侯敏,楊瀟*,宋囡,王智民,曹慧敏,高天舒*

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院,遼寧 沈陽 110034;2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué),遼寧 沈陽 110032; 3.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,遼寧 沈陽 110032)

自身免疫性甲狀腺炎(Autoimmune thyroiditis,AIT),是內(nèi)分泌系統(tǒng)常見的一類慢性、反復(fù)發(fā)作的自身免疫病，在我國地區(qū)發(fā)病率逐步上升[1]，是甲狀腺功能減退、橋本腦病、妊娠期甲狀腺功能異常、流產(chǎn)、產(chǎn)后甲狀腺炎的關(guān)鍵因素，并能影響婦女后代智力發(fā)育，其影響全球大約10%人群。本課題組在前期臨床研究中發(fā)現(xiàn)，中藥復(fù)方具有很好的臨床療效[2]，前期動物實驗進一步證實益氣化痰活血方能有效減輕AIT小鼠甲狀腺淋巴細胞的炎性浸潤、明顯減輕甲狀腺炎程度、降低分泌炎癥細胞因子IL-17的Th17細胞比例，具有改善AIT小鼠免疫失常作用[3-6]。Th17細胞通過分泌IL-17發(fā)揮主要生物學(xué)效應(yīng)，而Ets-1則是Th17細胞分化的負調(diào)控因子，能抑制IL-17生成[7],本實驗研究將從Ets-1角度探討益氣化痰活血方對AIT小鼠甲狀腺炎癥因子IL-17的影響，將部分揭示益氣化痰活血方對于改善AIT小鼠免疫炎癥的具體機理。

1 材料

1.1 動物

由美國杰克遜實驗室引進NOD.H-2h4種鼠2雌2雄，遼寧中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心繁育到8周齡同批次小鼠，共60只，SPF級。

1.2 藥物

中藥飲片由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院提供，處方為益氣化痰活血方(紅參 15 g，黃芪 30 g，當(dāng)歸10 g，莪術(shù) 10 g，法半夏 10 g，浙貝母 20 g，生牡蠣 15 g，鱉甲 10 g)，制備成生藥量為2.0 g/mL水煎液；陽性對照藥硒酵母片(牡丹江靈泰藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號：國藥準字H10940161，規(guī)格：50 μg/片)，以去離子水溶化成濃度為1.625 μg/mL。

1.3 主要試劑

無水乙醇(中國國藥)，三氯甲烷(中國國藥)，Trizol試劑盒(TaKaRa公司)，SYBR Green Mater Mix試劑盒(康為世紀)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(康為世紀)，引物委托TaKaPa公司設(shè)計合成，GADPH PR 5′-GTTCACACCGACCTTCACCA-3′；Ets-1(小鼠)PF 5′-CCAGTCATCCTTCAACAGCC-3′；Ets-1(小鼠)-PR 5′-AGCACGGTCACGCACATAGT-3′；IL-17(小鼠)-PF 5′-CCCTCAGACTACCTCAACCGTT-3′；IL-17(小鼠)-PR 5′-GCTTTCCCTCCGCATTGA-3′。

1.4 主要儀器

TriStar2 LB 942型多功能酶標儀(Berthold company)，SHZ-88型水浴恒溫振蕩器(其林貝爾儀器制造有限公司)，Bio Spec-nano型紫外可見分光光度計(島津，日本)，7500Real Time PCR儀(Applied Biosystems，美國)。

2 方法

2.1 分組

NOD.H-2h4小鼠隨機分為6組：正常組(NG)，模型組(MG)，西藥組(SeG)，益氣化痰活血方高、中、低劑量組(YG-1、YG-2、YG-3)，每組10只，共60只。

2.2 造模

NG組不做處理，其余各組參照國際標準，自由飲用0.05%碘化鈉水，8周后制成AIT動物模型，用于實驗。

2.3 給藥

造模成功后開始灌胃給藥，按每千克體質(zhì)量小鼠的給藥量為人的9.1倍計算，各組小鼠每天灌胃量分別為YG-1：36.40 g/kg、YG-2：18.20 g/kg、YG-3：9.10 g/kg體質(zhì)量。NG組、MG組灌服等量蒸餾水，SeG組灌服硒酵母混懸液，每日1次，灌胃8周后取材。

2.4 標本采集

甲狀腺取材具體方法參照本課題組前期研究[3-6,8-9]。

2.5 小鼠甲狀腺IL-17、Ets-1基因檢測

Trizol處理各組小鼠甲狀腺組織，提取總RNA，超微量紫外分光光度計測定260 nm及280 nm OD值，計算RNA的濃度和純度，然后將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件為37 ℃ 15 min，SYBR Green Mater Mix試劑檢測IL-17、Ets-1基因的mRNA水平，85 ℃ 5 s，PCR循環(huán)條件為95 ℃ 0.5 min 1個循環(huán)，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個循環(huán)，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s 1個循環(huán)，每份標本均行復(fù)管檢測3次。基因的相對表達量用公式2-ΔΔCt方法進行相對定量。

2.6 統(tǒng)計學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 對AIT小鼠甲狀腺IL-17 mRNA表達的影響

AIT小鼠甲狀腺IL-17 mRNA表達與NG組比較顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；SeM組、YG-1、YG-2、YG-3組IL-17 mRNA表達與MG組比較均下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖1，表1。

注：與NG組比較，**P<0.01；與MG組比較，▲▲P<0.01圖1 各組小鼠甲狀腺組織 IL-17 mRNA表達

表1 各組小鼠甲狀腺組織 IL-17及Ets-1 mRNA相對表達量比較

3.2 對AIT小鼠甲狀腺Ets-1 mRNA表達的影響

AIT小鼠甲狀腺Ets-1 mRNA表達與NG組比較顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；SeM組、YG-2、YG-3組 Ets-1 mRNA表達與MG組比較均上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖2，表1。

注：與NG組比較，**P<0.01；與MG組比較，▲▲P<0.01圖2 各組小鼠甲狀腺組織Ets-1 mRNA表達

4 討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認為AIT的病因和病理機制與先天遺傳因素、后天環(huán)境影響、凋亡、免疫炎癥等多方面相關(guān)[10]，其中以分泌IL-17發(fā)揮主要生物學(xué)效應(yīng)的Th17細胞是AIT發(fā)病的機制之一已被證實，我們前期動物實驗研究均已表明AIT機體中IL-17呈高表達，在疾病過程中發(fā)揮促炎作用[9]，F(xiàn)IGUEROA V N，ZAKE T等臨床研究亦發(fā)現(xiàn)橋本甲狀腺炎患者IL-17表達升高[11-12]。

Ets-1是轉(zhuǎn)錄因子Ets家族成員之一，其作用具有兩面性，可激活亦可抑制某些靶基因轉(zhuǎn)錄，并在許多自身免疫性疾病中發(fā)揮作用[13-14]，廣泛參與多種免疫細胞的生長分化和調(diào)控多種細胞因子的表達[15-16]。MOISAN等研究顯示Ets-1缺陷的Th細胞中分化Th17細胞的能力增強，同時可以顯著增加Th17分化相關(guān)因子IL-17等的表達[7,17]，且有研究顯示血清IL-17水平與Ets-1的兩個風(fēng)險性遺傳變異呈強相關(guān)[15]，Ets-1通過影響Th17分化發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)功能的，高表達的Ets-1可以抑制IL-17，進而抑制免疫炎癥反應(yīng)。并且研究顯示其他自身免疫性疾病的發(fā)生亦與Ets-1和IL-17的水平有關(guān)，如ZHANG J等通過對283例系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus，SLE)患者血清IL-17水平的檢測，發(fā)現(xiàn)SLE患者先天性Ets-1基因缺陷程度與IL-17濃度水平顯著相關(guān)，并表明Est-1缺乏更易患SLE疾病[15]。進一步說明了Est-1在免疫疾病中的重要作用。

中醫(yī)將此病歸為“癭病”范疇，中醫(yī)病因與先天稟賦、體質(zhì)因素相關(guān)，亦涉及飲食水土失宜、內(nèi)傷情志等，各種致病因素影響中焦脾胃功能，使脾失衛(wèi)外，脾失健運，濕濁不化，凝聚為痰，氣機不通，血行不暢，結(jié)于甲狀腺，發(fā)為本病。故“脾虛痰瘀”為本病核心病機。脾虛，脾失之衛(wèi)，脾失健運，不能為胃行其津液，則出現(xiàn)濕濁內(nèi)生免疫調(diào)控失衡，正如《靈樞》所云:“脾者，主為衛(wèi)”，《醫(yī)者續(xù)余·宗氣營氣衛(wèi)氣》所說:“衛(wèi)氣者，為言護衛(wèi)周身……不使外邪侵犯也”。因此在本病的治法上，重視補脾氣，創(chuàng)立“補氣健脾、化痰消癭、佐以活血”之法，應(yīng)用自擬益氣化痰活血方進行干預(yù)治療。該方由8味藥物組成，其中紅參、黃芪為君藥，以益氣健脾，推動氣血運行為主，使“氣盛則痰消”；臣藥為法半夏、浙貝母、生牡蠣、鱉甲，以軟堅散結(jié)，化痰消癭為用；佐以莪術(shù)、當(dāng)歸以活血化瘀，配合君臣，增加功效，諸藥合用，既健脾益氣以補本，又能化痰活血以祛標，以標本同治，攻補兼施。

本研究結(jié)果顯示MG組AIT小鼠甲狀腺IL-17 基因表達上調(diào)、Ets-1下調(diào)，YG-1、YG-2、YG-3組IL-17水平均顯著下調(diào)，YG-2、YG-3組Ets-1顯著上調(diào)，提示益氣化痰活血方可能通過上調(diào)Ets-1的表達下調(diào)IL-17的表達來抑制免疫炎癥反應(yīng)，進而改善AIT小鼠甲狀腺免疫失常狀態(tài)。眾所周知，免疫系統(tǒng)及免疫細胞調(diào)控是個復(fù)雜繁多的網(wǎng)絡(luò)，Ets-1既可以負調(diào)控Th17分化，同時亦被其他因素調(diào)控，比如自身免疫疾病中異常表達的微小RNA參與的靶基因負調(diào)控。趙娜等[18-19]研究顯示橋本甲狀腺炎患者甲狀腺組織和外周血單個核細胞中IL-17A和miR-326表達升高，進一步檢測證實Ets-1降低，且Ets-1降低與miR-326和IL-17呈顯著負相關(guān)，同樣，其研究團隊通過體外干預(yù)AIT易感NOD.H-2h4鼠脾臟單個核細胞、體內(nèi)慢病毒尾靜脈及甲狀腺局部注射相關(guān)實驗深入證實了AIT小鼠Ets-1顯著下調(diào)，這兒與我們的結(jié)果一致，且其研究亦證實miR-326的過表達使Ets-1下調(diào)，miR-326可能通過負調(diào)控Ets-1水平促進Th17細胞分化參與AIT疾病過程。因此在后續(xù)的研究中我們有必要進一步拓寬思路，多方向、多角度驗證中藥作用的靶點，揭示中藥作用機制。同樣，機體IL-17表達水平受多種因素影響，比如維生素D代謝、腸道菌群、表觀遺傳學(xué)、其他免疫細胞等均可調(diào)控IL-17細胞水平，僅從某一基因單一角度探討對其的調(diào)控及影響不夠全面，因此仍需更合理全面的實驗進行驗證、關(guān)聯(lián)，為探討中藥復(fù)方干預(yù)自身免疫性甲狀腺疾病提供理論依據(jù)。