趙榮杰 , 趙 峰 , , 徐奎棟 ,

(1. 中國科學院海洋研究所海洋生物分類與系統(tǒng)演化實驗室, 山東 青島 266071; 2. 中國科學院大學, 北京100049; 3. 中國科學院海洋大科學研究中心, 山東 青島 266071)

真核微生物狹義上指原生生物, 廣義上還包括單細胞真菌和微型后生動物[1-3], 其種類繁多、分布廣泛, 在海洋初級生產、微食物網和生物地球化學循環(huán)等生態(tài)過程中發(fā)揮著重要作用[4-5]。海洋真核微生物多樣性的研究對于理解海洋生態(tài)環(huán)境的變化過程以及人類活動和氣候變化對海洋生態(tài)系統(tǒng)的影響等至關重要。

近年來, 環(huán)境DNA 結合高通量測序技術被廣泛應用于真核微生物多樣性研究中[6-8], 極大地拓展了對真核微生物多樣性及其分布的認知, 檢獲了大量潛在新類群, 并為微型生物地理分布這一國際熱點爭論, 提供了大量新鮮素材和佐證[9-14]。近海因陸源輸入[15-17]等原因具有豐富的營養(yǎng)鹽, 真核微生物豐度和生物量較高, 已有的關于近海水體中的真核微生物多樣性研究中, 采樣量為300 mL～40 L不等[9,12,18-19]。熱帶大洋多為寡營養(yǎng)環(huán)境, 真核微生物的豐度和生物量明顯較近海低, 檢獲足夠的生物多樣性所需要的采樣量遠大于近海。受限于采樣方法、采樣時間和成本, 大洋生物調查的采樣量差異巨大, 范圍為10～500 L[6,11,13]。

采樣量是影響海洋真核微生物多樣性評估的重要因素。 有關采樣量對真核微生物多樣性影響的研究多集中于沉積物。Fonseca 等人[20]關于海底沉積物中后生動物多樣性的研究發(fā)現(xiàn), 8 個采樣站共24 個沉積物樣品所獲得的OCTU(Operational Clustering of Taxonomic units, 可操作聚類分類單元)稀釋曲線未達到飽和。由于底棲生物斑塊分布的特性, 即使高通量測序技術佐以大量的樣品, 真實的物種多樣性仍未可知。水體與沉積物不同, 潮汐和洋流等海洋現(xiàn)象增強了水體的連通性, 不同海域之間或不同深度水層之間得以產生化學和生物因素的交流[21], 從而使得水體中真核微生物的分布均勻度指數高于底棲群落, 但水體中真核微生物多樣性仍與采樣量存在正相關的關系。因此, 探究水體采樣量對檢獲的真核微生物多樣性的影響, 對真核微生物多樣性研究具有重要的指導意義。

呂宋海峽北起臺灣島南至菲律賓呂宋島, 是連接中國南海和西太平洋的重要通道[22]。呂宋海峽屬于寡營養(yǎng)海域, 作為黑潮在沿太平洋西岸北上及進入南海的過程中的必經之地, 其水文環(huán)境和生物多樣性深受黑潮攜帶的西太平洋海流信號的影響[23-26]。該海區(qū)真核微生物群落交流密切, 且處于大洋與近岸的交匯區(qū), 基于該海區(qū)的研究, 對未來近岸和遠洋的真核微生物多樣性分布研究均具有重要的參考價值。

本研究旨在探究不同采樣量對水體中真核微生物多樣性評估的影響, 回答水體中真核微生物多樣性是否隨采樣量的增加而增加, 多大采樣量能夠充分反映水體中的真核微生物群落結構與多樣性分布特點等科學問題。

1 材料與方法

1.1 采樣點的選擇和樣品的采集

實驗所用樣品系2018 年6 月搭載“華務號”科考船, 于呂宋海峽處獲取, 共計5 個采樣點, 其中C08(124°E, 22.333°N)、C10(122.667°E, 21.667°N)和C12(124°E, 21.667°N)站位位于呂宋海峽東側, 處于菲律賓海盆中; C14(120.5°E, 21°N)和C19(120.5°E,19.6°N)站位位于呂宋海峽及其西側, 處于南海(圖1)。

圖1 采樣站位圖Fig. 1 Map of sampling sites

每個采樣點設4 個重復, 每個重復采10 L 表層海水。海水預先用孔徑為200 μm 的篩絹過濾, 再用孔徑為0.22 μm 的聚碳酸酯濾膜過濾, 將濾膜保存于無RNA 酶的2 mL 凍存管, 并立即放置到液氮中保存, 帶回實驗室后轉移至–80℃冰箱保存。采水及過濾所用的水桶、篩絹、塑料管等在每次使用后均用無菌蒸餾水沖洗2～3 遍, 排除樣品之間的交叉污染。

1.2 DNA 的提取和真核微生物18S rDNA的擴增

所有樣品均采用凱杰 DNA/RNA 提取試劑盒(AllPrep DNA/RNA Mini Kit, Qiagen, Germany)并按照使用說明進行DNA 的提取。最終每個樣品得到1 份DNA(100 μL)。以DNA 為模板利用真核生物特異性引 物 F (5′-CCAGCA(G/C)C(C/T)GCGGTAATTCC-3′,565bp-584bp) 和 R (5′-ACTTTCGTTCTTGAT(C/T)(A/G)A-3′, 964bp-981bp)對樣品進行18S V4 區(qū)的擴增, 擴增程序見文獻[27], 每份DNA 設置3 個重復。為減少 PCR 過程中產生的誤差, 采用高保真酶Q5(BioLabs INC., NEW ENGLAND)進行擴增。擴增產物采用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行濃度及擴增片段準確度的檢測, 對在480bp 處有明顯亮帶的樣品采用Qubit 2.0 熒光定量儀(Thermo Scientific)測定準確濃度, 并用GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Scientific, USA)進行純化, 3 個重復進行合樣, 用于后續(xù)測序。

1.3 高通量測序與數據處理

擴增樣品由北京諾禾致源科技股份有限公司利用Illumina HiSeq 測序平臺進行測序, 并采用NEB Next Ultra? DNA Library Prep Kit for Illumina (NEB,USA) 建立樣品序列庫, 添加barcode 序列。序列庫的質量通過Qubit 2.0 熒光定量儀 (Thermo Scientific,USA) 和Agilent Bioanalyzer 2100 system 進行測定。

對Illumina HiSeq 測序平臺得到的序列信息進行拼接得到原始數據(Raw Data), 經過質控和去嵌合體得到可用于后續(xù)分析的有效數據(Clean Data)。利用USEARCH(version9.2/10.0http://drive5.com/uparse/)對有效數據進行去冗余、去單一序列和97%相似度的OTU(Operational Taxonomic Units, 可操作分類單元)聚類分析, 根據OTU 聚類結果, 對每個OTU 的代表序列與SILVA 數據庫比對作物種注釋, 得到對應的物種信息和基于物種的豐度分布情況, 即OTU Distribution Table(以下簡稱OTU Table)。

利用EstimateS (EstimateS 9.1)對OTU Table 中各OTU 豐度信息進行4 次隨機重抽樣, 重抽樣標準為10 000 條序列, 得到各站位在10 L、20 L、30 L和40 L 時的OTU 數目和ACE 指數, 并以此為基礎在 Excel 中繪制物種累積曲線、在 SPSS 中利用ANOVA 功能計算各組之間的單因素方差值。

以各個站位4個重復的OTU 豐度信息為基礎利用R 語言的VEGAN 包的vegdist 功能(https://CRAN.Rproject.org/package=vegan)計算各個站位4 個重復和重復總和之間的Bray-Curtis 距離, 并以此為基礎利用R 語言的ggplot2 包(https://CRAN.R-project.org/package=ggplot2)作物種組成和物種豐度的主坐標分析(PCoA, Principal Co-ordinates Analysis)。

2 結果

2.1 物種豐富度與采樣量的關系

自5個站位共計20個樣品的分析中獲得2 066 528條有效序列, 97%相似度聚類后得到2 737 個OTU。5 個站位真核微生物的OTU 數量與采樣量之間均存在正相關關系, 且每個站位的物種累積曲線均未達到飽和。分析發(fā)現(xiàn), 假設各站位40 L水所獲得的OTU數量為100%,則10 L 水所獲得的平均OTU 數量為64.1%, 20 L 水為81.7%, 而30 L 水為92.3%(圖2, 表1)。采樣量越大, 可能獲得的OTU 數量就越多。

圖2 各站位真核微生物物種累積曲線Fig. 2 The accumulation curve of microeukaryotes collected from each station

所有站位不同采樣量下所獲的OTU 數量的單因素方差分析(one-way ANOVA, 方差齊性檢驗 P=0.108, 符合正態(tài)分布)顯示, 采樣量對OTU 數量存在顯著影響。10 L 水所獲得的OTU 數量顯著少于其他各組(P=0.00～0.02); 20 L 水所獲得的OTU 數量顯著少于40 L 水組(P=0.017), 但與30 L 組沒有顯著差異; 30 L 組與40 L 組沒有顯著差異, 采樣量對OTU數量存在顯著影響。

表1 各站位10 L、20 L 及30 L 水的OTU 數量占40 L水OTU 數量的百分比/%Tab. 1 Percentage of OTU number obtained from 10 L,20 L, and 30 L seawater samples in that obtained from 40 L seawater samples

所有站位的不同采樣量下的ACE 指數的單因素方差分析(方差齊性檢驗P=0.930, 符合正態(tài)分布)顯示, 采樣量對ACE 指數存在顯著影響(表2)。10 L組的ACE 指數顯著少于30 L 和40 L 組(P=0.001～0.006); 20 L 組的ACE 指數與30 L、40 L 組沒有顯著差異; 30 L 組與40 L 組沒有顯著差異, 采樣量對ACE 指數存在顯著影響。

表2 各站位10 L、20 L、30 L 及40 L 水的ACE 指數Tab. 2 ACE index based on the sample sizes of 10 L, 20 L,30 L, and 40 L seawater samples

2.2 群落結構與采樣量的關系

對每個站位4 個重復(即4 個10 L 組)和重復相加得到的總和(即40 L 組)的真核微生物群落結構進行比較, 以 Bray-Curtis 距離為基礎的主坐標分析(PCoA)顯示, 10 L 組與40 L 組之間在物種組成上重合度很高, 無明顯差異(圖3)。多元方差分析(Adonis)顯示, 4 個10 L 組與40 L 組之間的群落差異P 值均大于0.05, 不存在顯著差異。

在 5 個站位的樣品中, OTUs 主要包括甲藻(Dinophyta)、纖毛蟲(Ciliophora)、不等鞭毛類(Stramenopiles)、有孔蟲類(Rhizaria)、Hacrobia (包括隱藻類Cryptophya 和定鞭藻類Haptophyta)、后鞭毛類(Opisthokonta)和原始色素體類(Archaeplastida)等主要類群以及其他豐度較低的OTUs(圖4, 圖5), 其中Dinophyta 和Ciliophora 同屬于囊泡類(Alveolata)。Alveolata、Stramenopiles 和Rhizaria(SAR 類群)為主要類群, 在所有樣品中的平均OTU 數量依次占總數量的63.3%、10.8%和10.0%, 平均序列數依次占總數量的70%、4.0%和11.4%。

圖3 四個10 L 重復和40 L 之間的群落相似性Fig. 3 Similarities between communities obtained from the 40 L seawater and each of 10 L seawater samples

圖4 所有站位主要類群的相對豐度Fig. 4 The proportions of the OTUs and sequences of major taxonomic groups

圖5 所有站位主要類群的豐度Fig. 5 Number of OTUs and sequences of major taxonomic groups

2.3 優(yōu)勢種和稀有種與采樣量的關系

序列數占該樣品總序列數1%及以上的OTU 被劃為優(yōu)勢OTU, 序列數占該樣品總序列數0.1%及以下的OTU 被劃為稀有OTU。

在數量上, 優(yōu)勢OTU 數量隨采樣量的增加無明顯變化, 稀有OTU 的數量隨采樣量的增加而增加(表3)。在數量占比上, 總和(40 L)中優(yōu)勢OTU 占OTU 總數目的比值小于各個重復(10 L), 且優(yōu)勢OTU 占OTU 總數目的比值在各站位不同重復之間無顯著差異, 在各個重復與總和之間存在顯著差異(P=0.01～0.04); 總和中稀有OTU 占OTU 總數目的比值大于各個重復, 且稀有OTU 占OTU 總數目的比值在同一站位不同重復之間無顯著差異, 但不同重復與總和之間均有顯著差異(P=0.00～0.02)。

表3 優(yōu)勢OTU 和稀有OTU 數量和數量占比Tab. 3 Number and proportion of abundant and rare OTUs among the total OTUs

2.4 采樣量對不同粒級生物多樣性的影響

選取鑒定到種且匹配度為100% 的OTUs, 根據對應物種的個體大小對其分組(表4)。分析各組豐度與采樣量之間的關系, 發(fā)現(xiàn)不同個體大小的 OTU在不同重復和重復總和中均有分布且數量無明顯變化(圖6), 未檢獲到采樣量對不同個體大小的OTU 豐度的影響。

表4 OTU 及其對應真核微生物類群(屬水平)粒徑Tab. 4 Body sizes of each OTU based on the best BLAST hit at the genus level

圖6 四個10 L 重復和40 L 不同粒級生物序列數Fig. 6 Sequence number of taxa with different body sizes obtained from the 40 L seawater and each of the 10 L seawater samples

3 討論

關于采樣量影響微生物多樣性的研究多集中于異質化明顯的海底沉積物[28-29], 研究發(fā)現(xiàn), 采樣量對沉積物中的細菌、真菌以及小型底棲動物的多樣性和群落組成有顯著影響[30-32]。在Nascimento 等人的研究中, 隨著采樣量的增加, 原生生物的群落組成趨于穩(wěn)定, 表明在評估沉積物中的生物 β-多樣性時, 采樣量是關鍵影響因素[28]。

與沉積物不同, 關于采樣量對異質性低的水體中真核微生物的影響的研究較少。已有的海洋水體真核微生物多樣性研究中, 近岸站位的采樣量多至40 L[19], 少則300 mL[9], 這與采樣地的水體渾濁度和真核微生物豐度有關[33]。通常情況下, 采樣量越大,可能獲得的真核微生物物種越多。本研究發(fā)現(xiàn), 隨著采樣量增加, 呂宋海峽水體中的真核微生物OTU 數量和ACE 指數顯著增加, 但當采樣量達到20 L 時,ACE 指數與采樣量之間不再存在顯著相關性, 20 L組的OTU 數量與30 L 組也無顯著差異, 而且隨采樣量增加, 主要類群的種類和相對豐富度比例即真核微生物群落結構并無顯著變化。

除了考慮采樣量的大小, 野外采樣時還需考慮采樣時間對樣品質量的影響。當采樣地水體較混濁時, 濾膜易被堵塞, 將極大地延長過濾時間。而一旦過濾時間過長, 會造成水體中DNA 和RNA 的過多降解, 因此, 野外采樣過濾時間一般控制在30 分鐘之內[34]。在實際采樣過程中, 應同時考慮樣品過濾時間, 根據采樣地水體的渾濁程度和真核微生物豐度確定合適的采樣量。

在本研究中, 各站位不同重復的豐富OTU 數量穩(wěn)定, 各重復中豐富OTU 數目占全部數目的比例隨采樣量的增加而降低, 而稀有種OTU 數占全部OTU數量的比例隨著采樣量增加而增加, 表明優(yōu)勢種更易檢獲, 小采樣量時已基本檢獲了全部的優(yōu)勢種, 隨著采樣量增加, 更多的稀有種被檢獲。微生物群落一般由少數優(yōu)勢種和大量稀有種構成[19], 稀有種因其龐大的數量和高度的多樣性很難被全部檢測到[35]。

與傳統(tǒng)分類學方法相比, 高通量測序能夠高效地獲取環(huán)境中的微生物多樣性, 可檢測到因豐度較小而難以觀察到的稀有種[36]。鑒于其高度的靈敏性,PCR 過程和數據處理的細微差別能夠造成截然不同的分類結果, 因此, 在評估樣品的真核微生物多樣性時, 選擇一個可信的實驗流程和分類標準尤為重要[20]。首先, 本研究選用的擴增引物為真核生物通用引物, 擴增區(qū)域為編碼真核生物核糖體小亞基RNA V4 區(qū)的DNA, 該區(qū)域較為保守, 能夠保證屬級水平的精確鑒定[27]。其次, 為了獲得更全面的真核微生物物種信息, 每個重復樣品設置三個PCR 重復, 擴增完成后合并PCR 產物并送測。在后期數據處理時, 選擇 97%相似度聚類[37], 以保證獲得真實物種信息,同時減少因更高相似度產生的單一序列比例, 由此提高了分類效率。

4 總結

增加采水量可檢獲更多的OTU, 但當采水量達到20 L 時, OTUs 增加的速率減緩, 與更大體積水樣檢獲的群落多樣性指數無顯著差異。隨著采水量增加, 更多的稀有OTUs 被檢獲, 而豐富的OTUs 數量變化不顯著, 采水量對真核微生物群落結構沒有顯著影響。綜合考慮樣品的可得性和現(xiàn)場處理時間的影響, 采集20 L 水所獲得的物種豐富度和群落構成可基本反映這一寡營養(yǎng)海域的真核微生物多樣性。

致謝: 中國科學院海洋研究所南峰、任強和黃平平協(xié)助樣品采集, 謹致謝忱。