賈晉茹，王穎，高爽，田益玲,

1. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院（保定 071000）；2. 河北?。ㄐ吓_(tái)）核桃產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院（邢臺(tái) 054300）；3. 河北省核桃工程技術(shù)中心（邢臺(tái) 054300）

核桃又名胡桃，在中國(guó)有幾千年的栽培歷史，為傳統(tǒng)經(jīng)濟(jì)作物[1-4]。根據(jù)最新數(shù)據(jù)顯示，核桃在世界范圍內(nèi)產(chǎn)量375萬(wàn) t，而中國(guó)約占48%，緊跟其后的是美國(guó)和伊朗[5]。核桃營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高，含有大量脂類(lèi)，尤其是高水平的多不飽和脂肪酸（PUFA）和單不飽和脂肪酸（MUFA），主要包括亞油酸（50%～59%）和油酸（12%～25%）[6]。核桃也是植物蛋白的重要來(lái)源，含有18%～24%蛋白質(zhì)，富含人體必需氨基酸[7]。此外，核桃還具有健胃、潤(rùn)肺、補(bǔ)血等功效[8-9]，核桃肽具有抗衰老和抗氧化等生理功能[10]。核桃除部分出口和國(guó)內(nèi)鮮食銷(xiāo)售外，主要加工成核桃油、核桃粉等產(chǎn)品。核桃油中富含維生素E、甾醇等活性成分，對(duì)降低人體膽固醇，防止血栓的形成有積極的作用，因此，核桃油是一種具有廣闊市場(chǎng)前景的高級(jí)保健油[11]。同時(shí)，它也受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。2016年12月，國(guó)家糧食局發(fā)布《糧油加工業(yè)“十三五”發(fā)展規(guī)劃》，提出堅(jiān)持多油并舉，大力發(fā)展核桃油等新型健康木本食用油[12]。而核桃粕是核桃仁榨油后的主要副產(chǎn)品，含有40%～45%蛋白質(zhì)和豐富的氨基酸，從核桃粕中提取的多酚還具有極強(qiáng)的抗氧化能力[13]。目前核桃粕基本被作為動(dòng)物飼料甚至直接丟棄，沒(méi)有得到充分利用，造成大量資源浪費(fèi)[14]。副產(chǎn)品的不經(jīng)濟(jì)利用阻礙核桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展，提高作為飼料的核桃粕的經(jīng)濟(jì)價(jià)值至關(guān)重要。已有研究報(bào)道了全核溶解脫脂核桃粉中核桃蛋白的表征特性和功能特性。核桃粕在烘培工業(yè)中具有作為食品添加劑的潛力，也有作為肉類(lèi)和乳制品等多種食品配方的潛力[15]。試驗(yàn)對(duì)液壓冷榨后的核桃粕基本組成、蛋白質(zhì)的氨基酸構(gòu)成及其分子量進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂核桃蛋白（河北省邢臺(tái)市綠嶺果業(yè)有限公司）；低分子量蛋白Marker標(biāo)準(zhǔn)品、超低分子量蛋白Marker標(biāo)準(zhǔn)品、四甲基乙二胺（TEMED）、過(guò)硫酸銨、5×蛋白上樣緩沖液（北京索萊寶科技有限公司）；丙三醇、異丙醇、甲醇、冰乙酸、鹽酸、碳酸鈉、碳酸氫鈉（均為分析純）；Tris、丙烯酰胺（Acr）、甲叉雙丙烯酰胺（Bis）、Tricine、甘氨酸（Sigma公司）；十二烷基硫酸鈉（SDS，河北省保定市海泰客生物技術(shù)有限公司）；考馬斯亮藍(lán)G-250（上海藍(lán)季科技有限公司）；乙腈（色譜純，Xingmake Chemicals）。

1.2 儀器與設(shè)備

水分測(cè)定儀MB35；JY600E電泳儀、JY-SCZ2+型垂直電泳槽（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）；馬弗爐（上海識(shí)捷電爐有限公司）；NKB3200自動(dòng)定氮儀、高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）；色譜柱C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，美國(guó) Kromat Universil）。

1.3 脫脂核桃仁基本成分的測(cè)定

水分使用紅外線快速水分測(cè)定儀測(cè)定；灰分根據(jù)GB 5009.4—2016食品中總灰分的測(cè)定；脂肪根據(jù)GB 5009.6—2016中索氏抽提法進(jìn)行測(cè)定；蛋白質(zhì)根據(jù)GB 5009.5—2016中凱氏定氮法進(jìn)行測(cè)定；碳水化合物根據(jù)減差法進(jìn)行計(jì)算，即總碳水化合物含量等于100%減去樣品的水分、脂肪、灰分及蛋白質(zhì)含量的總和；粗纖維根據(jù)GB 5009.10—2003測(cè)定。脫脂核桃仁中氨基酸含量的測(cè)定，參照李娜[16]的方法進(jìn)行。

1.4 脫脂核桃蛋白十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析

1.4.1 試驗(yàn)藥品的配制

1.4.1.1 低分子量蛋白所需溶液的配制

稱(chēng)取30 g丙烯酰胺、0.8 g甲叉雙丙烯酰胺，定容至100 mL；配制10%過(guò)硫酸銨備用；稱(chēng)取3.03 g Tris、14.41 g甘氨酸、1.0 g SDS，調(diào)pH 8.3±0.1，定容至1 000 mL作為電極緩沖液；25 mL異丙醇，10 mL乙酸，定容至100 mL作為固定液；稱(chēng)取0.1 g考馬斯亮藍(lán)G-250、45 mL甲醇、10 mL冰乙酸，定容到100 mL作為染色液；甲醇、冰乙酸、去離子水按1∶1∶8比例配置脫色液。取18.17 g的Tris、0.4 g的SDS，調(diào)至pH 8.8并定容到100 mL作為分離膠儲(chǔ)備液；取6.06 g的Tris、0.4 g的SDS，并調(diào)pH到6.8定容至100 mL，用來(lái)配制濃縮膠儲(chǔ)備液。

量取4.0 mL上述分離膠儲(chǔ)備液、8.0 mL丙烯酰胺/甲叉雙丙烯酰胺貯備液、4.0 mL去離子水、0.8 mL 10%過(guò)硫酸銨、0.008 mL四甲基乙二胺，來(lái)配制15%分離膠。量取1.25 mL上述濃縮膠儲(chǔ)備液、0.75 mL丙烯酰胺/甲叉雙丙烯酰胺貯備液、3 mL去離子水、0.015 mL 10%過(guò)硫酸銨、0.005 mL四甲基乙二胺，來(lái)配制5%濃縮膠。

1.4.1.2 超低分子量蛋白所需溶液的配制

取48 g丙烯酰胺、1.5 g甲叉雙丙烯酰胺，定容至100 mL，作為夾層膠和濃縮膠貯備液；取46.5 g丙烯酰胺、1.5 g甲叉雙丙烯酰胺，定容到100 mL配制成為分離膠貯備液；用12.11 g Tris堿、17.92 g Tricine、1 g SDS，定容到1 000 mL來(lái)作為陰極緩沖液；121.1 g Tris堿，用去離子水溶解到400 mL，調(diào)pH到8.9并定容到500 mL，作為陽(yáng)極緩沖液；182 g Tris堿，用去離子水溶解到300 mL，調(diào)pH 8.45，定容到500 mL后加入1.5 g的SDS，作為凝膠緩沖液。

取1.50 mL上述分離膠儲(chǔ)備液、1.50 mL凝膠緩沖液、0.48 mL丙三醇、1.02 mL去離子水、0.040 mL 10%過(guò)硫酸銨、0.005 mL四甲基乙二胺，配制成為16.5%的分離膠。使用0.407 mL夾層貯備液、0.667 mL凝膠緩沖液、0.926 mL去離子水、0.020 mL 10%過(guò)硫酸銨、0.003 mL四甲基乙二胺，來(lái)配制10%的夾層膠；取0.160 mL濃縮膠貯備液、0.496 mL凝膠緩沖液、1.344 mL去離子水、0.020 mL 10%過(guò)硫酸銨、0.003 mL四甲基乙二胺，來(lái)配制4%濃縮膠。

廬山民宿服務(wù)質(zhì)量總體較好，民宿經(jīng)營(yíng)者能夠熱情友好地接待游客入住。但是針對(duì)廬山民宿主要消費(fèi)人群，即青年群體來(lái)說(shuō)，“長(zhǎng)輩式”溫馨服務(wù)仍然不能滿足他們對(duì)于個(gè)性化、多元化的需求，廬山民宿的差異化服務(wù)有待提高，帶給消費(fèi)者的入住驚喜感不足。大部分民宿基礎(chǔ)設(shè)施較為完善，但仍需改進(jìn)。民宿內(nèi)電視、空調(diào)、桌椅等購(gòu)置較全，床品大多較為干凈整潔。毛巾、牙具等洗漱用品購(gòu)置不全，一些民宿并沒(méi)有提供一次性洗漱用品，而是需要游客自帶，且部分民宿的衛(wèi)生間為公用，私密性較差。由于廬山氣候潮濕，降水較多，導(dǎo)致一些民宿內(nèi)部較為潮濕，甚至在走進(jìn)房間時(shí)能聞到一絲霉味，衛(wèi)生條件較差，極大地影響了住客體驗(yàn)。

1.4.2 樣品處理

稱(chēng)取一定量蛋白質(zhì)，向蛋白中加入一定量的樣品緩沖液，渦旋混合均勻，100 ℃水浴加熱3～5 min，使蛋白變性。冷卻到室溫后，10 000～14 000 r/min離心2～5 min，取上清液直接上樣電泳即可。

1.4.3 Marker處理

低分子量蛋白Marker處理：將分子量范圍14.4～97.4 kDa蛋白溶于400 μL體積的蛋白上樣緩沖液，于沸水浴中加熱5 min，冷卻后進(jìn)行上樣。

超低分子量蛋白Marker處理：將分子量范圍為3.3～20.1 kDa蛋白溶于150 μL體積的蛋白上樣緩沖液，于95 ℃水浴中加熱5 min，冷卻后進(jìn)行上樣。

1.4.4 試驗(yàn)條件

超低分子量蛋白跑膠條件：分離膠、夾層膠以及濃縮膠比例4∶1.5∶1，加10 μL樣之后進(jìn)行電泳，電泳時(shí)，30 V跑1～2 h后，待指示前沿到達(dá)分離膠上沿時(shí)，把電壓調(diào)至100 V，至電泳結(jié)束。采用考馬斯亮藍(lán)染色液對(duì)凝膠進(jìn)行染色1 h，之后放在脫色液進(jìn)行脫色過(guò)夜。

1.5 Marker電泳圖譜分析

在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳中蛋白質(zhì)亞基的相對(duì)遷移率與蛋白質(zhì)分子量對(duì)數(shù)的大小呈線性關(guān)系。以亞基相對(duì)遷移率為橫坐標(biāo)，以蛋白質(zhì)分子量對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，對(duì)低分子量蛋白Marker和超低分子量蛋白Marker繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性擬合，擬合的結(jié)果如圖1和圖2所示。擬合結(jié)果符合表1的擬合方程。根據(jù)脫脂核桃蛋白在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳中所跑出各條帶的分子量的對(duì)數(shù)，換算出各蛋白條帶的分子量。

圖1 分子量14.4～97.4 kDa蛋白Marker與遷移率

圖2 分子量3.3～20.1 kDa蛋白Marker與遷移率

表1 擬合結(jié)果

2 結(jié)果與分析

2.1 脫脂核桃仁基本成分分析

利用1.3.1方法對(duì)核桃粕的主要成分進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

結(jié)果顯示，綠嶺脫脂核桃仁的蛋白質(zhì)含量50.20%，高于中國(guó)大部分地區(qū)脫脂核桃仁的蛋白含量。如云南地區(qū)脫脂核桃仁的蛋白質(zhì)含量42.40%[17]，廣元地區(qū)脫脂核桃仁的蛋白質(zhì)含量43.36%[18]，屬于優(yōu)質(zhì)的植物蛋白，有研究表明植物蛋白具有抗腫瘤和輔助腫瘤治療的作用[19-20]。另外，綠嶺脫脂核桃仁的脂肪含量也較高，為24.67%。云南脫脂核桃仁的脂肪含量8.87%，廣元脫脂核桃仁的脂肪含量23.80%[18]，新疆脫脂核桃仁的脂肪含量1.80%?？梢钥闯鼍G嶺脫脂核桃仁的脂肪含量明顯高于中國(guó)其他地區(qū)。綠嶺脫脂核桃仁中的灰分5.80%，而廣元脫脂核桃仁的灰分4.90%[14]，新疆脫脂核桃仁的灰分0.54%[18]?？梢钥闯?，綠嶺脫脂核桃仁中灰分不低。除此以外，綠嶺脫脂核桃仁的水分和碳水化合物含量較低。綠嶺脫脂核桃仁的水分7.82%，而云南脫脂核桃仁的水分19.26%[17]，新疆脫脂核桃仁的水分9.20%，廣元脫脂核桃仁的水分含量最低，為3.63%[14]。綠嶺脫脂核桃仁的碳水化合物含量為11.51%，而云南脫脂核桃仁的碳水化合物含量為22.41%，廣元脫脂核桃仁為24.31%，新疆脫脂核桃仁為35.95%。4個(gè)地區(qū)脫脂后成分的差異主要是由兩方面造成的，一是核桃的品種，二是核桃壓榨過(guò)程中所采用的工藝。

表2 脫脂核桃仁基本成分分析 %

2.2 綠嶺脫脂核桃蛋白的氨基酸組成分析

采用液相色譜法對(duì)綠嶺脫脂核桃仁中蛋白質(zhì)的氨基酸組成進(jìn)行分析，所測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果顯示，綠嶺脫脂核桃仁含有16種氨基酸，并且以酸性氨基酸和疏水性氨基酸為主，其中6種為人體必需氨基酸，它們分別是苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸、甲硫氨酸以及纈氨酸。其中以醇溶蛋白的谷氨酸和精氨酸的含量是最高的，分別為70.17 mg/g和62.14%。這與Sze等[21]和毛曉英[18]的研究結(jié)果很相近。此外，天冬氨酸含量33.63%，絲氨酸含量20.35%，甘氨酸含量22.67%，亮氨酸含量24.32%，這幾種氨基酸的含量較高。而酪氨酸含量最低，僅0.41%。在試驗(yàn)中未檢測(cè)出色氨酸和賴(lài)氨酸，可能是由于這兩者含量很低，在濃鹽酸的作用下被破壞。因?yàn)榫G嶺脫脂核桃仁中蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸的含量都較高，符合FAO/WHO（1990）的成人推薦標(biāo)準(zhǔn)，是優(yōu)質(zhì)的植物蛋白[22-28]。所以，此核桃蛋白質(zhì)為優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，具有很高的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值，可將此核桃仁中的蛋白質(zhì)提取出來(lái)作為人類(lèi)的蛋白資源。

2.3 綠嶺脫脂核桃蛋白分子量的分布

脫脂核桃蛋白和低分子量蛋白Marker電泳圖譜如圖3所示，脫脂核桃蛋白和超低分子量蛋白Marker電泳圖譜如圖4所示。

對(duì)綠嶺脫脂核桃蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析，脫脂核桃蛋白的亞基分布如圖3和圖4所示，將凝膠染色后，脫脂核桃蛋白條帶清晰可見(jiàn)。脫脂核桃蛋白的條帶數(shù)較多，說(shuō)明蛋白質(zhì)分子量的分布范圍較廣，脫脂核桃中的蛋白質(zhì)組成比較復(fù)雜。顏色越深的條帶代表著此種蛋白質(zhì)含量越高，而顏色越淺則說(shuō)明此種蛋白質(zhì)含量越低。從電泳中可以發(fā)現(xiàn)，脫脂核桃蛋白所含的亞基數(shù)約14條，亞基的分子量范圍為7.8～97.4 kDa，這一結(jié)果與毛曉英[18]和鄧欣倫[29]的研究結(jié)果較為一致。可以明顯看到在分子量23.49和37.41 kDa處凝膠的顏色較深且條帶較寬，說(shuō)明這2種蛋白質(zhì)含量較高，脫脂核桃蛋白的亞基分子量主要集中在23.49和37.41 kDa。在脫脂核桃蛋白亞基的分子量范圍內(nèi)，最大的亞基分子質(zhì)量為67.9 kDa，最小的亞基分子質(zhì)量為8.13 kDa。這2種亞基的條帶顏色較淺，說(shuō)明其含量較低。常艷敏等[30]對(duì)牛奶蛋白分子量進(jìn)行分析，結(jié)果顯示脫脂牛奶蛋白中的蛋白分子量均在14.0～72.0 kDa，最大的蛋白分子量為67.0 kDa，最小的蛋白分子量為14.2 kDa。將綠嶺脫脂核桃的蛋白分子量與脫脂牛奶蛋白分子量相比較，可得脫脂核桃蛋白分子量大部分小于脫脂牛奶蛋白分子量，利用脫脂核桃蛋白制作脫脂核桃乳制品相比于脫脂牛奶更易于人體消化吸收。

表3 脫脂核桃蛋白氨基酸成分分析 mg/g

圖3 脫脂核桃蛋白和蛋白低分子量蛋白電泳圖譜

圖4 脫脂核桃蛋白和超低分子量蛋白電泳圖譜

3 結(jié)論

主要對(duì)脫脂綠嶺核桃仁進(jìn)行基本組成分析、氨基酸組成分析及蛋白分子量分析。

對(duì)綠嶺脫脂核桃仁的基本成分進(jìn)行測(cè)定發(fā)現(xiàn)，此核桃仁的蛋白含量達(dá)50.20%，脂肪含量為24.67%，高于中國(guó)大部分地區(qū)脫脂核桃仁，說(shuō)明綠嶺脫脂核桃仁是一種優(yōu)良的食品原料，應(yīng)對(duì)其進(jìn)行合理應(yīng)用。

對(duì)綠嶺脫脂核桃蛋白進(jìn)行氨基酸組成分析發(fā)現(xiàn)，脫脂核桃仁中含有16種氨基酸，其中6種為人體必需氨基酸，分別是苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸、甲硫氨酸及纈氨酸。谷氨酸和精氨酸含量最高，谷氨酸含量為70.17 mg/g，精氨酸含量為62.24 mg/g；天冬氨酸、亮氨酸、甘氨酸和絲氨酸含量較高，含量分別為33.63，24.32，22.67和20.35 mg/g。此外，脫脂核桃仁中含有較多蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸，這些都符合FAO/WHO（1990）的成人推薦標(biāo)準(zhǔn)。但酪氨酸含量較低，為0.41 mg/g。所以，可將脫脂綠嶺核桃仁中的這些優(yōu)質(zhì)蛋白提取出來(lái)，作為人類(lèi)的蛋白資源，減少蛋白資源浪費(fèi)。

經(jīng)綠嶺脫脂核桃蛋白SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)，脫脂核桃蛋白的條帶數(shù)較多，約14條，蛋白分子量分布范圍較廣，在7.8～97.4 kDa之間，說(shuō)明核桃蛋白的組成比較復(fù)雜。其中，含量最高的是分子量23.49和37.41 kDa，而亞基分子量最小為8.13 kDa，最大為67.9 kDa。從整體來(lái)說(shuō)，脫脂核桃蛋白質(zhì)中蛋白分子量較小，更容易被人體吸收和利用，所以脫脂核桃蛋白具有很高的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。