張慧　黃立中　肖玉潔　 鄧天好　龔輝

[摘要] 目的 基于異黏蛋白（MTDH）基因探討黃芩苷對(duì)4T1細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響。 方法 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的4T1細(xì)胞，分為對(duì)照組，25、50、100、150、200 mg/L黃芩苷組，分別采用對(duì)應(yīng)藥物處理4T1細(xì)胞，MTT法檢測(cè)黃芩苷處理后的細(xì)胞活性，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell法測(cè)定細(xì)胞遷移力、侵襲力，Western blot檢測(cè)細(xì)胞中MTDH表達(dá)水平。 結(jié)果 25 mg/L黃芩苷對(duì)細(xì)胞遷移影響不明顯，隨著濃度增大到50 mg/L，遷移抑制作用逐漸明顯，到100、150 mg/L時(shí)，表現(xiàn)出明顯的抑制作用，但藥物作用24、48 h后，對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯遷移抑制作用。不同濃度黃芩苷組間細(xì)胞侵襲抑制率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。其中150 mg/L黃芩苷組細(xì)胞侵襲抑制率高于100 mg/L黃芩苷組（P < 0.05）。100、150 mg/L黃芩苷組細(xì)胞侵襲抑制率高于50 mg/L黃芩苷組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。與對(duì)照組比較，50、100、150 mg/L黃芩苷組MTDH表達(dá)量降低（P < 0.05或P < 0.01）。 結(jié)論 黃芩苷能抑制乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖，抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移能力和侵襲能力，其機(jī)制可能與下調(diào)MTDH的表達(dá)相關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 黃芩苷;異黏蛋白;增殖;侵襲;遷移

[中圖分類(lèi)號(hào)] R737.9 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A ? ? ? ? ?[文章編號(hào)] 1673-7210（2020）08（c）-0016-05

Effect study on MTDH mediated baicalin inhibiting proliferation， migration and invasion of 4T1 breast cancer cells

ZHANG Hui1 ? HUANG Lizhong2 ? XIAO YuJie2 ? DENG Tianhao3 ? GONG Hui3

1.Department of Medical Oncology， Chinese Medicine Hospital of Hainan Province， Hainan Province， Haikou ? 570203， China; 2.College of Combination of Chinese and Western Medicine， Hu′nan University of Chinese Medicine， Hu′nan Province， Changsha ? 410007， China; 3.Department of Medical Oncology， Hu′nan Academy of Traditional Chinese Medicine Affiliated Hospital， Hu′nan Province， Changsha ? 410006， China

[Abstract] Objective To investigate the effects of baicalin on proliferation， migration and invasion of 4T1 cells based on metadherin （MTDH） gene. Methods 4T1 cells in logarithmic growth stage were divided into blank control group and baicalin group with different doses of 25， 50， 100， 150 mg/L and 200 mg/L， and then treated with corresponding drugs. Cell activity after baicalin treatment was detected by MTT method. Migration was measured by scratch assay. Invasion was measured by transwell assay and MTDH expression in cells was measured by Western blot. Results The effect of baicalin at 25 mg/L on cell migration was not obvious. As the concentration increased to 50 mg/L， the inhibition of cell migration gradually became obvious. When the concentration increased to 100 mg/L and 150 mg/L， the inhibition of cell migration showed obvious effects. The inhibition rate of cell invasion of baicalin groups with different concentrations was statistically significant （P < 0.05）. The inhibition rate of cell invasion in the group of 150 mg/L baicalin was higher than that in the group of 100 mg/L baicalin （P < 0.05）. The inhibition rate of cell invasion in the 100 mg/L and 150 mg/L baicalin group was higher than that in the 50 mg/L baicalin group， and the differences were highly statistically significant （P < 0.01）. Compared with the control group， MTDH expression was decreased in the 50， 100 mg/L ?and 150 mg/L baicalin groups （P < 0.05 or P < 0.01）. Conclusion Baicalin can inhibit the growth and proliferation of 4T1 breast cancer cells， inhibit the migration and invasion ability of breast cancer cells， and its mechanism may be related to the down-regulation of MTDH expression.

[Key words] Baicalin; Metadherin; Proliferation; Migration; Invasion

乳腺癌發(fā)病率位居女性惡性腫瘤的首位[1]，具有發(fā)病率高、侵襲率強(qiáng)、極易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)。復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致乳腺癌患者死亡的主要原因[1-2]。研究顯示[3-5]，異黏蛋白（MTDH）基因過(guò)表達(dá)能促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞往肺、骨、腦等器官侵襲轉(zhuǎn)移的能力。黃芩是一種廣泛使用的中草藥，主要成分為黃芩苷已被證實(shí)具有廣譜抗腫瘤作用，本課題組前期采用黃芩苷聯(lián)合黃芩素進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)[6]，發(fā)現(xiàn)其能抑制乳癌細(xì)胞生長(zhǎng)、誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡，抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力[7]。而黃芩苷在多種中藥中可提取，對(duì)臨床指導(dǎo)及使用意義更大。因此本研究探討黃芩苷對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲遷移的影響及機(jī)制，為尋找低價(jià)安全有效的抗癌藥物提供新思路。

1 材料與方法

1.1 腫瘤細(xì)胞株

4T1乳腺癌細(xì)胞株在BALB/c裸鼠中的生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移特性與人體中的乳腺癌十分接近，注射后能產(chǎn)生高轉(zhuǎn)移腫瘤，轉(zhuǎn)移至肺、肝等部位。該細(xì)胞株由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及試劑

黃芩苷：純度98.6%，批號(hào)：110715-201416，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，用DMSO溶解，配成200 mg/L備用。胎牛血清、DMEM培養(yǎng)液：美國(guó)Hyclone公司;胰酶：美國(guó)Invitrogen公司;DMSO：美國(guó)Xiasi生物公司;MTT：美國(guó)Sigma公司;MTDH兔抗人單克隆抗體：美國(guó)Proteintech，貨號(hào)13860-1-AP。完全培養(yǎng)液的配置：10%胎牛血清、1%雙抗加入高糖DMEM培養(yǎng)液中，隨用隨配。

1.3 主要儀器

SW-CJ-1CV超凈工作臺(tái)：蘇凈安泰公司;倒置光學(xué)顯微鏡：重慶光學(xué)儀器廠;TDZ5-40臺(tái)式離心機(jī)：長(zhǎng)沙天創(chuàng)儀器公司;Transwell小室：Costar公司;6孔板：NEST;SHEL-LABCO2培養(yǎng)箱：日本Hitachi公司;GG112-10B恒溫水浴箱：上海醫(yī)療器械廠。

1.4 方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)及傳代 ?4T1細(xì)胞培養(yǎng)于完全培養(yǎng)液中，37℃、5%CO2飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)90%左右進(jìn)行傳代。

1.4.2 MTT法測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率 ?將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以1×104個(gè)/孔鋪于96孔板，分為對(duì)照組，25、50、100、150、200 mg/L黃芩苷組，對(duì)照組僅加入相應(yīng)體積的培養(yǎng)液，黃芩苷組加入不同濃度的黃芩苷，每一濃度設(shè)6個(gè)平行孔，恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，吸出上清，每孔加入無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液溶解的MTT 20 μL（5 mg/mL），孵育4 h，吸出上清，以DMSO溶解藍(lán)紫色顆粒，在酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)量各孔的吸光度值（OD），再計(jì)算細(xì)胞抑制率。細(xì)胞抑制率=[1-（OD藥物-OD對(duì)照組）/（OD細(xì)胞-OD對(duì)照組）]×100%。

1.4.3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) ?按密度為5×105個(gè)/孔將4T1細(xì)胞懸液接種到6孔板，每孔加入2 mL完全培養(yǎng)液，恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)胞呈單層生長(zhǎng)至80%，用無(wú)菌的10 μL移液器槍頭沿著細(xì)胞孔的中軸線輕輕劃過(guò)（肉眼<1 mm），PBS緩沖液輕輕沖洗，洗去細(xì)胞殘骸，分為對(duì)照組和25、50、100、150 mg/L黃芩苷組，黃芩苷各組加入相應(yīng)濃度的黃芩苷2 mL，對(duì)照組加入2 mL完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。用倒置光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞遷移情況（100×），每組細(xì)胞均設(shè)2個(gè)平行孔，拍照記錄。

1.4.4 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) ?向已鋪Matrigel膠的Transwell細(xì)胞培養(yǎng)板上室中加入200 μL含濃度為25、50、100、150 mg/L黃芩苷的單細(xì)胞培養(yǎng)液（含細(xì)胞4×104個(gè)），Transwell細(xì)胞培養(yǎng)板下室加入完全培養(yǎng)液600 μL，恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。取出Transwell小室，用棉簽擦掉小室的Matrigel膠和未穿膜的細(xì)胞，4%多聚甲醛固定10 min，用濃度0.1%結(jié)晶紫染色10 min，洗掉溶液中的結(jié)晶紫后在倒置光學(xué)顯微鏡下（200×），每組計(jì)數(shù)5個(gè)不同視野中的細(xì)胞數(shù)目。侵襲抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)組侵襲細(xì)胞數(shù)/對(duì)照組侵襲細(xì)胞數(shù)）×100%。

1.4.5 Western blot檢測(cè)MTDH表達(dá) ?鋪于6孔板內(nèi)的4T1細(xì)胞生長(zhǎng)至60%采用藥物處理，分為對(duì)照組和50、100、150 mg/L黃芩苷組。對(duì)照組予以完全培養(yǎng)液，黃芩苷各組給予不同濃度黃芩苷培養(yǎng)24 h，離心收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液并輕輕搖晃培養(yǎng)瓶，使裂解液和細(xì)胞充分接觸，提取總蛋白后進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜，加入MTDH一抗、二抗孵育后ECL顯色曝光，Quantity One專(zhuān)業(yè)灰度分析軟件進(jìn)行分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用方差分析（ANOVA）;等級(jí)資料兩樣本相關(guān)性檢驗(yàn)用Spearman等級(jí)相關(guān)分析法。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT法測(cè)黃芩苷對(duì)4T1細(xì)胞活力的影響

25、50、100 mg/L濃度下，24、48 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)黃芩苷對(duì)4T1細(xì)胞活力的影響不明顯。黃芩苷濃度增加到150、200 mg/L，48 h的細(xì)胞抑制率分別為40%和68%，明顯抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)?；谶@一階段的MTT實(shí)驗(yàn)，考慮到高濃度黃芩苷（200 mg/L）對(duì)乳腺癌細(xì)胞活性的抑制作用，為了排除后續(xù)實(shí)驗(yàn)中黃芩苷對(duì)4T1乳腺癌遷移和侵襲作用是由抑制細(xì)胞活性引起的，后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用25、50、100、150 mg/L黃芩苷。見(jiàn)圖1、表1。

2.2 不同濃度黃芩苷對(duì)4T1細(xì)胞遷移能力的作用

25 mg/L黃芩苷對(duì)細(xì)胞遷移影響不明顯，隨著濃度的增大到50 mg/L，遷移抑制作用逐漸明顯，到100、150 mg/L時(shí)，表現(xiàn)出明顯的抑制作用，但藥物作用24、48 h后，對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯遷移抑制作用。見(jiàn)圖2。

2.3不同濃度黃芩苷對(duì)4T1細(xì)胞侵襲抑制作用

與對(duì)照組比較，25 mg/L黃芩苷組細(xì)胞侵襲能力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），50、100、150 mg/L黃芩苷組Transwell小室下面的細(xì)胞數(shù)均少于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。不同濃度黃芩苷組間細(xì)胞侵襲抑制率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。其中150 mg/L黃芩苷組細(xì)胞侵襲抑制率高于50、100 mg/L黃芩苷組（P < 0.05）。100mg/L黃芩苷組細(xì)胞侵襲抑制率高于50 mg/L黃芩苷組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見(jiàn)圖3～4。

與對(duì)照組比較，△P < 0.05;與50 mg/L黃芩苷組比較，*P < 0.05;與100 mg/L黃芩苷組比較，#P < 0.05

2.4黃芩苷對(duì)4T1細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，50、100、150 mg/L黃芩苷組MTDH表達(dá)量降低（P < 0.05或P < 0.01）。見(jiàn)表2、圖5。

3 討論

MTDH[8-9]是一個(gè)定位于8號(hào)染色體長(zhǎng)臂2區(qū)2帶的原癌基因。既往在4種不同乳腺癌細(xì)胞株中均檢測(cè)到MTDH表達(dá)[10]。采用shRNA干擾乳腺癌細(xì)胞MTDH表達(dá)[11]，發(fā)現(xiàn)乳腺癌侵襲能力降低，而對(duì)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移乳腺癌患者瘤組織中MTDH檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，其表達(dá)明顯高于原發(fā)乳腺癌患者[12]，提示MTDH過(guò)表達(dá)與乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[13]。前期在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中對(duì)乳腺癌組織中MTDH表達(dá)及其與肺轉(zhuǎn)移相關(guān)性研究中發(fā)現(xiàn)，MTDH與乳腺癌肺轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[14]。

黃芩苷分子式C21H18O11，在常用中藥黃芩、半枝蓮、燈盞細(xì)辛等藥材中均可以提取到，是中藥黃芩發(fā)揮功效的主要物質(zhì)基礎(chǔ)之一，在黃芩中含量高達(dá)9%[15-16]。黃芩苷除傳統(tǒng)報(bào)道抗炎、抗病毒及解熱護(hù)肝作用外，對(duì)肝癌、結(jié)腸癌、肺癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤具有抗瘤作用[17-18]。黃芩苷可以通過(guò)逆轉(zhuǎn)上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化從而有效抑制乳腺癌的轉(zhuǎn)移[19]。課題組前期研究證實(shí)，黃芩苷具有抑制乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)、誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡，抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力[6-7]。

本研究MTT實(shí)驗(yàn)證實(shí)了黃芩苷對(duì)細(xì)胞活性的抑制作用，提示黃芩苷可以有效的抑制乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖。遷移能力和侵襲能力是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移過(guò)程中必須具備的兩個(gè)基本條件[20]。劃痕及Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，黃芩苷能減弱4T1乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。進(jìn)一步檢測(cè)黃芩苷干預(yù)后各組MTDH表達(dá)發(fā)現(xiàn)，MTDH的表達(dá)在黃芩苷各組均有不同程度的下調(diào)，提示黃芩苷抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲遷移的機(jī)制可能與下調(diào)MTDH的表達(dá)相關(guān)，從細(xì)胞實(shí)驗(yàn)層次為黃芩苷抗乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移提供了理論依據(jù)。根據(jù)這一結(jié)論，本課題組已經(jīng)開(kāi)展黃芩苷抗乳腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，以期進(jìn)一步研究黃芩苷的療效和MTDH相關(guān)調(diào)節(jié)機(jī)制。

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（收稿日期：2019-10-24）

[基金項(xiàng)目] 湖南省教育廳一般項(xiàng)目（17C1205）;海南省省級(jí)中醫(yī)重點(diǎn)專(zhuān)科建設(shè)項(xiàng)目（腫瘤科）（S100111.401）;海南省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（817338）。

[作者簡(jiǎn)介] 張慧（1985.2-），女，博士;研究方向：惡性腫瘤的中西醫(yī)結(jié)合防治。

[通訊作者] 龔輝（1986.6-），女，博士，在站博士后;研究方向：惡性腫瘤的中西醫(yī)結(jié)合防治。