張 菊， 蘇成文， 亓 鵬， 陳 焱， 孫得發(fā)

（山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院，山東濰坊 261061）

真空冷凍干燥（簡(jiǎn)稱為凍干）是目前制備和保藏微生物的有效方法，凍干是將冷凍技術(shù)和干燥技術(shù)進(jìn)行有機(jī)結(jié)合。微生物在真空冷凍干燥過(guò)程中要經(jīng)受冷凍和干燥兩種激烈因素的影響，損傷是難以避免的。乳酸菌在真空冷凍干燥過(guò)程中，通常會(huì)造成細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變、蛋白質(zhì)變性失活、pH的動(dòng)態(tài)平衡被打破、DNA發(fā)生損傷以及膜脂肪酸組成發(fā)生改變等（張英華等，2006）。影響乳酸菌在凍干后效果的因素有很多，如菌株、菌體的大小及其形狀、菌種的菌齡、初始菌種的濃度、pH、相應(yīng)的保護(hù)劑系統(tǒng)、預(yù)凍的溫度、降溫的速率、冷凍干燥的條件、細(xì)胞的含水量、細(xì)胞膜的成分和復(fù)水的條件等（李華等，2002），若在凍干的過(guò)程中采取一定的保護(hù)措施，加入適宜的有效保護(hù)劑系統(tǒng)，同時(shí)采用適合特定菌株的預(yù)凍溫度和預(yù)凍時(shí)間，可以在最大程度上減輕或有效避免真空冷凍干燥對(duì)細(xì)胞帶來(lái)的損傷。

低聚糖又稱為寡糖，由2～10個(gè)單糖分子通過(guò)糖苷鍵聚合而成的直鏈或支鏈化合物，其包括功能性低聚糖和普通低聚糖。功能性低聚糖一般很難被消化吸收，但是可以被腸道中的微生物發(fā)酵利用。其具有增加胃腸道蠕動(dòng)、提高機(jī)體免疫力、抗病毒、抑制腐敗菌生長(zhǎng)、促進(jìn)有益菌增殖等一系列特殊的生理保健作用。功能性低聚糖作為凍干保護(hù)劑，具有保健和凍干保護(hù)的雙重作用，可以使益生菌維持較高的成活率；當(dāng)機(jī)體食入功能性低聚糖作為益生菌凍干保護(hù)劑的產(chǎn)品后，功能性低聚糖將繼續(xù)發(fā)揮益菌保健、促生長(zhǎng)的作用（王瑩等，2010），功能性低聚糖可以將益菌作用和凍干保護(hù)作用結(jié)合起來(lái)，將在醫(yī)藥、食品和飼料生產(chǎn)中發(fā)揮重要的作用。

本試驗(yàn)選擇目前益菌和促菌生長(zhǎng)效果比較好的功能性低聚糖：低聚木糖、低聚果糖、水蘇糖、低聚異麥芽糖，分別研究其對(duì)植物乳桿菌凍干后的保護(hù)效果，選擇其中一種功能性低聚糖作為凍干保護(hù)劑。再與目前乳酸菌凍干效果比較好的脫脂奶粉、海藻糖和甘油復(fù)配，通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)其濃度進(jìn)行優(yōu)化。同時(shí)對(duì)凍干工藝進(jìn)行初步探索，旨在為植物乳桿菌的凍干保護(hù)研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種和培養(yǎng)基 植物乳桿菌：本實(shí)驗(yàn)室保存的菌種。

培養(yǎng)基：MRS固體和液體培養(yǎng)基。

1.2 原料 低聚木糖、低聚果糖、水蘇糖、低聚異麥芽糖、海藻糖（純度＞99%）和脫脂奶粉為食品級(jí)，甘油為化學(xué)純。以上保護(hù)劑分別用蒸餾水配制成高濃度的貯備液，單獨(dú)滅菌后，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)配制成各種復(fù)合保護(hù)劑。

1.3 儀器與設(shè)備 微生物實(shí)驗(yàn)室常用的儀器設(shè)備為：FDU-1100真空冷凍干燥機(jī)（日本，東京理化），SW-CJ-2F垂直流雙人雙面凈化工作臺(tái) （江蘇，蘇州凈化），DHG-9030A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（西安禾普）和DHP-360數(shù)顯電熱恒溫培養(yǎng)箱（江蘇，金壇市天竟實(shí)驗(yàn)儀器廠），TCYQ DHZ-CA大容量振蕩器（江蘇，太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠），DW-86L578J超低溫冰箱（青島海爾），高速冷凍離心機(jī)（德國(guó) sigma，3-18K）等。

1.4 菌株的培養(yǎng)和懸浮液的制備 植物乳桿菌經(jīng)MRS固體斜面培養(yǎng)基傳代活化恢復(fù)活力后，接入滅菌后的MRS液體培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h左右，以此作為植物乳桿菌的種子液。以1%的量再次接種入滅菌后MRS液體培養(yǎng)基中，使植物乳桿菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期，然后分裝于50 mL無(wú)菌離心管中，置于高速冷凍離心機(jī)（10000 r/min），4 ℃離心 10 min，棄去上清液，將菌泥稱重后按照1：1的比例加入滅菌生理鹽水（0.9%的濃度），用小型快速振蕩器快速混合均勻后，制成植物乳桿菌的菌懸液，取2 mL菌懸液進(jìn)行計(jì)數(shù)（作為凍干前的活菌總數(shù)），再將剩余的菌懸液分裝于無(wú)菌的10 mL凍干管中，每管2 mL菌懸液，按照試驗(yàn)的具體要求加入相應(yīng)的凍干保護(hù)劑。

1.5 冷凍干燥 將上述制備好的菌懸液置于-20℃（或-70℃）的溫度下預(yù)凍，等其完全凍結(jié)后，迅速將凍結(jié)樣品移入真空冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥24～48 h，使凍干后菌粉的含水量達(dá)3%左右，然后測(cè)定凍干后植物乳桿菌的活菌數(shù)。

1.6 菌落總數(shù)測(cè)定 參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.35-2016乳酸菌檢驗(yàn)方法，測(cè)定植物乳桿菌的菌落總數(shù)。存活率計(jì)算公式為：

1.7 凍干保護(hù)劑配方的選擇 首先進(jìn)行功能性低聚糖的單因子試驗(yàn)，挑選對(duì)植物乳桿菌凍干后保護(hù)效果最佳的功能性低聚糖，再選擇脫脂奶粉、海藻糖和甘油，進(jìn)行最優(yōu)復(fù)合保護(hù)劑配方的篩選。通過(guò)設(shè)計(jì)4因素3水平的正交試驗(yàn)L9（34）確定最優(yōu)植物乳桿菌復(fù)合保護(hù)劑配方組合。

1.8 預(yù)凍溫度和預(yù)凍時(shí)間 將上述制備好的菌懸液統(tǒng)一加入上述篩選的最優(yōu)復(fù)合保護(hù)劑后，分別置于-20℃和-70℃的低溫條件下預(yù)凍2、4、6 h，將樣品完全凍結(jié)后取出，然后對(duì)其進(jìn)行真空冷凍干燥，最后進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，計(jì)算出冷凍干燥后植物乳桿菌的存活率。

1.9 菌泥與水混合比例的選擇 植物乳桿菌的菌泥與水的比例分別按 0.25：1、0.50：1、0.75：1、1.00：1、1.25：1進(jìn)行混合，統(tǒng)一加入上述篩選的最優(yōu)復(fù)合保護(hù)劑后轉(zhuǎn)入凍干管中，然后將其進(jìn)行真空冷凍干燥后進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，計(jì)算出冷凍干燥后植物乳桿菌的存活率。

2 結(jié)果與分析

2.1 功能性低聚糖單因子的試驗(yàn)結(jié)果 由表1可知，所選的四種功能性低聚糖均對(duì)乳酸菌凍干有較好的保護(hù)效果，起保護(hù)效果的順序依次為：低聚木糖＞低聚果糖＞水蘇糖＞低聚異麥芽糖。為達(dá)到較好的試驗(yàn)效果，本試驗(yàn)以低聚木糖作為研究對(duì)象，對(duì)乳酸菌凍干保護(hù)劑最佳配方的選擇。

表1 功能性低聚糖單因子的試驗(yàn)結(jié)果

2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化復(fù)合保護(hù)劑 脫脂奶粉是一種凍干效果較好的大分子物質(zhì)，在冷凍干燥時(shí)，奶粉中的乳清蛋白能在菌體外形成蛋白膜保護(hù)層，對(duì)細(xì)胞加以保護(hù)，同時(shí)可固定凍干酶類；奶粉中其他成分也有助于提高菌體的凍干存活率（徐致遠(yuǎn)等，2006）。海藻糖是一種二糖，由兩個(gè)葡萄糖構(gòu)成，具有大量的自由羥基，是具有極強(qiáng)穩(wěn)定性的非還原性雙糖，玻璃化溫度更高，吸濕性更低，在高溫、高寒、高滲透壓及干燥失水等條件下在細(xì)胞表面能形成獨(dú)特的保護(hù)膜，保護(hù)蛋白質(zhì)分子不變性失活（張敬如等，2006）。甘油（又稱丙三醇）是一種多羥基化合物，能滲透到細(xì)胞內(nèi)部。在凍干過(guò)程中可部分取代水分子與菌體細(xì)胞膜磷脂中的磷酸基團(tuán) （或者與菌體蛋白質(zhì)極性基團(tuán)）形成氫鍵，使菌體中的大分子物質(zhì)在缺水狀態(tài)下仍能保持原有的功能結(jié)構(gòu)，維持菌體活力（朱敖蘭等，2007）。

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道和試驗(yàn)結(jié)果（索江華等，2015；張炎等，2015；熊濤等，2011；張英華等，2006）選擇脫脂奶粉、海藻糖、甘油和低聚木糖進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化植物乳桿菌的最佳配方組合，不同比例保護(hù)劑在凍干后對(duì)植物乳桿菌存活率的影響如表2所示。

表2 植物乳桿菌凍干保護(hù)劑篩選

通過(guò)直觀極差分析法可以看出（表2），影響因素依次為 D（低聚木糖）＞A（脫脂奶粉）＞B（海藻糖）＞C（甘油），得出最佳配方組合為：A3B2C2D3，即奶粉20%，海藻糖10%，甘油2%，低聚木糖5%。2.3 最佳配方的試驗(yàn)驗(yàn)證 由于最佳的配方組合未包含在正交試驗(yàn)的9個(gè)試驗(yàn)中，為了進(jìn)一步確定凍干保護(hù)及配方的試驗(yàn)效果，按照最佳組合A3B2C2D3，再次做了三次驗(yàn)證試驗(yàn)，每次試驗(yàn)兩個(gè)重復(fù)，其存活率均為80%左右（表3）。

表3 最佳組合的試驗(yàn)驗(yàn)證

2.4 預(yù)凍溫度和預(yù)凍時(shí)間的確定 試驗(yàn)選擇-20、-70℃，時(shí)間為2、4 h和6 h。預(yù)凍溫度及凍結(jié)時(shí)間對(duì)植物乳桿菌存活率的影響見(jiàn)表4。由表4的結(jié)果可以看出，預(yù)凍溫度對(duì)所研究的植物乳桿菌的影響不大。隨預(yù)凍時(shí)間延長(zhǎng)，植物乳桿菌存活率緩慢上升。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果得出，預(yù)凍的最適宜條件：預(yù)凍時(shí)間6 h，預(yù)凍溫度-70℃。

表4 預(yù)凍溫度和預(yù)凍時(shí)間對(duì)植物乳桿菌存活率的影響

2.5 菌泥與水混合比例的確定 由表5可知，菌泥與水的混合比例對(duì)植物乳桿菌的凍干存活率也有一定影響作用。菌泥太多，水的量太少，加入保護(hù)劑后容易攪拌不均勻，影響真空冷凍干燥后產(chǎn)品的性狀。本試驗(yàn)結(jié)果表明，水的含量越少，凍干后菌體的存活率最高，而且凍干時(shí)間縮短，節(jié)約能耗。但是水的量也不能加入太少，要保證凍干保護(hù)劑、菌泥和水混合均勻，建議水與菌泥最佳比例為0.5：1。

表5 水與菌泥混合比例對(duì)植物乳桿菌存活率的影響

3 討論

功能性低聚糖（或稱寡糖）因其獨(dú)特的生理功能，在營(yíng)養(yǎng)保健、疾病預(yù)防、畜牧生產(chǎn)養(yǎng)殖等方面得到廣泛的應(yīng)用。目前已成功開(kāi)發(fā)的功能性寡糖有低聚果糖（FOS）、低聚木糖（XOS）、低聚異麥芽糖（IMO）、大豆低聚糖（SBOS）、甘露寡糖（MOS）、低聚半乳糖（GOS）、低聚異麥芽酮糖、低聚龍膽糖、低聚殼聚糖和水蘇糖等（閔力等，2012）。功能性低聚糖一般不被人和動(dòng)物腸道所分泌的消化酶消化，但其可以明顯促進(jìn)腸道有益菌的增殖，抑制腸道病原菌的繁殖，從而調(diào)節(jié)腸道微生物菌群的平衡，有益于人和動(dòng)物腸道菌群的健康，最終提高機(jī)體的免疫能力。目前研究發(fā)現(xiàn)功能性低聚糖也會(huì)調(diào)節(jié)動(dòng)物體內(nèi)的脂類代謝和蛋白質(zhì)代謝，同時(shí)增強(qiáng)動(dòng)物對(duì)礦物質(zhì)（如鈣元素）的吸收等多種生理作用（劉紅梅等，2012；朱俊玲等，2003）。功能性低聚糖具有無(wú)毒副作用、無(wú)殘留、無(wú)耐藥性、綠色、安全、環(huán)保和穩(wěn)定性強(qiáng)等特點(diǎn)，對(duì)功能性低聚糖的深入研究和開(kāi)發(fā)應(yīng)用具有廣闊的發(fā)展前景。

目前，關(guān)于功能性低聚糖的益菌作用研究比較廣泛，但是作為益生菌凍干保護(hù)劑的研究還不是很深入，功能性低聚糖含有2～10個(gè)相同或不同的單糖，每個(gè)單糖均含有自由羥基，在凍干過(guò)程中的作用機(jī)理與甘油類似，其羥基可部分取代水分子與菌體細(xì)胞膜磷脂中的磷酸基團(tuán) （或者與菌體蛋白質(zhì)極性基團(tuán)）形成氫鍵，使菌體中的大分子物質(zhì)在缺水狀態(tài)下仍能保持原有的功能結(jié)構(gòu)。Schwab等（2007）發(fā)現(xiàn)，低聚果糖能明顯提高乳酸桿菌TMW1.106在干燥以及存儲(chǔ)過(guò)程中的存活率，推測(cè)低聚果糖可以提高乳酸桿菌細(xì)胞膜的完整性，增加細(xì)胞膜的側(cè)壓力，最終細(xì)胞膜的流動(dòng)性得到提高，導(dǎo)致存活率提高。功能性低聚糖通過(guò)覆蓋在生物分子表面，保持了細(xì)胞表面的溶劑化和天然性質(zhì)，維持在冷凍干燥狀態(tài)下乳酸菌細(xì)胞中水的含量，從而適度保存和避免其不受傷害（Noori等，2017）。

微生物制劑在真空冷凍干燥之前，首先要進(jìn)行預(yù)凍處理。預(yù)凍是將溶液中的自由水進(jìn)行固化，使真空干燥后產(chǎn)品的形態(tài)不發(fā)生變化，防止在真空干燥時(shí)發(fā)生起泡、濃縮、收縮和溶質(zhì)移動(dòng)等不可逆的變化，減少由于溫度下降引起的物質(zhì)可溶性降低以及生命特性發(fā)生變化（王娜等，2011）。純水可以在0℃固化結(jié)晶，但不同物料中的液體是含有不同溶質(zhì)的水溶液，所以導(dǎo)致其凍結(jié)溫度各不相同，將物料中水溶液完全凍結(jié)時(shí)的溫度稱為其共晶溫度。不同物質(zhì)、同一物質(zhì)含水量不同，其共晶溫度也隨之變化。預(yù)凍溫度和預(yù)凍時(shí)間也是影響整個(gè)凍干周期的重要因素，許多觀點(diǎn)認(rèn)為生物體在快速降溫的過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)冰晶的產(chǎn)生是細(xì)胞損傷的主要原因（Shao等，2014）。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，四種低聚糖對(duì)植物乳桿菌的保護(hù)率效果依次為：低聚木糖＞低聚果糖＞水蘇糖＞低聚異麥芽糖，選擇低聚木糖與目前乳酸菌凍干效果比較好的脫脂奶粉、海藻糖和甘油復(fù)配，通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)其濃度進(jìn)行優(yōu)化，得出最佳配方組合為：奶粉20%，海藻糖10%，甘油2%，低聚木糖5%。進(jìn)一步驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，其存活率為80%左右。對(duì)植物乳桿菌凍干工藝的研究發(fā)現(xiàn)，最佳的預(yù)凍溫度和時(shí)間分別是-70℃，6 h；菌泥與水不同比例混合凍干后，隨著水分的增加，植物乳桿菌菌的存活率緩慢下降，建議水與菌泥最佳比列為0.5：1。經(jīng)過(guò)凍干保護(hù)劑和凍干條件的優(yōu)化，植物乳桿菌的存活率達(dá)到80%以上。通過(guò)對(duì)植物乳桿菌的凍干保護(hù)劑和凍干工藝的優(yōu)化，可以為以后植物乳桿菌的凍干研究提供理論參考。