鄧時銘, 劉 麗, 褚武英, 李躍輝, 王江偉, 陳圓華

(1.湖南省水產(chǎn)科學研究所，湖南 長沙 410153；2.長沙學院生物工程與環(huán)境科學學院，湖南 長沙 410003；3.湖南農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，湖南 長沙 410128)

中華鱉(Peodiscussinensis)蛋白質(zhì)含量高，營養(yǎng)豐富、全面，又可入藥，是老百姓喜愛的水產(chǎn)品食物，也是我國重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)濟動物[1].但隨著中華鱉養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，各類疾病頻繁發(fā)生，如紅脖子病、穿孔病、疥瘡病、腐皮病等，給養(yǎng)殖戶造成了重大經(jīng)濟損失，也給我國中華鱉養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展帶來了巨大阻力.中華鱉疥瘡病(病變后期又叫穿孔病[2])病原種類較多，有嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌、點狀產(chǎn)氣單胞菌和普通變形桿菌等，存在單獨感染、混合感染或繼發(fā)感染，發(fā)病率可達到10%～50%，死亡率可達30%～40%[3-6].2018年6—10月，湖南漢壽某養(yǎng)殖場飼養(yǎng)的幼鱉出現(xiàn)疥瘡病理特征，其運動遲緩，不攝食，背甲和腹甲部出現(xiàn)黃豆大小的白點并逐步擴大，白點內(nèi)容物呈豆腐渣樣，腸道無食物，肝臟有白點，呈花肝狀，死亡率達100%.在排除寄生蟲和病毒感染后，本試驗對臨死幼鱉疥瘡病原菌進行分離，并采用人工感染回歸試驗驗證病原菌致病性，通過16S rDNA基因和生理生化指標確定病原菌種類，通過病理組織切片觀察機體的病理變化,并通過體外藥物敏感性試驗篩選防控藥物，以期為中華鱉疥瘡病的診斷與防控提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

發(fā)病幼鱉來源于湖南省漢壽縣，單只質(zhì)量約為100 g；健康幼鱉來源于湖南省水產(chǎn)原種場，單只質(zhì)量約為120 g，體質(zhì)健壯，外表無損傷.

1.2 病原菌的分離與純化

無菌條件下，取體表病灶、肝臟、腸道內(nèi)容物劃線接種于營養(yǎng)瓊脂平板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，再挑取單個優(yōu)勢菌落28 ℃純化培養(yǎng)18～24 h，4 ℃保存?zhèn)溆?

1.3 分離菌形態(tài)鑒定

將分離菌分別接種于瓊脂平板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h，挑取單個菌落進行革蘭氏染色和生理生化試驗，結合《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[7]、《Bergey′s manual of determinative bacteriology》[8]、《藥理實驗方法學》[9]和VITEK2-compact鑒定系統(tǒng)進行鑒定.

1.4 分離菌16S rDNA序列分析

按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明方法提取分離菌株總DNA，以27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)為引物進行PCR擴增，釆用DNA純化回收試劑盒純化回收16S rDNA產(chǎn)物，然后由鉑尚生物技術(上海)有限公司測序.將所得16S rDNA序列在NCBI的GenBank/Blast中進行同源性比對分析；通過ClustalW、DNAstar和Mega 4等軟件，采用鄰接法(neighbour-joining method)構建系統(tǒng)發(fā)育樹.

1.5 人工感染試驗

試驗在室內(nèi)進行.將健康幼鱉置于盛有自來水的小塑料桶中(自來水連續(xù)充氣，水溫保持28～30 ℃)，暫養(yǎng)7 d后開展人工感染試驗，分設試驗組6組和對照組1組，每組10只.將分離菌Lb18-01和Lb18-02在28 ℃恒溫培養(yǎng)16～18 h后，用無菌生理鹽水沖洗，分別配制成1.0×108、5.0×108、1.0×109cfu·mL-1細菌懸濁液，共6個濃度組.從幼鱉后肢窩注射0.1 mL菌液，對照組注射等量生理鹽水.試驗期間適量投喂，連續(xù)觀察15 d，記錄幼鱉發(fā)病情況，對瀕死病鱉進行解剖及病原菌分離與鑒定.

1.6 致病菌的藥物敏感性試驗

采用紙片法進行藥物敏感性試驗[7]，每種藥敏片(直徑6 mm)重復5次.按照中華人民共和國衛(wèi)生部制定的紙片法抗菌藥物敏感試驗標準(WS/T125)判斷試驗結果.供試藥物和含藥量見表1.

表1 藥敏片種類

1.7 內(nèi)臟病理組織觀察

無菌條件下，取健康中華鱉和患病中華鱉的肝臟、脾臟、腎臟和腸道組織制作常規(guī)病理切片，Olympus光學顯微鏡下拍照、觀察，比較分析患病中華鱉組織結構的病理變化.

2 結果與分析

2.1 分離菌的形態(tài)特征

從患病中華鱉的體表病灶、腸道分離獲得優(yōu)勢純化菌1株，命名為Lb18-01；從肝臟分離獲得優(yōu)勢純化菌1株，命名為Lb18-02.將2株菌分別接種于普通營養(yǎng)培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)24 h，分離菌Lb18-01在培養(yǎng)基上呈擴散生長，布滿培養(yǎng)基表面，似云霧狀，有腐敗味；分離菌Lb18-02在培養(yǎng)基上形成圓形或橢圓形、淡黃色、半透明的菌落，表面濕潤、光滑，無腐敗味.分離菌Lb18-01革蘭氏染色呈陰性，紫紅色，桿狀或絲狀，長短不一(圖1A)；分離菌Lb18-02革蘭氏染色也呈陰性，紫紅色，短桿狀，兩端鈍圓(圖1B).

2.2 分離菌的生理生化特性

試驗表明，分離菌Lb18-01能分解葡萄糖、麥芽糖，有遷徙運動；分離菌Lb18-02不發(fā)酵鼠李糖、麥芽糖，接觸酶陽性，無運動性(表2).結合文獻[7-9]以及VITEK2-compact全自動細菌鑒定系統(tǒng)分析結果，初步認為分離菌Lb18-01為普通變形桿菌，分離菌Lb18-02為腦膜膿毒性黃桿菌.

表2 分離菌的生理生化特性1)

2.3 16S rDNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析

按照試劑盒方法提取分離菌Lb18-01和Lb18-02的基因組總DNA，純化回收后測得序列長度為1 416和1 387 bp，其GenBank登錄號為MN685224和MN685235.通過NCBI中Blast在線比對分析，2株菌16S rDNA序列與GenBank庫中的序列均有較高的相似性(98%～100%).系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2～3)顯示，分離菌Lb18-01的16S rDNA基因與Proteusvulgaris聚為一簇，分離菌Lb18-02的16S rDNA基因與Chryseobacteriummeningosepticum聚為一簇.由此進一步確定分離菌Lb18-01和Lb18-02分別為普通變形桿菌(Proteusvulgaris)和腦膜膿毒性黃桿菌(Chryseobacteriummeningosepticum).

2.4 分離菌的人工感染試驗結果

健康中華鱉注射分離菌Lb18-01和Lb18-02菌液后，第2天開始行動呆滯，食欲下降，并陸續(xù)出現(xiàn)死亡，死亡率隨菌液濃度的增大而增加.第15天，1.0×109cfu·mL-1Lb18-01試驗組死亡率達到70%，瀕死中華鱉背、腹部先出現(xiàn)紅斑點，后變白并逐漸膿性潰變；1.0×109cfu·mL-1Lb18-02試驗組死亡率達到100%(表3)，病死中華鱉背、腹部無紅斑點.經(jīng)過解剖可見，Lb18-01和Lb18-02試驗組中華鱉的肝臟和膽囊微腫大，腸道紅腫，無食物，與自然發(fā)病癥狀相同；對照組未出現(xiàn)異常癥狀.這表明分離菌Lb18-01和Lb18-02均有較強的致病性.取人工誘發(fā)感染的中華鱉，再次進行病原菌分離，獲得了與Lb18-01和Lb18-02形態(tài)、生理生化特性一致的菌株，表明分離菌Lb18-01和Lb18-02為中華鱉疥瘡的病原菌.

表3 健康幼鱉注射不同濃度菌液后的死亡率

2.5 分離菌的藥物敏感性

試驗結果顯示，青霉素、氨芐西林、四環(huán)素等20種抗生素藥敏片(表1)周圍均無抑菌圈產(chǎn)生，說明這20種抗生素藥物對分離菌Lb18-01和Lb18-02無任何抑制或殺滅作用.

2.6 病理組織觀察

中華鱉患病后，其肝、脾、腎和腸道組織呈現(xiàn)不同的病理特征.動脈管壁增粗，血管周圍炎癥細胞增多(圖4A箭頭1)；靜脈血管破裂(圖4A箭頭2)，竇狀隙擴張，淤積大量紅細胞(圖4B箭頭1)；肝細胞界限模糊(圖4B箭頭2)，可見大量含鐵血黃素沉著(圖4B箭頭3).脾臟被膜增厚，被膜血管擴張，內(nèi)有大量紅細胞和淋巴細胞(圖4D)；紅髓區(qū)擴大，可見大量紅細胞、炎癥細胞和含鐵血黃素沉著(圖4E箭頭1、2、3)；大量淋巴細胞和紅細胞結構異常，嚴重者破裂、解體，白髓區(qū)相對縮小，淋巴細胞數(shù)目明顯減少，毛細血管擴張，淤積紅細胞(圖4E箭頭4).

腎臟外側(cè)區(qū)和內(nèi)側(cè)區(qū)均滲入大量炎癥細胞，內(nèi)側(cè)區(qū)較外側(cè)區(qū)病變嚴重；腎小管上皮細胞及胞核腫大，發(fā)生顆粒變性，細胞游離面微絨毛不明顯，管腔變小或消失，腎小管間界限消失，成為合包體(圖4G箭頭2)；腎小球內(nèi)毛細血管擴張，淤積大量血細胞(圖4G箭頭1)，部分腎小球出現(xiàn)壞死、解體(圖4H).腸道黏膜層上皮細胞排列紊亂(圖4J箭頭1)、密集，杯狀細胞顏色變深，有大量炎癥細胞浸潤(圖4J箭頭3)；固有層毛細血管擴張，淤滯大量紅細胞，黏膜肌層淋巴細胞驟增(圖4J箭頭2)；黏膜下層和肌肉層血管腫脹，大量血細胞淤積其中(圖4K).

3 討論

本試驗結果表明，分離菌Lb18-01和Lb18-02均為中華鱉疥瘡病原菌，其致死率達70%以上.結合形態(tài)特征、生理生化特性和16S rDNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析，將分離菌Lb18-01和Lb18-02確定為普通變形桿菌(Proteusvulgaris)和腦膜膿毒性黃桿菌(Chryseobacteriummeningosepticum).

普通變形桿菌和腦膜膿毒性黃桿菌廣泛分布于自然界，是人和水產(chǎn)動物的條件致病菌[10-14]，也是人、畜、魚共患重要病原[11,15].普通變形桿菌可引起傷口感染而出現(xiàn)疥瘡[15]，也可造成中華鱉穿孔病和白板病[3]；腦膜膿毒性黃桿菌可引起疾病暴發(fā)，致死率高，水生動物中僅見牛蛙的相關報道[16].普通變形桿菌與腦膜膿毒性黃桿菌感染導致中華鱉疥瘡病暴發(fā)，致死率達100%，在我國尚屬首次發(fā)現(xiàn).

據(jù)報道，中華鱉疥瘡病傳染性強，流行時間長，發(fā)病率高，死亡率達20%以上，隨著病程的發(fā)展，疥瘡潰瘍惡化形成穿孔病[5,17].本次自然發(fā)病中華鱉自然發(fā)病病程為6～10個月，病程長，疥瘡病理特征明顯，患病前期僅呈現(xiàn)零星死亡，之后隨著病程延長，中華鱉死亡率顯著上升，可達100%，但未見穿孔現(xiàn)象.因此推斷中華鱉先是感染普通變形桿菌致使疥瘡病發(fā)生，后隨著病情加重及機體抵抗力下降，繼而感染腦膜膿毒性黃桿菌，內(nèi)臟器官呈現(xiàn)不同程度的炎癥、出血和淤血癥狀，進而引起多器官功能障礙[18-19]，死亡率顯著上升.此外，可能由于水產(chǎn)養(yǎng)殖者亂用藥物治療中華鱉疥瘡，導致病原菌對20種抗生素藥物均產(chǎn)生了抗藥性.目前，隨著我國水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)模的增大，病害發(fā)生愈加頻繁，致病菌種類也愈加繁多，病理特征愈加復雜，在水產(chǎn)動物疾病診斷過程中，技術人員不宜單憑表面的病理特征來判斷疾病種類和開處藥方，還應輔以病原菌藥物敏感性試驗，保證科學、合理地選用和使用藥物，延緩病原菌耐藥性的產(chǎn)生.