王濤濤, 楊 勇, 魏 唯, 曾維科, 郭亞楠, 林辰濤, 馬留銀

(1.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院；2.基礎(chǔ)林學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)研究中心；3.生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002)

互花米草(Spartinaalterniflora)是禾本科(Poaceae)、米草屬(Spartina)多年生草本植物，具有較強(qiáng)的耐鹽和繁殖能力，廣泛分布于我國多個(gè)省份的沿海流域.同時(shí)，作為典型的鹽生植物，互花米草在近年來受到科研人員的廣泛研究，盡管缺少參考基因組，研究人員利用轉(zhuǎn)錄組測序手段仍然挖掘出許多鹽脅迫調(diào)控相關(guān)的互花米草基因[1]，并且通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)證明了互花米草基因可以作為水稻耐鹽改良的基因資源[2,3].

NAC家族蛋白是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，不僅調(diào)控植物的生長發(fā)育[4,5]，而且參與植物對(duì)非生物脅迫應(yīng)答的調(diào)控過程[6].擬南芥NAC家族蛋白AtNAC2, AtNAC3和ANAC019通過調(diào)控脅迫相關(guān)基因的表達(dá)促進(jìn)自身抵抗多種非生物脅迫[7-9]，水稻NAC095和NAC066蛋白在促進(jìn)其耐寒和干旱脅迫中同樣具有重要的作用[10,11].NAC家族蛋白在N端含有1個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域又被分為5個(gè)亞結(jié)構(gòu)域(A-E)，NAC蛋白C端的結(jié)構(gòu)多種多樣，從而發(fā)揮不同的轉(zhuǎn)錄激活功能[12].

AtNAC036作為擬南芥NAC家族成員之一，通過負(fù)向調(diào)控細(xì)胞的大小調(diào)控花莖器官的發(fā)育，在擬南芥中過表達(dá)AtNAC036基因?qū)е轮仓觊L勢矮小[13]，表明AtNAC036是擬南芥生長的抑制子.為了探究互花米草NAC36轉(zhuǎn)錄因子的功能，本研究從互花米草三代全長轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)中獲得了擬南芥AtNAC036的同源基因SaNAC36，并對(duì)其蛋白結(jié)構(gòu)域以及物種同源性進(jìn)行了分析.為了分析基因和蛋白的表達(dá)特征，本研究利用qRT-PCR手段對(duì)SaNAC36在不同互花米草組織以及脅迫處理下的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測，同時(shí)在煙草(Nicotianatabacum)和酵母(Saccharomyce)中對(duì)SaNAC36蛋白的亞細(xì)胞定位和轉(zhuǎn)錄激活活性進(jìn)行了驗(yàn)證，并將SaNAC36基因過表達(dá)至擬南芥中以達(dá)到對(duì)SaNAC36轉(zhuǎn)錄因子功能的初步探究.

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)所用的互花米草種子和植株采自江蘇省贛榆市(E119°16′，N34°46′)，首先將互花米草種子置于濕潤的濾紙上萌發(fā)，1周后將萌發(fā)的幼苗轉(zhuǎn)入1/2 Hoagland(pH 8.0)營養(yǎng)液中避光培養(yǎng)3～4周，生長條件設(shè)定為16 h光照(26 ℃)，8 h黑暗(16 ℃)，期間每隔3 d更換1次營養(yǎng)液.進(jìn)行鹽和ABA脅迫處理時(shí)，分別將互花米草幼苗培養(yǎng)在含有800 mmol·L-1NaCl和100 μmol·L-1ABA的營養(yǎng)液中；進(jìn)行干旱脅迫處理時(shí)，將互花米草幼苗平鋪于干燥的濾紙上.所有處理均在第0、1、8和24 h時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行取樣，并將樣本用錫箔紙包裹且立即凍于液氮中，-80 ℃保存?zhèn)溆?

1.2 生物信息學(xué)分析

通過與互花米草全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(http://plantpolya.org/SAPacBio/)進(jìn)行比對(duì)獲得擬南芥AtNAC36同源基因序列，進(jìn)一步通過ORF預(yù)測(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)獲得SaNAC36基因編碼的氨基酸序列；在ExPASy(https://web.expasy.org/protparam/)上對(duì)蛋白的氨基酸數(shù)量、分子量以及等電點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測；利用NCBI(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)獲得SaNAC36蛋白在其它植物中的同源序列，并使用DNAman軟件進(jìn)行蛋白序列比對(duì)并利用MEGA7軟件繪制物種之間的同源進(jìn)化樹.

1.3 cDNA合成

用試劑盒(美基生物, 貨號(hào)R4151-02)提取互花米草幼苗和不同組織的總RNA，具體操作參照說明書進(jìn)行，對(duì)RNA進(jìn)行定性定量檢測確保其質(zhì)量滿足后續(xù)試驗(yàn).取1 μg總RNA，然后利用MonScriptTMRTIII All-in-One Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒(莫納生物，貨號(hào)RN05004M)合成第一鏈cDNA，在每個(gè)反轉(zhuǎn)錄體系中加入1 μL的DNase I用于去除RNA中殘留的DNA，反應(yīng)程序?yàn)椋?7 ℃，2 min；55 ℃，15 min；85 ℃，10 s，將cDNA濃度稀釋至5 ng·μL-1后低溫存儲(chǔ)備用.

1.4 RT-PCR和qRT-PCR試驗(yàn)

RT-PCR和qRT-PCR試驗(yàn)所需引物序列如表1所示，以合成的cDNA作為模板，使用高保真PCR酶進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增.25 μL反應(yīng)體系包含：5 μL 5×PrimeSTAR GXL Buffer、2 μL dNTP Mixture(2.5 mmol·L-1)、0.5 μL正/反向引物(10 μmol·L-1)、1 μL cDNA、0.5 μL Prime STAR GXL DNA Polymerase(TaKaRa公司，貨號(hào)R050Q)和8 μL RNAse-free水.反應(yīng)程序：98 ℃，1 min；98 ℃，10 s，60 ℃，15 s，68 ℃，1 kb·min-1；68 ℃，7 min，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán).

每個(gè)qRT-PCR反應(yīng)體系包含10 μL SYBRGreen Master Mix(莫納生物，RN04002M)、1 μL正/反向引物(10 μmol·L-1)、1 μL cDNA模板和7 μL RNAse-free水.反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃，5 min；95 ℃，10 s，60 ℃，10 s，72 ℃，30 s；72 ℃，5 min，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán).引物GC含量保證在40%～60%且TM值在55～65 ℃之間.樣本之間的表達(dá)量差異使用t-test進(jìn)行計(jì)算，P值小于0.05定義為樣本之間具有顯著性差異.

1.5 煙草瞬時(shí)表達(dá)

利用特異性引物(表1)從互花米草cDNA中擴(kuò)增出SaNAC36基因全長CDS序列，將純化后的PCR產(chǎn)物連接到植物表達(dá)載體pCambia3301上GFP標(biāo)簽的N端，并隨后將載體借助農(nóng)桿菌AGL0轉(zhuǎn)入煙草葉片中.煙草瞬時(shí)轉(zhuǎn)化試驗(yàn)步驟主要包括：將200 μL陽性農(nóng)桿菌菌液接入50 mL含有10 mmol·L-1MES、20 μmol·L-1乙酰丁香酮、50 mg·L-1卡那霉素以及50 mg·L-1利福平的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng).第2天，把菌液低速(4 000 r·min-1)離心15 min后用重懸液(10 mmol·L-1MES、150 μmol·L-1乙酰丁香酮、10 mmol·L-1MgCl2)混勻，并調(diào)D600 nm值至1.0～1.5之間.待重懸的菌液于室溫放置2 h后用無菌注射器注射入新鮮的煙草葉片中，同時(shí)對(duì)注射位置進(jìn)行標(biāo)記，將浸染后的煙草避光培養(yǎng)過夜，第2天取出放置于溫室繼續(xù)生長2 d.進(jìn)行顯微觀察時(shí)，提前取小塊注射位置的煙草葉片于1 mg·L-1的DAPI染液中浸泡30 min，在倒置顯微鏡(Zeiss Axio Observer.A1)下分別觀察SaNAC36以及對(duì)照蛋白在明場(bright field)、GFP和DAPI通道下的表達(dá)情況.

表1 本研究所需的引物序列1)

1.6 轉(zhuǎn)錄自激活試驗(yàn)

將SaNAC36基因全長CDS序列構(gòu)建到酵母表達(dá)載體pGBKT7上SmaⅠ位點(diǎn)處，酵母菌感受態(tài)的制備和轉(zhuǎn)化步驟參考酵母雙雜手冊(cè)(https://www.takarabio.com/).把含有VP16基因的pGBKT7載體和空載體分別作為正、負(fù)對(duì)照，將目的載體和正、負(fù)對(duì)照載體同時(shí)轉(zhuǎn)入Y2HGold酵母菌中，并分別培養(yǎng)在缺少色氨酸(-Trp)的SD培養(yǎng)基上，30 ℃生長3 d后，從板上挑取單克隆搖菌，分別稀釋10倍和50倍后重新培養(yǎng)在正常和添加40 μg·mL-1X-α-gal的SD缺陷培養(yǎng)基上.

1.7 在擬南芥中過表達(dá)SaNAC36基因

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花絮浸染法將先前構(gòu)建好的植物表達(dá)載體pCambia3301轉(zhuǎn)化到rdr6-11背景的模式植物擬南芥中，詳細(xì)的轉(zhuǎn)化方案參考之前的研究[14].使用Basta(1∶1 000)對(duì)T1代轉(zhuǎn)基因苗進(jìn)行篩選，并對(duì)存活的幼苗做進(jìn)一步鑒定.將轉(zhuǎn)基因陽性苗繼續(xù)播種至T3代，純合的株系用于后續(xù)的表型觀察與分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 互花米草SaNAC36基因的序列分析

以互花米草三代全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫為參考，通過比對(duì)獲得與擬南芥AtNAC036同源的互花米草基因SaNAC36(Cluster28982-001).對(duì)SaNAC36基因的全長轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行ORF預(yù)測，其全長CDS為942 bp，編碼313個(gè)氨基酸(圖1).蛋白預(yù)測結(jié)果顯示SaNAC36蛋白分子量約為35.2 ku，等電點(diǎn)為6.72.對(duì)SaNAC36基因全長CDS進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增進(jìn)一步證明對(duì)SaNAC36轉(zhuǎn)錄本ORF的預(yù)測是正確的(圖2).

2.2 互花米草SaNAC36蛋白序列與進(jìn)化分析

利用互花米草SaNAC36蛋白序列在NCBI比對(duì)獲得了水稻、玉米、高粱等物種的同源蛋白序列.比較互花米草、玉米、高粱、水稻和擬南芥的NAC36蛋白序列，發(fā)現(xiàn)它們?cè)贜端都含有保守的NAC結(jié)構(gòu)域(A-E)(圖3).進(jìn)一步將互花米草與其它13種植物的NAC36蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)互花米草與擬南芥NAC36蛋白同源性較高(圖4).

2.3 互花米草SaNAC36基因的表達(dá)分析

為了探究SaNAC36因子與互花米草生長發(fā)育及脅迫應(yīng)答之間的關(guān)系，本研究通過qRT-PCR對(duì)SaNAC36基因的表達(dá)量進(jìn)行了分析.首先通過檢測SaNAC36在互花米草不同組織中的表達(dá)量，結(jié)果表明，SaNAC36在葉片中表達(dá)量最高，相反在莖稈部分的表達(dá)量卻較低(圖5A).隨后分別檢測SaNAC36基因在鹽、ABA以及干旱處理下互花米草幼苗根部中的表達(dá)變化，在3種脅迫條件下，SaNAC36基因的表達(dá)量均趨于下調(diào)，在NaCl處理8 h和ABA處理1 h時(shí)，SaNAC36表達(dá)量降至最低，而在干旱處理8 h時(shí)，SaNAC36表達(dá)量雖有些許回升的趨勢，但表達(dá)量總體隨著處理時(shí)間的增加而降低(圖5B-D).這些結(jié)果表明，SaNAC36基因不僅具有組織表達(dá)差異性，同時(shí)也受到非生物脅迫的調(diào)控.

2.4 SaNAC36蛋白的亞細(xì)胞定位與轉(zhuǎn)錄自激活分析

轉(zhuǎn)錄因子通常在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮功能，為了驗(yàn)證互花米草SaNAC36蛋白是否具有轉(zhuǎn)錄因子功能，本研究首先在煙草葉片中檢測SaNAC36蛋白的亞細(xì)胞定位情況.借助農(nóng)桿菌將帶有SaNAC36基因的表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)入煙草葉片中，然后通過對(duì)煙草葉片所表達(dá)熒光及細(xì)胞核顯色位置的觀察清楚地發(fā)現(xiàn)SaNAC36蛋白在煙草葉片表皮細(xì)胞的細(xì)胞核中表達(dá)(圖6A).在酵母自激活試驗(yàn)中，轉(zhuǎn)入pGBKT7-SaNAC36載體的酵母菌與轉(zhuǎn)入正對(duì)照pGBKT7-VP16的結(jié)果相同，不僅可以生長在缺少Trp的SD培養(yǎng)基上，而且在含有X-α-gal的缺陷培養(yǎng)基上菌斑呈藍(lán)色，然而轉(zhuǎn)入pGBKT7的負(fù)對(duì)照菌斑卻沒有變藍(lán)(圖6B).這些結(jié)果共同表明SaNAC36蛋白具有轉(zhuǎn)錄激活活性，可能發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子功能.

2.5 在擬南芥中過表達(dá)SaNAC36基因產(chǎn)生植株矮小表型

為了進(jìn)一步驗(yàn)證SaNAC36轉(zhuǎn)錄因子的功能，本研究將SaNAC36基因過表達(dá)至模式植物擬南芥中.通過Basta抗性篩選以及RT-PCR鑒定后得到表達(dá)成功的轉(zhuǎn)基因株系8和9(圖7A).對(duì)轉(zhuǎn)基因株系的qRT-PCR試驗(yàn)證明，SaNAC36在過表達(dá)植株里的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組植株(圖7B).對(duì)T3代轉(zhuǎn)基因株系表型的觀察發(fā)現(xiàn)，株系9擬南芥的長勢明顯弱于對(duì)照植株(圖7C)，包括植株高度和果莢長度在內(nèi)的一些生長受到顯著抑制(圖7D)，說明SaNAC36轉(zhuǎn)錄因子可能參與調(diào)控植物的生長發(fā)育.

3 討論

NAC家族轉(zhuǎn)錄因子是植物特有且重要的調(diào)控因子，研究互花米草NAC蛋白功能對(duì)探索NAC轉(zhuǎn)錄因子與互花米草生長發(fā)育之間的關(guān)系具有重要意義.本研究在互花米草全長轉(zhuǎn)錄組中鑒定出NAC家族轉(zhuǎn)錄因子SaNAC36，并從序列比對(duì)、同源進(jìn)化樹、亞細(xì)胞定位、轉(zhuǎn)錄激活活性、基因表達(dá)以及轉(zhuǎn)基因植株表型等方面對(duì)其進(jìn)行分析.序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果表明，互花米草與水稻、高粱、玉米以及擬南芥NAC36蛋白序列相似度很高，且在N端都含有保守的NAC結(jié)構(gòu)域[12]，說明NAC36蛋白在植物中具有高度的同源性.亞細(xì)胞定位和轉(zhuǎn)錄自激活試驗(yàn)進(jìn)一步證明了SaNAC36蛋白具有轉(zhuǎn)錄激活活性，更加表明SaNAC36具有發(fā)揮植物NAC36轉(zhuǎn)錄因子功能的基礎(chǔ).

基因差異表達(dá)是真核生物主要的調(diào)控方式，分析基因差異表達(dá)不僅可以研究基因在植物不同組織發(fā)育中的功能，同時(shí)也有助于探究基因在脅迫應(yīng)答時(shí)的調(diào)控作用[16].本研究表明，SaNAC36基因在互花米草葉片中表達(dá)量較高，說明SaNAC36可能參與互花米草葉片生長發(fā)育的調(diào)控.與正向調(diào)控往往相反，參與負(fù)向調(diào)控的基因往往對(duì)植物的生長發(fā)育起抑制作用，當(dāng)植物響應(yīng)外界脅迫時(shí)，這類基因更傾向于降低自身的表達(dá)量[17,18]，研究表明，在高鹽、ABA和干旱脅迫下，SaNAC36基因的表達(dá)均呈下調(diào)的趨勢，說明SaNAC36因子在互花米草耐脅迫過程中可能主要起到負(fù)向調(diào)控的作用.

系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，SaNAC36與擬南芥AtNAC036蛋白同源性最高，SaNAC36可能具有與AtNAC036相似的功能，因此本研究選擇將SaNAC36基因克隆到擬南芥中以檢測其是否能產(chǎn)生與AtNAC36轉(zhuǎn)基因植株類似的表型[13].通過觀察發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)SaNAC36基因的擬南芥植株相比對(duì)照組植株更加矮小，包括植株高度和果莢長度在內(nèi)的一些生長特征均受到抑制，說明互花米草SaNAC36因子同樣具有負(fù)向調(diào)控細(xì)胞大小的功能.作為互花米草NAC家族成員之一，SaNAC36轉(zhuǎn)錄因子不僅具有保守的結(jié)構(gòu)域，同時(shí)作為核定位的轉(zhuǎn)錄因子，具有與擬南芥AtNAC36蛋白相似的功能，不僅參與互花米草組織的生長發(fā)育，同時(shí)也參與互花米草響應(yīng)非生物脅迫的負(fù)調(diào)控過程中.