3K/AKT信號(hào)途徑是調(diào)控胰島素水平的主要信號(hào)通路之一。正常情況下，胰島素與其受體結(jié)合后，活化酪氨酸激酶產(chǎn)生自磷酸化，進(jìn)而促進(jìn)SH2與PI3Kp85結(jié)合并活化PI3K ，經(jīng)過(guò)一系列催化過(guò)程激活A(yù)KT，激活的 AKT使下游的GSK-3β磷酸化，肝臟中肝糖原的合成增加，維持機(jī)體血糖的正常水平[12-13]。糖尿病時(shí)胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，胰島素水平或者效能不足，GSK -3β磷酸化減少，使肝糖原含量下降，導(dǎo)致體內(nèi)血糖水平升高[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠肝組織中PI3Kp85、AKT2蛋白和基因表達(dá)量均顯著下調(diào)，御唐丸低、中、高劑量組大鼠肝組織中PI3Kp85、AKT2蛋白和基因表達(dá)量均有不同程度的上調(diào)。提示御唐丸可以通過(guò)激活 PI3K/Akt 信號(hào)通路，改善糖尿病大鼠胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)，進(jìn)而發(fā)揮治療糖尿病的作用。