徐昌武，邱立強(qiáng)，夏 豪，江 洪

心腦血管疾病是全世界因疾病造成死亡的主要原因，嚴(yán)重威脅人類生命健康[1]。動脈粥樣硬化是冠心病和腦卒中等多種心腦血管疾病的病理基礎(chǔ)，而血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)增殖在動脈粥樣硬化和血管狹窄中起著決定性的作用[2]。p300/CBP相關(guān)因子(PCAF)是一種轉(zhuǎn)錄輔激活子，具有組蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶活性，最新研究顯示PCAF在腫瘤發(fā)生、增殖和侵襲、細(xì)胞周期調(diào)控、凋亡以及基因轉(zhuǎn)錄、DNA損傷后修復(fù)等細(xì)胞生命過程中發(fā)揮著重要作用[3-5]。但其在VSMCs中是否具有類似促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用卻鮮有報道。為此，本研究通過構(gòu)建病毒以下調(diào)PCAF的表達(dá)，觀察其對大鼠胸主動脈平滑肌細(xì)胞增殖的作用以及對相關(guān)信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 SD雄性大鼠(120～150 g)購自湖北省實(shí)驗(yàn)動物研究中心。DMEM/F12培養(yǎng)基及1×磷酸緩沖鹽溶液(PBS)，成分包括137 mmol/L氯化鈉、2.7 nmol/L氯化鉀和10 mmol/L PBS，pH 7.3～7.5，均購自美國HyClone公司；胎牛血清(FBS)購自杭州四季青公司；Ad-GFP、Ad-PCAF RNAi(含GFP)重組腺病毒購自上海吉凱基因有限公司；CCK-8細(xì)胞毒性及增殖檢測試劑盒(CCK-8)購自日本株式會社同仁化學(xué)研究所；4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、BCA蛋白濃度測定試劑盒、VSMCs表型標(biāo)志蛋白(α-SM-actin)抗體及甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體均購自碧云天生物技術(shù)研究所；絲裂原活化蛋白激酶p38(p38 MAPK)、磷酸化絲裂原活化蛋白激酶p38(p-p38 MAPK)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(AKT)、磷酸化絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(p-AKT)一抗均購自美國CST公司；羊抗兔熒光二抗購自美國LI-COR 公司；聚偏氟乙烯(PVDF)膜購自美國merck-millipore公司；脫脂奶粉購自武漢谷歌生物科技有限公司；Trizol購自南京AIDLAB公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠胸主動脈平滑肌細(xì)胞的分離培養(yǎng)和鑒定 參照文獻(xiàn)[6]，采用組織塊貼壁法培養(yǎng)大鼠胸主動脈VSMCs，用大鼠α-SM-actin抗體進(jìn)行免疫熒光染色鑒定VSMCs。結(jié)果顯示，α-SM-actin陽性顯色率達(dá)到95%以上。第3代～第5代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 病毒轉(zhuǎn)染 將VSMCs以2×105個/孔種植于六孔板中，待細(xì)胞生長覆蓋至孔底壁約60%左右時，棄去培養(yǎng)液，然后用PBS清洗細(xì)胞3次，按照感染復(fù)數(shù)(MOI)為50加入病毒，進(jìn)行轉(zhuǎn)染細(xì)胞4 h，然后棄去含有病毒的培養(yǎng)液，并加入含10%FBS的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組 對照組(A組)、對照組+1 μg/mL 脂多糖(LPS)刺激組(B組)、Ad-GFP腺病毒轉(zhuǎn)染組(C組)、Ad-GFP腺病毒轉(zhuǎn)染+1 μg/mL脂多糖刺激組(D組)、Ad-PCAF RNAi腺病毒轉(zhuǎn)染組(E組)、Ad-PCAF RNAi腺病毒轉(zhuǎn)染+1 μg/mL 脂多糖刺激組(F組)。

1.2.4 CCK-8實(shí)驗(yàn)確定脂多糖使用濃度和檢測細(xì)胞增殖 ①脂多糖使用濃度的確定：將細(xì)胞以2.0×104個/孔的密度接種在96孔板中。待細(xì)胞融合至60%時，換無血清培養(yǎng)液饑餓處理24 h，再與不同劑量(0 μg/mL、0.01 μg/mL、0.1 μg/mL、1 μg/mL、10 μg/mL和50 μg/mL)的脂多糖共同孵育24 h，然后向每孔加入10 μL CCK-8試劑(使CCK-8試劑含量為10%)繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，在酶標(biāo)儀上(450 nm)測各孔的光密度(OD)值。每組設(shè)6個復(fù)孔。②細(xì)胞增殖檢測：將各組細(xì)胞按2.0×104個/孔分別接種于96孔板中，待細(xì)胞融合至50%～60%，換無血清培養(yǎng)液饑餓處理24 h后，將培養(yǎng)液更換為含1% FBS的培養(yǎng)液或含1% FBS+1 μg/mL脂多糖的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后每孔加入10 μL CCK-8試劑繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，在酶標(biāo)儀上(450 nm)測各孔的OD值。每組設(shè)6個復(fù)孔。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期 將細(xì)胞以2×105個/孔接種于6 cm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞融合至60%左右時，饑餓處理24 h。后將各組培養(yǎng)液更換為含1% FBS的培養(yǎng)液或含1% FBS+1 μg/mL 脂多糖的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。接著用胰酶將細(xì)胞消化下來并離心，用PBS洗滌2次后加入預(yù)冷的70%乙醇固定細(xì)胞并4 ℃過夜。取出細(xì)胞離心并用PBS洗滌細(xì)胞2次，然后加入0.4 mL 碘化丙啶(PI)稀釋液(含50 mg/L的PI和100 mg/L的RNase A)室溫避光孵育30 min，然后使用流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson，美國)檢測各組細(xì)胞周期分布情況，并計算出各組細(xì)胞處于G1期、S期、G2期的比例[7]。

1.2.6 實(shí)時熒光定量PCR(Q-PCR)檢測PCAF mRNA表達(dá) 采用Trizol提取細(xì)胞總RNA。用AMV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega公司)進(jìn)行cDNA合成和擴(kuò)增。相關(guān)基因的引物序列見表1。Q-PCR法檢測PCAF基因mRNA表達(dá)。

表1 Q-PCR檢測基因及引物序列

1.2.7 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測蛋白表達(dá) 蛋白抽提后，使用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定其蛋白濃度，然后加入上樣緩沖液煮沸后備用。按每孔30 μg總蛋白于預(yù)先配制好的10%聚丙烯酰胺凝膠上電泳進(jìn)行蛋白分離。然后電轉(zhuǎn)至預(yù)先活化好的聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。電轉(zhuǎn)完成后用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。PBST(1×PBS含0.1%吐溫-20)洗滌3次×5 min后，分別與兔抗大鼠α-SM-actin、p38 MAPK、p-p38 MAPK、AKT、p-AKT、GAPDH一抗4 ℃孵育過夜。取出PVDF膜用PBST洗滌3次×5 min，再與熒光標(biāo)記羊抗兔二抗室溫孵育1 h。取出PVDF膜，在避光環(huán)境下用PBST洗滌3次×5 min后使用Odyssey雙色近紅外激光成像系統(tǒng)(Li-Cor Biosciences，美國)采集蛋白條帶圖像，測定灰度值通過校準(zhǔn)GAPDH作為內(nèi)參進(jìn)行半定量分析。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠胸主動脈平滑肌細(xì)胞及病毒轉(zhuǎn)染效率的鑒定 VSMCs特異性的α-肌動蛋白進(jìn)行免疫熒光染色結(jié)果顯示，α-SM-actin陽性顯色率達(dá)到95%以上(見圖1A)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染病毒24 h后在熒光顯微鏡下拍得照片，轉(zhuǎn)染效率達(dá)90%以上(見圖1B)。符合實(shí)驗(yàn)要求。

圖1 大鼠VSMCs及Ad-PCAF RNAi重組腺病毒轉(zhuǎn)染VSMCs效率的鑒定

2.2 脂多糖最佳使用濃度的確定 當(dāng)脂多糖使用濃度為1 μg/mL時VSMCs增殖能力明顯提高，但隨著脂多糖濃度的進(jìn)一步增加其增殖能力增速減慢，故在本實(shí)驗(yàn)中選擇脂多糖濃度為1 μg/mL。詳見圖2。

與對照組比較，*P<0.05，△P<0.01。

2.3 各組PCAF mRNA表達(dá)及VSMCs增殖活性比較 與A組比較，C組PCAF mRNA水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與C組比較，E組PCAF mRNA水平降低約87.8%(P<0.05)，VSMCs增殖活性明顯降低(P<0.05)。與B組比較，D組PCAF mRNA水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與D組比較，F(xiàn)組PCAF mRNA水平明顯下降近82.1%(P<0.05)，VSMCs增殖活性明顯降低(P<0.05)。另外，B組較A組、D組較C組、F組較E組，PCAF mRNA水平分別增加0.63倍、0.67倍和1.45倍，與此同時，VSMCs增殖活性分別提高11.5%、14.7%和10.5%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組PCAF mRNA表達(dá)及VSMCs增殖活性比較(±s)

2.4 下調(diào)PCAF表達(dá)對VSMCs細(xì)胞周期的影響 與A組比較，C組細(xì)胞周期分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與C組比較，D組細(xì)胞經(jīng)脂多糖刺激后S期(藍(lán)色斜線區(qū)域)細(xì)胞明顯減少，而G2期(黃色區(qū)域)細(xì)胞占比明顯增多(P<0.05)，提示脂多糖刺激后細(xì)胞由S期(藍(lán)色斜線區(qū)域)進(jìn)入G2期(黃色區(qū)域)，細(xì)胞周期進(jìn)展加快，細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)。然而與D組比較，F(xiàn)組下調(diào)PCAF后，S期(藍(lán)色斜線區(qū)域)細(xì)胞明顯增多，G2期(黃色區(qū)域)細(xì)胞占比明顯減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，細(xì)胞周期S期到G2期阻滯，細(xì)胞增殖能力減弱。詳見圖3。

與C組比較，*P<0.05，△P<0.01；與D組比較，#P<0.05。

2.5 下調(diào)PCAF抑制p-p38 MAPK及p-AKT表達(dá) 與A組比較，C組p-p38 MAPK及p-AKT表達(dá)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與C組比較，E組細(xì)胞中p-p38 MAPK及p-AKT表達(dá)明顯降低(P<0.05)；與D組比較，F(xiàn)組p-p38 MAPK及p-AKT表達(dá)明顯降低(P<0.05)；B組較A組、D組較C組、F組較E組，細(xì)胞中p-p38 MAPK及p-AKT表達(dá)升高(P<0.05)；另外，6組總的p38 MAPK和AKT表達(dá)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見圖4。

與D組比較，*P<0.05，△ P<0.01；與E組比較，#P<0.05。圖4 Western Blot分析各組蛋白表達(dá)情況

3 討 論

VSMCs的過度增殖在血管成型術(shù)后再狹窄及動脈粥樣硬化的病理過程中起關(guān)鍵作用。血管損傷時，損傷血管周圍內(nèi)皮細(xì)胞及炎性細(xì)胞等分泌細(xì)胞因子和生長因子等介質(zhì)，引起損傷部位的VSMCs由靜止的“收縮型”向活躍的“合成型”轉(zhuǎn)變，導(dǎo)致VSMCs從中膜向內(nèi)膜大量增殖和遷移，同時合成細(xì)胞外基質(zhì)參與血管修復(fù)，從而形成新生內(nèi)膜過度增生[8]。因此，有效抑制血管損傷后平滑肌細(xì)胞的過度增殖，在抗血管再狹窄和抗動脈粥樣硬化治療中具有重要意義。

PCAF即p300/CBP 相關(guān)因子，它是一種轉(zhuǎn)錄輔激活因子且具有組蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶活性，可通過乙?；M蛋白和非組蛋白的方式參與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，與細(xì)胞分化、凋亡、腫瘤發(fā)生等密切相關(guān)[9]。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)PCAF在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和遷移中具有重要作用，而關(guān)于PCAF在血管增生相關(guān)疾病中的研究較少。最新實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠股動脈損傷模型中，PCAF基因敲除的小鼠損傷部位血管內(nèi)膜增生程度明顯較野生型減輕[10]。這與本研究結(jié)果相符，本研究通過體外培養(yǎng)VSMCs發(fā)現(xiàn)，下調(diào)VSMCs內(nèi)PCAF基因的表達(dá)后，VSMCs增殖能力明顯降低。因此，PCAF作為一種具有組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的轉(zhuǎn)錄輔激活因子，在與VSMCs增生相關(guān)的疾病如血管再狹窄和動脈粥樣硬化的病程中發(fā)揮著重要的作用。

磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)和p38 MAPK途徑是關(guān)鍵的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑，參與多種生理和病理過程，如細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及炎性反應(yīng)[11-14]。在多項(xiàng)關(guān)于VSMCs增殖的研究中發(fā)現(xiàn)，抑制AKT以及p38 MAPK等的磷酸化可以抑制VSMCs增殖[15]。因此，本研究進(jìn)一步檢測了PI3K/AKT和p38 MAPK信號通路的活性，發(fā)現(xiàn)下調(diào)PCAF的表達(dá)后，VSMCs內(nèi)AKT和p38 MAPK的磷酸化水平也隨之降低。這些結(jié)果提示，下調(diào)PCAF表達(dá)所導(dǎo)致的VSMCs增殖能力下降，與抑制AKT和p38 MAPK磷酸化有關(guān)。

總之，本研究結(jié)果表明，PCAF在VSMCs增殖中具有重要的作用。下調(diào)PCAF的表達(dá)，可明顯抑制VSMCs增殖，而發(fā)揮作用的機(jī)制至少部分與下調(diào)PCAF表達(dá)后，VSMCs內(nèi)AKT及p38 MAPK磷酸化受阻有關(guān)。由此推測PCAF可能是較為理想的治療血管成形術(shù)后再狹窄及動脈粥樣硬化的一個潛在靶點(diǎn)。