劉曉菲，王楠，李斐斐，宋愛莉，張麗美

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250335；2.山東省中醫(yī)藥研究院，山東 濟(jì)南 250014)

肉芽腫性乳腺炎又稱肉芽腫性小葉性乳腺炎(granulomatous little mastiffs，GLM),是指乳腺的非干酪樣壞死，局限于小葉的肉芽腫性病變。多數(shù)專家認(rèn)為GLM是一種由多種炎癥細(xì)胞和細(xì)胞因子參與的免疫相關(guān)疾病[1]。中醫(yī)因其發(fā)病初期以腫塊為主，中期熱盛肉腐成膿，后期破潰流膿形成瘺管或竇道的臨床特點(diǎn)，將其歸屬于乳癰、乳漏范疇[2]。本研究結(jié)合臨床及相關(guān)文獻(xiàn)[1-5]將本病分為肝郁痰凝證(腫塊期)、熱毒熾盛證(膿腫期)及正虛毒戀證(潰后期)三期，分析山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院手術(shù)治療GLM患者的臨床資料，研究其病理學(xué)特征及不同證型中相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)和差異；為治療GLM在免疫學(xué)方面提供可參考的臨床依據(jù)，以及不同的診療思路。

1 資料與材料

1.1 資料

研究對(duì)象均來自于2017年1月—2018年12月于山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院乳腺外科接受手術(shù)治療且病理診斷為肉芽腫性乳腺炎的女性患者。排除標(biāo)準(zhǔn):①未經(jīng)過系統(tǒng)治療即出院的病例；②病理診斷不明確的患者；③病例資料不完整影響統(tǒng)計(jì)分析的病例；④合并其他免疫相關(guān)疾病的病例；⑤合并其他乳房疾病如乳房結(jié)核，影響結(jié)果分析的患者。剔除標(biāo)準(zhǔn):①治療期間有嚴(yán)重不良反應(yīng)者；②病理組織較小，不足以做免疫組化的病例。

本研究最終納入符合標(biāo)準(zhǔn)的50例患者，按照中醫(yī)證型標(biāo)準(zhǔn)分組：肝郁痰凝證(腫塊期)、熱毒熾盛證(膿腫期)、正虛毒戀證(潰后期)。其具體資料如下：腫塊期15例患者，15例已育、0例未育，年齡分布為24～39歲，平均年齡為(31.55±1.03)歲；膿腫期18例患者，17例已育、1例未育，年齡在26～42歲，平均年齡為(33.27±2.21)歲；潰后期17例，17例已育、0例未育，年齡分布為28～40歲，平均年齡為(33.80±1.81)歲。三組患者年齡、已婚已育比例比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，研究有可比性。

1.2 中醫(yī)證型分期

考慮本病和乳癰的臨床表現(xiàn)相似，參考陳紅風(fēng)主編的《中醫(yī)外科學(xué)》乳癰分期、林毅《現(xiàn)代中醫(yī)乳房病學(xué)》，并結(jié)合臨床及相關(guān)文獻(xiàn)[1-5]將本病進(jìn)行分期如下。

(1)肝郁痰凝證(腫塊期):乳房腫塊,質(zhì)韌硬,形態(tài)不規(guī)則,境界不清,表面不光滑,活動(dòng)度較差,疼痛或有壓痛,表面皮膚不紅或微紅,局部皮溫正常或略高；無發(fā)熱、惡寒等全身癥狀,少數(shù)腋下淋巴結(jié)可及腫大；舌淡白或淡紅,苔薄白或白膩，脈沉弦。

(2)熱毒熾盛證(膿腫期):腫塊增大,紅腫熱痛加重,可累及多個(gè)象限,有波動(dòng)感或穿刺有膿液抽出；可伴腋下淋巴結(jié)腫大、發(fā)熱、惡寒等全身癥狀；舌質(zhì)紅,苔黃膩,脈滑數(shù)。

(3)正虛毒戀證(潰后期):乳房膿腫潰破,膿出不暢,或膿腫切開后失治誤治,膿水淋漓,創(chuàng)面肉色不鮮；伴面色無華，神疲乏力，食欲不振，舌質(zhì)淡,苔薄白,脈細(xì)無力。

1.3 儀器和設(shè)備

RM2235切片機(jī)(德國(guó)LEICA公司)，生物組織攤片烘烤機(jī)(湖北亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司)，捷達(dá)光學(xué)顯微鏡550D(沈陽優(yōu)軟科技發(fā)展有限公司)，EG1150H型生物組織包埋機(jī)(德國(guó)LEICA公司)。

1.4 試劑

兔抗人CD4多克隆抗體(萬類生物科技有限公司，批號(hào)：wl0282)，兔抗人CD8多克隆抗體萬類生物科技有限公司，批號(hào)：wl0281)，兔抗人TNF-α多克隆抗體萬類生物科技有限公司，批號(hào)：wl0334)，兔抗人TNFα-r1(P55)多克隆抗體(萬類生物科技有限公司，批號(hào)：wl0338)，SP免疫組化試劑盒(萬類生物科技有限公司，批號(hào)：wl0776)，DBA顯色試劑盒(萬類生物科技有限公司，批號(hào)：wl0290)，PBS緩沖液(萬類生物科技有限公司，批號(hào):wla102)，二甲苯、蘇木紅、伊紅(上海強(qiáng)順化學(xué)試劑有限公司)。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)步驟

(1)收集病理蠟塊，連續(xù)4 μm切片,每個(gè)蠟塊組織切取5張切片,共計(jì)305張,分5組即HE染色組、CD4組、CD8組、TNF-α組、P55組。

(2)HE法染色：經(jīng)二甲苯脫蠟切片，梯度乙醇脫苯，各梯度酒精分別約1～2 min，水洗，蘇木精染細(xì)胞核，水洗，伊紅染細(xì)胞質(zhì)，各梯度乙醇脫水，中性樹膠封片。

(3)免疫組化法：①將石蠟切片脫蠟至水;②抗原修復(fù);③加入3%H2O2，室溫10 min以滅活內(nèi)源性過氧化物酶；④封閉；⑤孵育一抗：滴加適當(dāng)一抗稀釋液稀釋一抗(分別按說明書濃度)，室溫孵育1～2 h或者4 ℃過夜孵育。TBS沖洗3次，每次1 min。分別以說明書陽性組織做陽性對(duì)照，使用TBS緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照；⑥孵育二抗：滴加二抗，37 ℃孵育30 min，TBS沖洗3次，每次1 min；⑦DAB顯色;⑧蘇木素復(fù)染2～3 min，然后蒸餾水沖洗；⑨封片膠封片、顯微鏡觀察。

2.2 免疫組化評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)

組織切片中陽性指標(biāo)是棕黃色或棕褐色顆粒。參考許良中、楊文濤1996年《免疫組織化學(xué)反應(yīng)結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)》[6]。

2.3 采集免疫組化圖像測(cè)定平均灰度值

每張切片在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野并拍照取圖，采用應(yīng)用丹吉爾灰度軟件計(jì)算平均灰度值，灰度值數(shù)值越高表示陽性表達(dá)越低，數(shù)值約低，表示陽性表達(dá)越高。

2.4 統(tǒng)計(jì)方法

3 結(jié)果

3.1 免疫組化鏡下陽性表現(xiàn)

CD4+、CD8+T細(xì)胞、TNF-α、P55陽性信號(hào)均為黃色或棕褐色顆粒，CD4+、CD8+T細(xì)胞定位于胞漿和胞膜，CD4+T細(xì)胞主要在膿腔周表達(dá)，CD8+T細(xì)胞在病變小葉內(nèi)表達(dá)，TNF-α定位于胞漿，在導(dǎo)管上皮、間質(zhì)內(nèi)、漿細(xì)胞、多核巨細(xì)胞表達(dá)，P55定位于細(xì)胞間質(zhì)、細(xì)胞膜，在導(dǎo)管上皮、間質(zhì)內(nèi)、漿細(xì)胞、多核巨細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)。見圖1。

3.2 不同證型肉芽腫性乳腺炎CD4+、CD8+T細(xì)胞、TNF-α、P55表達(dá)結(jié)果

圖1 不同證型中CD4+、CD8+T細(xì)胞、TNF-α、P55陽性表達(dá)(免疫組化SP法，×400)

表1 不同證型中CD4+、CD8+、TNF-α和P55表達(dá)的灰度值

CD4+T細(xì)胞在肝郁痰凝證(腫塊期)與熱毒熾盛證(膿腫期)中表達(dá)均高于正虛毒戀證(潰后期)(P<0.05),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在肝郁痰凝證(腫塊期)中表達(dá)高于熱毒熾盛證(膿腫期)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

CD8+T細(xì)胞在正虛毒戀證(潰后期)表達(dá)高于肝郁痰凝證(腫塊期)與熱毒熾盛證(膿腫期)(P<0.05),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在熱毒熾盛證(膿腫期)中高于肝郁痰凝證(腫塊期)，表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

TNF-α、P55在肝郁痰凝證表達(dá)最明顯，熱毒熾盛證、正虛毒戀證次之,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。見圖2。

圖2 不同證型中CD4+、CD8+、TNF-α和P55表達(dá)的灰度值柱狀圖

3.3 不同證型肉芽腫性乳腺炎CD4+、CD8+T細(xì)胞平均灰度值相關(guān)性分析

對(duì)不同證型肉芽腫性乳腺炎中CD4+、CD8+T細(xì)胞平均灰度值進(jìn)行直線相關(guān)性分析，結(jié)果顯示r=-0.773,P=0.000,即CD4+、CD8+T細(xì)胞在不同證型肉芽腫性乳腺炎的表達(dá)變化呈負(fù)相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即隨著CD4+T細(xì)胞表達(dá)升高CD8+T細(xì)胞表達(dá)降低，見圖3。

3.4 不同證型肉芽腫性乳腺炎TNF-α、P55平均灰度值相關(guān)性分析

對(duì)不同證型肉芽腫性乳腺炎中TNF-α、P55平均灰度值進(jìn)行直線相關(guān)性分析，結(jié)果顯示r=0.835,P=0.000,即TNF-α、P55在不同證型肉芽腫性乳腺炎的表達(dá)變化呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即隨著TNF-α表達(dá)降低，P55表達(dá)降低，見圖4。

圖3 CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞相關(guān)性分析

圖4 TNF-α、P55相關(guān)性分析

3.5 不同證型肉芽腫性乳腺炎T細(xì)胞亞群與TNF-α平均灰度值相關(guān)性分析

對(duì)不同證型肉芽腫性乳腺炎中T細(xì)胞亞群與TNF-α平均灰度值進(jìn)行直線相關(guān)性分析，結(jié)果分別顯示r=0.842,P=0.000,r=-0.864,P=0.000，即在不同證型肉芽腫性乳腺炎TNF-α表達(dá)與CD4+T細(xì)胞表達(dá)呈正相關(guān)，與CD8+T細(xì)胞表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖5、圖6。

圖5 CD4+T細(xì)胞、TNF-α相關(guān)性分析

圖6 CD8+T細(xì)胞、TNF-α相關(guān)性分析

4 討論

肉芽腫性乳腺炎，是指乳腺局限于小葉的非干酪樣壞死的肉芽腫性病變，是一類以肉芽腫為主要病理特點(diǎn)的乳腺慢性炎癥疾病。該病是一種由各種炎癥細(xì)胞及細(xì)胞因子參與的免疫相關(guān)疾病，涉及的細(xì)胞及因子包括T細(xì)胞、干擾素、腫瘤壞死因子、白介素等[7]。在GLM病變導(dǎo)管內(nèi)彌漫炎癥反應(yīng)，分泌的一種或多種物質(zhì)成為抗原，介導(dǎo)IV型超敏反應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)，在GLM出現(xiàn)浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞中,免疫組化顯示較多CD3+、CD4+、CD8+細(xì)胞浸潤(rùn)，較少的是CD20+，證實(shí)為T細(xì)胞浸潤(rùn)[8]。ERHAN[9]在評(píng)估病人免疫組化時(shí)發(fā)現(xiàn)18例患者中有14例具有T細(xì)胞優(yōu)勢(shì)。OGURA等[10]在2例肉芽腫性乳腺炎免疫組化中檢測(cè)到有CD4或CD8的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)病灶處。因此在該病的發(fā)生機(jī)制中機(jī)體自身免疫反應(yīng)起著重要作用[11]。

CD4+T細(xì)胞主要效應(yīng)功能是分泌細(xì)胞因子, 這些細(xì)胞因子又可作用于相同的T細(xì)胞和其他細(xì)胞, 起輔助誘導(dǎo)細(xì)胞及體液免疫的作用。CD4+T細(xì)胞在自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展中起著最重要的作用, 它們所產(chǎn)生的大部分細(xì)胞因子皆為激活免疫反應(yīng)所必需。CD4+T淋巴細(xì)胞功能增強(qiáng), 機(jī)體可發(fā)生過強(qiáng)的免疫應(yīng)答, 導(dǎo)致自身免疫性疾病和超敏反應(yīng)。CD8+T細(xì)胞為抑制/殺傷細(xì)胞(Ts/Tc)，有抑制細(xì)胞及體液免疫的作用。CD4+細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞之間相互協(xié)調(diào)和制約，產(chǎn)生適度的免疫應(yīng)答, 使之既能清除異物抗原, 又不至于損傷自身組織，若CD4+細(xì)胞過強(qiáng)，則易導(dǎo)致機(jī)體自身免疫疾病[12]，T細(xì)胞亞群改變，影響局部細(xì)胞免疫，則促進(jìn)肉芽腫性乳腺炎的發(fā)生。

腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α) , 又被稱作“惡質(zhì)素”,是一種重要的促炎細(xì)胞因子，具有多種生物學(xué)特性，由巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞、T細(xì)胞分泌，促進(jìn)炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，參與細(xì)胞增殖與凋亡等。有研究表明, TNF-α在肉芽腫的形成過程中起重要作用,且已有實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ妥C實(shí)肉芽腫的形成與TNF-α在T細(xì)胞的募集密切相關(guān)[13]。CD4+、CD8+分泌細(xì)胞因子參與免疫應(yīng)答，在遲發(fā)性超敏反應(yīng)的早期，細(xì)胞因子TNF-α及其受體P55表達(dá)增加[14]。TNF-α促進(jìn)其他炎癥因子，如IL-2、IL-6等，或可通過誘導(dǎo)下游單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞等的激活，增加炎癥細(xì)胞的活性及聚集性，促進(jìn)其對(duì)組織的浸潤(rùn)，導(dǎo)致局部炎癥反應(yīng)，加重?fù)p害[12]。

本研究中，CD4+T細(xì)胞、TNF-α、P55表達(dá)在肝郁痰凝證(腫塊期)最高，熱毒熾盛證(膿腫期)、正虛毒戀證(潰后期)次之；而CD8+T細(xì)胞的表達(dá)與其相反。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，CD4+、CD8+T細(xì)胞二者之間呈負(fù)相關(guān)；TNF-α與受體P55二者之間呈正相關(guān)；在不同證型GLM中，TNF-α、P55表達(dá)與CD4+T細(xì)胞表達(dá)呈正相關(guān)，與CD8+T細(xì)胞表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。

在疾病發(fā)生時(shí)，自身免疫反應(yīng)增強(qiáng)，T細(xì)胞比例失調(diào)，免疫系統(tǒng)紊亂，CD4+T細(xì)胞處于高表達(dá)狀態(tài)、CD8+T細(xì)胞反之，免疫功能亢進(jìn)、抑制功能減弱，導(dǎo)致發(fā)生過強(qiáng)的免疫應(yīng)答。疾病進(jìn)展時(shí)，免疫反應(yīng)先是持續(xù)亢進(jìn)狀態(tài)，CD4+T細(xì)胞水平過高、CD8+T細(xì)胞水平降低；在后期，CD4+T細(xì)胞表達(dá)逐漸降低、CD8+T細(xì)胞表達(dá)升高，自身免疫反應(yīng)逐漸降低、抑制自身免疫反應(yīng)增強(qiáng)，疾病趨于平穩(wěn)狀態(tài)，逐漸恢復(fù)免疫平衡。因此我們推測(cè)，在GLM的治療過程中, 可從免疫調(diào)節(jié)劑方面著手, 通過下調(diào)CD4+T細(xì)胞、上調(diào)CD8+T細(xì)胞來改變T細(xì)胞亞群的比例，從而可削弱這種過強(qiáng)的免疫反應(yīng)，使CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞之間達(dá)到平衡，為治療肉芽腫性乳腺炎乳腺炎提供新的角度。

TNF-α、P55參與了肉芽腫乳腺炎的發(fā)生發(fā)展，與肉芽腫的形成密切相關(guān)。初期疾病嚴(yán)重階段TNF-α的大量釋放，其需與受體結(jié)合方能發(fā)生作用，因此其受體相應(yīng)的升高，在疾病的演變中，隨著TNF-α的降低，其受體減少。在疾病發(fā)展過程中，TNF-α與其受體P55結(jié)合，激活相關(guān)通路，招募其他炎癥細(xì)胞如白細(xì)胞大量聚集在炎癥部位，擴(kuò)大炎癥反應(yīng)，局部激活血管內(nèi)皮細(xì)胞, 增加血管通透性，損傷局部微循環(huán)等。因此我們推測(cè)可以在一定程度上抑制TNF-α因子的釋放，或可以考慮使用TNF-α抑制劑，干擾相關(guān)通路，來緩解GLM的嚴(yán)重程度，達(dá)到治療效果。

綜上所述，在GLM不同中醫(yī)證型中，邪正交爭(zhēng)、陰陽盛衰，隨著腫塊期、膿腫期、潰后期病情演變過程，T淋巴細(xì)胞與相關(guān)細(xì)胞因子亦存在免疫調(diào)節(jié)變化。T淋巴細(xì)胞可產(chǎn)生TNF-α，而TNF-α又可刺激T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生其他相關(guān)因子，進(jìn)一步促進(jìn)T細(xì)胞增殖分化，共同參與疾病的發(fā)生發(fā)展。這對(duì)肉芽腫性乳腺炎的診斷治療提供了不同的治療思路，未來關(guān)于GLM的治療必然會(huì)多元化、多靶點(diǎn)、多種治療手段共同協(xié)作。