任小娟，張星平，王慶全，王冠英

(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830000)

不寐病隸屬于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)失眠癥，其病因病機(jī)復(fù)雜，辨證思路多樣，臨床表現(xiàn)各異。中醫(yī)治療不寐病具有較好的臨床療效，但由于辨證論治的多樣性導(dǎo)致其重復(fù)性較低。本課題組根據(jù)《黃帝內(nèi)經(jīng)》的五神理論、藏象理論以及后世醫(yī)家相關(guān)理論，結(jié)合五臟辨證提出中醫(yī)不寐五神分型診斷法[1]。該分型與五臟辨證相吻合[2]，受中醫(yī)師個體辨證傾向影響較小，客觀性強(qiáng)，可操作性、可重復(fù)性強(qiáng)，也頗有療效，便于臨床、科研推廣運(yùn)用。具體包括腎不藏志不寐、心不藏神不寐、肺不藏魄不寐、肝不藏魂不寐和脾不藏意不寐。其中腎不藏志不寐為中醫(yī)不寐五神分型中較為常見的證型，主癥為夜寐早寤，病位在腎，其病因?yàn)殛?、陽、氣、血、痰、瘀、寒、熱等各種原因?qū)е履I臟的虛損，核心病機(jī)是腎志不入于舍，即腎不藏志[3]。

腎不藏志不寐是以早寤(早醒)為主要臨床特征，多見老年人。這不僅與我們前期腎不藏志不寐臨床研究相一致，而且與ANWAR E AHMED研究所發(fā)現(xiàn)的老年失眠多導(dǎo)睡眠圖(PSG)中早醒的睡眠特征相吻合[4]。故我們選擇衰老大鼠進(jìn)行睡眠剝奪建立腎不藏志不寐大鼠。D-半乳糖致亞急性衰老和對氯苯丙氨酸(PCPA)致失眠是衰老研究和失眠研究中常用經(jīng)典造模方法[5-6]。有研究發(fā)現(xiàn)抑制性神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸(GABA)與睡眠有著密切聯(lián)系[7]；凋亡蛋白B細(xì)胞淋巴瘤基因-2(Bcl-2)和促凋亡因子Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)不僅與衰老有關(guān)[8]，還與睡眠密切相關(guān)[9]。因此，本實(shí)驗(yàn)采用D-半乳糖聯(lián)合PCPA建立腎不藏志不寐大鼠，從神經(jīng)遞質(zhì)和凋亡基因角度，觀察該模型大鼠下丘腦神經(jīng)遞質(zhì)和凋亡基因表達(dá)的變化，通過定位航行探索運(yùn)動軌跡熱圖觀察該模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，為腎不藏志不寐的進(jìn)一步研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組

SPF級雄性大鼠40只，體質(zhì)量(200±20)g，由新疆醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號：SYXK(新)2018-0003。造模前將各組大鼠適應(yīng)飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分成4組，每組10只，包括：空白對照組、老年組、失眠組和腎不藏志不寐組(模型組)。

1.2 主要藥品與試劑

D-半乳糖，北京索來寶公司(批號：1013G051)；對氯苯丙氨酸(PCPA)，美國Sigma公司(批號：SHBJ7057)；熒光定量PCR試劑盒由日本Takara公司提供。GABAARα1、GABAARβ2、GABAARγ2、Bax、Bcl-2引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物序列見表1。

1.3 動物模型的建立

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，然后每組大鼠予以對應(yīng)處理，具體如下。

空白對照組：大鼠予以生理鹽水120 mg/kg頸背部皮下注射，每日1次，連續(xù)42 d，然后生理鹽水300 mg/kg腹腔注射，每日1次，連續(xù)3 d；老年組：大鼠予以D-半乳糖120 mg/kg頸背部皮下注射，每日1次，連續(xù)42 d，然后予生理鹽水300 mg/kg腹腔注射，每日1次，連續(xù)3 d；失眠組：大鼠予以生理鹽水120 mg/kg頸背部皮下注射，每日1次，連續(xù)42 d，然后PCPA 300 mg/kg腹腔注射，每日1次，連續(xù)3 d；腎不藏志不寐組：大鼠予以D-半乳糖120 mg/kg頸背部皮下注射，每日1次，連續(xù)42 d，然后PCPA 300 mg/kg腹腔注射，每日1次，連續(xù)3 d。

1.4 檢測指標(biāo)

1.4.1 大鼠體質(zhì)量變化

造模結(jié)束后(第46天)，測量各組大鼠體質(zhì)量，觀察各組大鼠體質(zhì)量變化。

1.4.2 大鼠定位航行探索運(yùn)動軌跡的比較

采用Morris水迷宮觀察大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力，利用水迷宮裝置觀察大鼠找到平臺所需的時間，于第6天記錄大鼠找到目標(biāo)平臺的定位航行探索運(yùn)動軌跡，比較各組大鼠定位航行探索運(yùn)動軌跡。

1.4.3 下丘腦GABAARα1、GABAARβ2、GABAARγ2mRNA相對表達(dá)量的測定

造模結(jié)束了，水合氯醛麻醉大鼠，冰上取大鼠腦組織，分離下丘腦，提取mRNA用于RT-PCR實(shí)驗(yàn)。RNA提取及cDNA合成參照試劑盒說明書進(jìn)行，合成cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用 Primer 3軟件設(shè)計 RT-PCR 引物，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR 擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性10 min,95 ℃變性10 s，退火10 s(退火溫度：GABAARα1亞單位為60 ℃、GABAARβ2亞單位為60 ℃、GABAARγ2亞單位為60 ℃)，72 ℃延伸10 s，40個循環(huán)后，95 ℃延伸15 s，60 ℃延伸1 min。將目的基因擴(kuò)增結(jié)果經(jīng)內(nèi)參照校正后，以空白對照組目的基因擴(kuò)增結(jié)果作為對照，2-△△ct法表達(dá)為mRNA的相對表達(dá)，計算其余各樣本與空白對照組的比值，作相對定量分析，最終結(jié)果以相對定量結(jié)果表示。

1.4.4 下丘腦Bax、Bcl-2 mRNA相對表達(dá)量的測定

下丘腦cDNA合成步驟同上。采用 Primer 3軟件設(shè)計RT-PCR引物，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR 擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性10 min,95 ℃變性10 s，退火10 s(退火溫度：Bax亞單位為62 ℃、Bcl-2亞單位為62 ℃)，余步驟同上。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 體質(zhì)量的比較

與空白對照組比較，模型組大鼠體質(zhì)量明顯減少(P<0.01；與模型組比較，失眠組、老年組大鼠體質(zhì)量均明顯增加(P<0.01)。見圖1。

注:A:空白對照組；B:老年組；C:失眠組；D:模型組；與空白組比較，##P<0.01;與模型組比較，**P<0.01圖1 各組大鼠體質(zhì)量變化

2.2 定位航行探索運(yùn)動軌跡的比較

與空白對照組比較，失眠組、老年組和模型組運(yùn)動軌跡均明顯延長，其中模型組找到目標(biāo)靶平臺運(yùn)動軌跡最長。軌跡熱圖見圖2。

2.3 下丘腦GABAARα1、GABAARβ2、GABAARγ2 mRNA的相對表達(dá)量

與空白組比較，模型組大鼠下丘腦GABAARα1、GABAARβ2、GABAARγ2mRNA的相對表達(dá)量均顯著減少(P<0.05，P<0.05，P<0.01)；與模型組比較，老年組大鼠下丘腦GABAARα1的相對表達(dá)量顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，失眠組大鼠下丘腦GABAARβ2的相對表達(dá)量顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，老年組和失眠組大鼠下丘腦GABAARγ2的相對表達(dá)量無明顯變化(P>0.05)。見圖3。

2.4 下丘腦Bax、Bcl-2 mRNA的相對表達(dá)量

與空白組比較，老年組、模型組大鼠下丘腦Bax mRNA的相對表達(dá)量顯著增加(P<0.05)，老年組、模型組大鼠下丘腦Bcl-2mRNA的相對表達(dá)量顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，失眠組下丘腦Bax mRNA的相對表達(dá)量顯著減少(P<0.05)，失眠組大鼠下丘腦Bcl-2 mRNA的相對表達(dá)量顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，老年組大鼠下丘腦Bax和Bcl-2 mRNA的相對表達(dá)量無顯著變化(P>0.05)。見圖4。

注:A:空白對照組；B:老年組；C:失眠組；D:模型組；與空白組比較，#P<0.05，##P<0.01;與模型組比較，*P<0.05圖3 下丘腦GABAARα1、GABAARβ2、GABAARγ2mRNA的相對表達(dá)量

3 討論

有研究發(fā)現(xiàn)老年人隨著年齡的增加會伴隨認(rèn)知能力的下降[10]，失眠會增加老年人癡呆的風(fēng)險[11]，這說明老年失眠會出現(xiàn)認(rèn)知能力的下降。Morris水迷宮(MWM)實(shí)驗(yàn)可以分析動物的定位導(dǎo)航能力和空間探索能力，是推斷實(shí)驗(yàn)動物的學(xué)習(xí)記憶能力的常用方法[12]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)腎不藏志不寐大鼠探索目標(biāo)平臺的運(yùn)動軌跡明顯長于正常大鼠，提示腎不藏志不寐大鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降。

γ-氨基丁酸(GABA)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，它能夠抑制神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元，具有神經(jīng)保護(hù)作用，能夠起到催眠、鎮(zhèn)靜和抗焦慮等功能[13]。GABA是通過與其受體相結(jié)合產(chǎn)生神經(jīng)抑制性作用發(fā)揮鎮(zhèn)靜作用，其受體包括GABAA受體(GABAAR)、GABAB受體(GABABR)和GABAC受體(GABACR)[14]。其中GABAAR是離子通道型受體，是很多臨床常用的鎮(zhèn)靜、抗焦慮及抗驚厥藥等的靶受體[15]。GABAARα1、GABAARβ2、GABAARγ2型受體較常見，它們對睡眠的調(diào)節(jié)作用起著重要的影響[16]。JO K[17]研究發(fā)現(xiàn)黃精的水提取物能夠增加大鼠皮質(zhì)GABAARγ2蛋白表達(dá)從而改善睡眠。本研究發(fā)現(xiàn)腎不藏志不寐大鼠下丘腦GABAARα1、GABAARβ2、GABAARγ2mRNA的相對表達(dá)量均低于對照組，提示腎不藏志不寐的機(jī)制可能與下丘腦抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA基因表達(dá)下降有關(guān)。

睡眠具有保護(hù)神經(jīng)元，防止和修復(fù)神經(jīng)細(xì)胞損傷的作用[18]。B細(xì)胞淋巴瘤基因-2(Bcl-2)蛋白家族是第一個被發(fā)現(xiàn)參與凋亡調(diào)控過程的基因家族，在細(xì)胞凋亡過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用[19]。Bcl-2家族成員由抗凋亡蛋白(Bcl-2，Bcl-2L和Bcl-w)和促凋亡蛋白(Bax，Bak，Bad，Bim和Bit等)組成[20]。其主要功能是直接調(diào)節(jié)線粒體膜的滲透性，調(diào)節(jié)促凋亡因子Bax的釋放，從而發(fā)揮抗凋亡或促凋亡的作用。促凋亡成員和抑凋亡成員的比例可促進(jìn)或抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生，其中以Bcl-2和Bax最具代表性[21]。有研究發(fā)現(xiàn)Bcl-2/Bax比例在晚上睡眠時間最高，而在失眠24 h之后發(fā)現(xiàn)Bcl-2/Bax比例會下降[22]。ARTAMOKHINAI V等發(fā)現(xiàn)Bcl-2、Bax在睡眠覺醒周期中也發(fā)揮著重要作用[23]。本研究發(fā)現(xiàn)腎不藏志不寐大鼠下丘腦Bcl-2 mRNA的相對表達(dá)量低于對照組，Bax mRNA的相對表達(dá)量高于對照組，提示腎不藏志不寐的機(jī)制可能與下丘腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)研究了D-半乳糖聯(lián)合PCPA建立的腎不藏志不寐大鼠下丘腦神經(jīng)遞質(zhì)和凋亡基因。結(jié)果表明，腎不藏志不寐大鼠下丘腦神經(jīng)遞質(zhì)基因GABAARα1、GABAARβ2、GABAARγ2mRNA的表達(dá)較正常對照組下調(diào)，下丘腦凋亡基因Bcl-2 mRNA的表達(dá)較正常對照組下調(diào)，Bax mRNA的表達(dá)較正常對照組上調(diào)。腎不藏志不寐大鼠模型的建立是腎不藏志不寐臨床研究和實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)，神經(jīng)遞質(zhì)和凋亡基因的調(diào)控可以作為腎不藏志不寐實(shí)驗(yàn)研究的新的切入點(diǎn)。