王麗麗苗則彥王 鑫吳海東劉愛群

(1遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，遼寧 沈陽 110161； 2.遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所，遼寧 沈陽110161)

20世紀(jì)80年代，遼寧省義縣開始發(fā)展設(shè)施西葫蘆(CucurbitapepoL.ssp.pepo)生產(chǎn)。至今，日光溫室西葫蘆生產(chǎn)面積達(dá)3 300 hm2，占當(dāng)?shù)卦O(shè)施蔬菜總面積的41.25%，成為遼寧省反季節(jié)西葫蘆栽培主產(chǎn)區(qū)[1]。當(dāng)?shù)匚骱J主栽品種為凱撒，主要以自根苗栽培為主，嫁接栽培技術(shù)應(yīng)用較少。近年來，由于連續(xù)多年的單一茬口重茬種植，當(dāng)?shù)厣a(chǎn)中“死秧”現(xiàn)象普遍發(fā)生，嚴(yán)重地塊發(fā)病率達(dá)75%以上，成為制約義縣西葫蘆產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素。遼寧省有關(guān)專家到發(fā)病區(qū)鑒定，初步認(rèn)為是尖孢鐮刀菌引起的枯萎病或者是茄病鐮刀菌引起的根腐病，但不能確定是哪類菌源。有研究報道遼寧地區(qū)引起嫁接黃瓜“死秧”問題的病原菌為茄病鐮刀菌瓜類?；?Fusariumsolanif.sp.Cucurbitae)，并對該菌致病特征、侵染途徑等做了詳細(xì)報道[2]。該病菌引起的發(fā)病癥狀為在莖基部與土壤相接處呈現(xiàn)水浸狀褐色病斑，局部萎蔫，嚴(yán)重發(fā)病植株并未枯萎而直接倒伏，扒開基質(zhì)可見根莖部發(fā)病較嚴(yán)重，根部受害并不重，發(fā)病癥狀與義縣西葫蘆類似。該病害初步定名為根莖腐病[3]。

有關(guān)茄病鐮刀菌瓜類?；筒≡趪鴥?nèi)報道較少。1932年最早在南非報道引起南瓜根莖腐病，隨后在荷蘭嫁接黃瓜爆發(fā)[4]。最初發(fā)現(xiàn)該病原菌也只在田間侵染南瓜，未在甜瓜、西瓜等瓜類作物發(fā)生。隨著病原菌的發(fā)展，隨后在歐美國家陸續(xù)報道，甚至在西班牙的西瓜、西葫蘆、甜瓜作物均被侵染致病[5～7]。隨著病原菌鑒定技術(shù)不斷更新，鑒定手段從形態(tài)學(xué)鑒定到分子生物學(xué)鑒定，研究者進一步將該專化型真菌劃分為2個生理小種[8]，并做了大量分子生物學(xué)研究[9～10]。目前，真菌測序分析常見方法為ITS序列分析方法，該方法不能準(zhǔn)確判斷出病原菌的種級分類水平。為了更準(zhǔn)確鑒定遼寧義縣地區(qū)的致病菌是否為茄病鐮刀菌瓜類?；?，本研究采用rDNAITS、EF序列分析方法，進行分子生物學(xué)鑒定，并設(shè)計?；万炞C試驗，旨在為生產(chǎn)提供有力理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

2018 年，以遼寧省義縣前窖、龍王廟、頭溝3個地方5個試點感病西葫蘆的植株為試材，進行室內(nèi)培養(yǎng)。

1.2 病原菌的分離鑒定

采用傳統(tǒng)的組織分離法對病樣進行病原物的分離純化。PDA培養(yǎng)基配置： 200 g馬鈴薯切片加適量水煮30 min后過濾，取濾液加15 g葡萄糖，15 g瓊脂，定容至1 L，121 ℃濕熱滅菌20 min待用。培養(yǎng)前在PDA培養(yǎng)基內(nèi)加少量青霉素、鏈霉素，在直徑90 cm培養(yǎng)皿無菌條件培養(yǎng)。將分離得到的菌株在恒溫培養(yǎng)箱中25 ℃條件下培養(yǎng)5 d，挑取尖端菌絲，培養(yǎng)至產(chǎn)生分生孢子，進行單孢純化，并將純化后的菌株保存在PDA培養(yǎng)基上，4 ℃保存。

1.3 Koch's 法則鑒定致病性

根據(jù)Koch's 法則，將分離獲得的單孢菌株回接鑒定致病性。以西葫蘆“萊特”品種為試材，采用32孔穴盤，每個單孢菌株接菌一盤，3次重復(fù)。播種前催芽，待種子剛露白時播種到菌土中。接菌方法參照劉洋(2010)方法。調(diào)查植株發(fā)病情況，選取出現(xiàn)類似癥狀的植株根莖部進行病原菌的再次分離鑒定確定所得單孢菌株是否為田間致病菌。

1.4 ?；丸b定試驗

選擇11種蔬菜作物進行接種鑒定，品種見表1。

表1 蔬菜作物品種及來源

1.5 病原菌測序方法

真菌DNA采用試劑盒[OMEGE Fungal DNA Kit(50)試劑盒 (美國)]方法提取。真菌ITS序列及EF-1α序列分析比較，序列見表2。PCR反應(yīng)體系(20 μl)：DNA 模板2 μl、10×Buffer(含Mg2+)2 μl、Taq polymerase(5 U/μl)0.4 μl，引物(10 μmol /μl)各1 μl，dNTP(10 mmol/ L)4μl，ddH2O 10 μl。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化后委托北京諾賽基因組研究中心有限公司進行測序。將測序結(jié)果在NCBI核算序列數(shù)據(jù)庫中進行BLAST同源性搜索比對，獲得基因登錄號。

表2 ITS和EF引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌鑒定

2.1.1 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定

病原菌形態(tài)學(xué)觀察表明，菌落薄絨狀，氣生菌絲較少，白色至淺灰色；菌落背面中心呈褐色。小型分生孢子數(shù)量多，有大型分生孢子(圖1)。

2.1.2 Koch's 法致病性鑒定

對獲得的109個單孢菌群進行回接鑒定致病性結(jié)果表明，不同來源菌株均可使西葫蘆發(fā)病，發(fā)病率最高達(dá)100%，且發(fā)病植株癥狀與遼寧義縣地區(qū)田間植株發(fā)病癥狀一致，確定分離獲得的109個菌株均為田間致病病原菌。

2.1.3 病原菌的分子生物學(xué)鑒定

利用ITS、EF序列對109個單孢菌株進行測序分析，結(jié)果表明，ITS序列分析結(jié)果為茄病鐮刀菌(Fusariumsolani)，登錄號為MN523142.1，相似度達(dá)99.61%。同時，Nectriahaematococca為鐮刀菌瓜類?；偷挠行詰B(tài)，登錄號為AF178410.1，相似度達(dá)99.40%，在NCBI同源性比對結(jié)果中將其無性態(tài)描述為茄病鐮刀菌瓜類?；?Fusariumsolanif.sp.cucurbitae)。EF序列測序結(jié)果與ITS結(jié)果一致，且能準(zhǔn)確鑒定為茄病鐮刀菌瓜類轉(zhuǎn)化型，登錄號為KF372878.1，相似度為100%(表4)。

2.2 ?；丸b定試驗

選擇登陸號為KF372878.1(茄鐮刀菌瓜類?；?的菌種，對11種蔬菜作物進行接種鑒定。結(jié)果表明，西葫蘆、黃瓜、甜瓜、西瓜、瓠瓜、南瓜、西瓜均不同程度發(fā)病，其中西葫蘆、甜瓜、南瓜發(fā)病最重，達(dá)100%。甜瓜發(fā)病最早，而番茄、辣椒、菜豆、茄子均未發(fā)病(表5)，說明該菌為瓜類作物?；驼婢?。

表3 不同來源菌株的致病性鑒定結(jié)果

表4 病原菌測定基因序列匹配信息

表5 致病性調(diào)查結(jié)果

3 結(jié)論與討論

試驗鑒定結(jié)果表明，引起遼寧義縣西葫蘆“死秧”的病原菌主要為茄病鐮刀菌瓜類?；筒≡?。比較ITS、EF序列分析結(jié)果，EF序列測序可獲得與NCBI中已有序列同源性更高的菌種信息，相似度達(dá)100%。?；万炞C試驗結(jié)果表明，只有瓜類蔬菜作物西葫蘆、黃瓜、甜瓜、西瓜、瓠瓜、南瓜不同程度發(fā)病，非瓜類作物番茄、辣椒、菜豆、茄子均未發(fā)病，進一步證明了鑒定結(jié)果的一致性。

國外早期報道，茄病鐮刀菌瓜類?；桶?個生理小種。生理小種1可以侵染植株的莖基、根及果實，引起莖基、根及果實腐爛；而生理小種2只侵染果實引起果實腐爛。由生理小種1引起的根莖腐病最早在荷蘭小胡瓜有報道[11]，隨后在西班牙葫蘆[12]、西瓜、溫室西葫蘆、甜瓜作物相繼報道。本試驗中日光溫室西葫蘆發(fā)病特征主要是在莖基部，所以，應(yīng)該屬于生理小種1引起的。目前，國內(nèi)還未見報道。

真菌分子生物學(xué)鑒定方法一般采用rDNA-ITS基因序列分析。本試驗采用rDNA-ITS、EF兩種基因的序列分析，鑒定結(jié)果均為茄病鐮刀菌瓜類?；筒≡?，結(jié)果一致。其中，利用ITS序列分析，在NCBI基因庫比對結(jié)果為茄病鐮刀菌的有性態(tài)，其無性態(tài)描述為茄病鐮刀菌瓜類?；汀６鳨F基因序列分析鑒定結(jié)果準(zhǔn)確度更高，獲得的真菌信息更全面，且相似度達(dá)到100%。不同的序列分析方法對不同菌種有著不同的適應(yīng)性。對于建立病原菌種屬關(guān)系，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，單純采用ITS序列分析方法不能準(zhǔn)確判斷出病原菌的種級分類水平，而EF序列分析鑒定結(jié)果可以獲得同源性較高的菌種信息[13]。所以，本試驗采用ITS、EF兩種序列分析，提高鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

對11個蔬菜作物接種鑒定表明，該菌具有?；浴＿@與前人實驗室接種鑒定致病性的結(jié)果一致[2]。人們對茄病鐮刀菌瓜類專化型病原菌的特性、致病特征、侵染途徑及侵染作物等做了詳細(xì)報道，但至今也未篩選出抗病砧木，藥劑篩選也未見報道，生產(chǎn)中亟需建立一套高效病害防控技術(shù)體系，解決由該病原菌引起的土傳病害。