王藝諾 金鋒

[摘要]目的 分析三陰性乳腺癌（TNBC）患者乳腺癌易感基因（BRCA）1/2的基因突變狀態(tài)及其臨床特征。方法 選取2017年4月～2019年4月期間我院收治的55例TNBC患者作為研究對(duì)象，對(duì)所有患者的病理組織切片采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）法和DNA序列測(cè)序法測(cè)定其BRCA1/2基因的突變情況。分析TNBC患者的BRCA1/2基因突變的特點(diǎn)，并根據(jù)是否存在基因突變，將其分為突變組和未突變組，比較分析兩組患者的臨床資料。結(jié)果 55例TNBC患者中共計(jì)檢測(cè)出9例BRCA1/2基因突變，突變總檢出率為16.36%;其中BRCA1基因突變6例，BRCA2基因突變3例。突變組和未突變組患者的年齡、月經(jīng)狀態(tài)、腫瘤大小、病理類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。突變組患者的乳腺癌家族史比例高于未突變組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 TNBC患者BRCA1/2基因突變的發(fā)生率較高，且BRCA1/2基因突變者的乳腺癌家族史的比例更高。

[關(guān)鍵詞]三陰性乳腺癌;乳腺癌易感基因;基因突變;臨床特征

[中圖分類號(hào)] R737.9 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A ? ? ? ? ?[文章編號(hào)] 1674-4721（2020）8（c）-0127-04

[Abstract] Objective To analyze the mutation status and clinic characteristics of breast cancer susceptibility gene （BRCA）1/2 in patients with triple-negative breast cancer （TNBC）. Methods From April 2017 to April 2019， 55 patients with TNBC treated in our hospital were selected as the research objects. Reverse transcription polymerase chain reaction （PCR） method and DNA sequence sequencing method were used to determine the mutation of BRCA1/2 gene on the pathological tissue sections of all patients. Analyze the characteristics of BRCA1/2 gene mutation in TNBC patients， and divide them into mutation group and non-mutation group according to whether there are gene mutations， and the clinical data of the two groups of patients were compared and analyzed. Results A total of 9 cases of BRCA1/2 gene mutation were detected in 55 patients with TNBC， including 6 cases of BRCA1 gene mutation and 3 cases of BRCA2 gene mutation， the total detection rate was 16.36%. There were no significant differences in the age， menstrual status， tumor size， pathological type， lymph node metastasis， and clinical stage between the mutation group and the non-mutation group （P>0.05）. The proportion of breast cancer family history in the mutation group was higher than that in the non-mutation group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion The incidence of BRCA1/2 gene mutation is higher in TNBC patients， and the proportion of breast cancer family history in patients with BRCA1/2 gene mutation is higher.

[Key words] Triple-negative breast cancer; Breast cancer susceptibility gene; Gene mutation; Clinical features

乳腺癌是女性最為常見的惡性腫瘤之一，具有發(fā)病率高、死亡率高的特點(diǎn)，嚴(yán)重威脅女性的身體健康[1]。其中三陰性乳腺癌（TNBC）是一種特殊的乳腺癌亞型，是指孕激素受體（PR）、雌激素受體（ER）以及人類表皮生長(zhǎng)因子受體-2（Her-2）三種受體均為陰性的乳腺癌[2]。TNBC在所有乳腺癌類型中的占比為10%～20%，其生物學(xué)行為和臨床病理特征均存在一定的特殊性，癌細(xì)胞的侵襲性強(qiáng)，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)更高[3]。加上TNBC患者特殊的免疫組化分型，使得內(nèi)分泌治療、靶向治療的效果不佳，因此患者的預(yù)后更差[4]。近年來，乳腺癌的高危篩查逐漸受到臨床的重視。乳腺癌易感基因1（BRCA1）和BRCA2是遺傳性乳腺癌的主要易感基因之一[5]。BRCA1/2基因突變者發(fā)生乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)遠(yuǎn)高于未發(fā)生突變的人群。也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，BRCA1/2基因突變與TNBC的形成和發(fā)展有一定的關(guān)聯(lián)性[6]。因此了解TNBC患者的BRCA1/2基因突變狀態(tài)，對(duì)于其防治和預(yù)后評(píng)估均有積極的意義。本研究選取2017年4月～2019年4月我院收治的55例TNBC患者作為研究對(duì)象，探究分析其BRCA1/2基因突變狀態(tài)及與臨床特征的關(guān)系，以期為臨床診治提供一定的參考依據(jù)。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2017年4月～2019年4月我院收治的55例TNBC患者作為研究對(duì)象，均為女性，年齡68～25歲，平均（47.5±6.4）歲;美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)（AJCC）的TNM分期[7]：Ⅰ期22例，Ⅱ期25例，Ⅲ期8例;病理類型分布情況：浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌28例，浸潤(rùn)性小葉癌19例，其他類型8例。

病例入選標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)臨床診斷符合乳腺癌的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[8]，并經(jīng)病理學(xué)檢驗(yàn)證實(shí)者;②免疫組化顯示ER（-）、PR（-）、Her-2（-）者;③臨床資料完整者;④自愿參與本研究，并簽署知情同意書者;⑤排除合并有其他惡性腫瘤者。

1.2方法

1.2.1逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) ?將55例TNBC患者的腫瘤組織經(jīng)石蠟包埋處理后，采用QIAamp DNA FFPE的組織試劑盒（北京華夏遠(yuǎn)洋科技有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：20170351）進(jìn)行提取其中的DNA。提取完后，將其作為模板，置于無菌PCR管中，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)合成引物。PCR體系總體積25 μl，其中模板DNA 100 ng，含Mg2+的10×PCR緩沖液（上海康朗生物科技有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：20170812）5 μl，10 mmol/L的dNTP（上?？道噬锟萍加邢薰?，生產(chǎn)批號(hào)：20170509）0.8 μl、Taq DNA聚合酶（上海康朗生物科技有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：20170525）2 U以及上下游引物各0.5 μmol/L。PCR條件：94℃條件下進(jìn)行預(yù)變性，然后以94℃ 5 min、94℃ 45 s、57℃ 30 s進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。完成后在72℃條件下進(jìn)行延伸10 min。

1.2.2 DNA序列測(cè)序 ?通過瓊脂凝膠對(duì)獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳鑒定，確定單一亮條帶后進(jìn)行純化回收，并應(yīng)用DNA序列測(cè)序法對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行正反向雙端測(cè)序。

1.2.3信息處理 ?將測(cè)序結(jié)果與GenBank的野生型序列進(jìn)行對(duì)照，分析BRCA1/2基因的突變情況。根據(jù)人類基因組變異學(xué)會(huì)的規(guī)則對(duì)基因突變的堿基進(jìn)行命名。并將基因突變的位點(diǎn)與ClinVar數(shù)據(jù)庫、BRCA Exchange數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，以明確是否為新的突變。

1.3觀察指標(biāo)

分析55例TNBC患者BRCA1/2基因的突變情況，根據(jù)基因測(cè)序?qū)Ρ冉Y(jié)果中是否存在基因突變，將其分為突變組和未突變組，比較分析兩組患者的臨床資料。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布者轉(zhuǎn)換為正態(tài)分布后行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析;計(jì)數(shù)資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 TNBC患者BRCA1/2基因的突變情況分析

55例TNBC患者中共計(jì)檢測(cè)出9例BRCA1/2基因突變，突變總檢出率為16.36%;其中BRCA1基因突變6例，BRCA2基因突變3例。1例BRCA1基因突變c.4779_4780delAC的缺失移碼突變?yōu)樾掳l(fā)現(xiàn)的致病突變（表1）。

2.2 BRCA1/2基因突變與TNBC患者的臨床特征分析

突變組和未突變組患者的年齡、月經(jīng)狀態(tài)、腫瘤大小、病理類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。突變組患者的乳腺癌家族史比例高于未突變組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表2）。

3討論

TNBC患者的免疫組織分型特殊，由于ER、PR、Her-2三種受體的缺失，使其失去了相應(yīng)的3個(gè)治療靶點(diǎn)，因此治療的難度高，預(yù)后不良[9]。而TNBC的發(fā)生發(fā)展是原癌基因、抑癌基因等多基因共同作用的結(jié)果。原癌基因突變后的激活、抑癌基因的突變或缺失，打破了細(xì)胞增殖的正常調(diào)控機(jī)制，使得細(xì)胞進(jìn)入惡性增殖的狀態(tài)[10]。而BRCA1/2均是臨床公認(rèn)的抑癌基因之一，能激活DNA損傷的修復(fù)并參與細(xì)胞周期的調(diào)控，從而抑制乳腺癌的形成。其中前者位于染色體chr17上，后者位于chr13上，兩者均與遺傳性乳腺癌的發(fā)生密切相關(guān)[11]。臨床數(shù)據(jù)[12]統(tǒng)計(jì)顯示，亞洲人群的BRCA1/2突變發(fā)生率在20%以下。本研究結(jié)果顯示，55例TNBC患者中共計(jì)檢測(cè)出9例BRCA1/2基因突變，突變總檢出率為16.36%，基本符合既往報(bào)道[13]。其中BRCA1突變6例，BRCA2突變3例，BRCA1突變的比例要高于BRCA2。所有的突變均為外顯子突變，有2例BRCA2和5例BRCA1突變均由于堿基的改變提前產(chǎn)生終止信號(hào)，通過截短蛋白或無義介導(dǎo)的mRNA衰變導(dǎo)致BRCA蛋白質(zhì)正常生物功能的喪失，使其失活，進(jìn)而影響受損DNA的修復(fù)，參與TNBC的形成[14]。BRCA1基因中的c.5470_5477delATTGGGCA突變?cè)诙鄠€(gè)中國(guó)家族遺傳性乳腺癌、早發(fā)性三陰性乳腺癌患者中檢出，被認(rèn)為是中國(guó)人群特有的致病變異，與家族遺傳性乳腺癌、卵巢癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)[15]。同時(shí)，本研究還檢測(cè)出BRCA1基因中1個(gè)意義未明位點(diǎn)c.5402G>A，這一錯(cuò)義突變，導(dǎo)致1801號(hào)氨基酸編碼由甘氨酸的密碼子突變?yōu)樘於彼幔赡軙?huì)影響蛋白結(jié)構(gòu)或功能，但由于這種突變較為罕見，目前尚無足夠證據(jù)確定該變異致病性或良性。而BRCA1基因中c.4779_4780delAC突變?cè)跀?shù)據(jù)庫中暫無記錄，可視為新的突變位點(diǎn)，VEP生信注釋軟件預(yù)測(cè)該變異對(duì)蛋白質(zhì)影響較大，并綜合受檢者具體情況，綜合判定該變異的臨床意義為可能致病。BRCA2基因的c.5164_5165delAG缺失移碼突變可能會(huì)影響B(tài)RCA2蛋白活性和功能，影響攜帶者罹患乳腺癌或卵巢癌[16]。BRCA2基因的錯(cuò)義突變c.7975A>G不是常見人群的良性多態(tài)性，但目前臨床意義不明確。