李越鯤，梁曉婕，王亞軍，祿璐，周旋

寧夏農林科學院，枸杞工程技術研究所（銀川 750002）

枸杞系茄科（Solanaceae）枸杞屬（Lycium L.）多年生落葉灌木，全球約有80種，中國作為枸杞的主要起源中心，自然分布枸杞屬植物共有7種3變種[1]。其中黃果枸杞（Lycium barbarum L. var. Auranticarpum K. F. Ching）是寧夏枸杞（Lycium barbarumL.）的變種[2]，其果實獨特、色澤鮮亮、鮮食細膩、口感好，具有可觀的市場前景和經濟價值。但目前對黃果枸杞主要營養(yǎng)成分的提取與鑒定、深加工產品研發(fā)等方面的研究還處于起始階段。

黃酮類化合物是枸杞的功效成分之一，具有明顯的抗氧化、清除自由基、提高免疫力等作用[3-4]。課題組前期的研究結果表明黃果枸杞具有高黃酮的特性[5-6]。但對于不同黃果枸杞種質材料中黃酮類化合物的組分及含量仍不清楚。目前，對于枸杞中黃酮類化合物的測定方法已經成熟，常用的方法包括紫外分光光度法、高效液相色譜法（HPLC）、熒光分光光度法等[7-10]，為黃果枸杞黃酮類化合物的提取及應用奠定了良好的基礎。

試驗采用的超高效液相色譜-飛行時間高分辨質譜聯(lián)用儀是可以同時定量和定性的分析系統(tǒng)，具有高分辨、高靈敏度等技術特點，用該檢測系統(tǒng)對具有代表性的7份黃果枸杞種質材料進行黃酮組分的測定，為黃酮組分及其含量數據的精確性提供了有效保證。此外，對7份材料的黃酮組分及含量進行差異性比較分析，為黃果枸杞的開發(fā)利用及深加工產品的研發(fā)提供了一定的理論依據。

1 材料和方法

1.1 采樣地概況

采樣地位于寧夏銀川市蘆花臺園林場枸杞種質資源圃試驗區(qū)，地理位置為106°09′10″E，38°38′49″N，海拔1 114 m，年均溫10 ℃左右，年平均降水量180 mm，全年平均日照時數超過3 000 h，0～30 cm土層的pH為7.90，全鹽含量為0.72 g·kg-1，有機質含量為9.46 g·kg-1。

1.2 試驗材料

供試材料為寧農杞5號（原編號W-12-30）、寧農杞4號（原編號W-13-29）、W-13-26、HZ-13-01、寧夏黃果、W-11-14和W-H-15-03共計7份黃果枸杞種質材料，樹齡相同，栽培及田間管理方式一致，于2019年7月采集同一批新鮮的、無病蟲害的果實作為供試樣品。

1.3 試驗方法

采用超高效液相色譜-飛行時間高分辨質譜聯(lián)用技術測定黃果枸杞鮮果中的黃酮類活性成分。

1.3.1 供試品制備方法

取2 g打碎凍干的枸杞果實樣品于10 mL離心管中，加入5 mL 50%甲醇水溶液，混合均勻后放入超聲儀內35 ℃超聲40 min，然后靜置5 min，取上清液于1 mL離心管中，放入高速離心機中，以1 300 r/min離心10 min，過0.22 um微孔濾膜后裝入1.5 mL自動進樣瓶內，得到枸杞果實提取物。同樣條件得到空白對照品。將樣品放入4 ℃冰箱保存，在分析前取出（保存時間不能超過24 h）。

1.3.2 色譜條件

色譜儀器為島津LC-30A。色譜柱為C18（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）；柱溫為35 ℃；流速為0.5 mL/min；進樣量為5 μL；流動相采用乙腈-0.1%甲酸水溶液的梯度洗脫程序，具體見表1。

表1 流動相梯度洗脫程序

1.3.3 質譜條件

質譜儀器為AB Sciex Triple TOF 5600+。

離子化模式為電噴霧正離子模式，離子源電壓分別為5 500 V，離子源溫度為600 ℃，去簇電壓（DP）分別為100 V，碰撞能量（CE）分別為35 eV，碰撞能量擴展（CES）分別為15 eV。霧化氣體為氮氣，輔助氣1為60 PSI，輔助氣2為50 PSI，氣簾氣為40 PSI。一級質譜母離子掃描范圍為50～1 000，IDA設置響應值超過100 cps的6個最高峰進行二級質譜掃描，子離子掃描范圍為50～1 000，開啟動態(tài)背景扣除（DBS）。

離子化模式為電噴霧負離子模式，離子源電壓分別為-4 500 V，離子源溫度為500 ℃，去簇電壓（DP）分別為100 V，碰撞能量（CE）分別為-35 eV，碰撞能量擴展（CES）分別為15 eV。霧化氣體為氮氣，輔助氣1為60 PSI，輔助氣2為50 PSI，氣簾氣為40 PSI。一級質譜母離子掃描范圍為50～1 000，IDA設置響應值超過100 cps的6個最高峰進行二級質譜掃描，子離子掃描范圍為50～1 000，開啟動態(tài)背景扣除（DBS）。

1.4 數據處理

使用Excel 2007軟件和SPSS 23.0軟件進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 黃果枸杞果實中黃酮組分種類

通過建立4 176種黃酮類活性成分數據庫，采用飛行時間高分辨質譜對數據庫中的活性成分匹配，定性分析枸杞果實中的黃酮類活性成分。樣品溶液正、負離子模式下的總離子流圖如圖1和圖2所示。

黃果枸杞果實提取物正負離子模式下檢測到7大類共計42種活性成分，按每個化合物的質譜響應強度進行定量，由高到低排序依次為去甲丁香色原酮、蘆丁、槲皮素、異黃酮素、苦參醇I、異槲皮苷、6-甲氧基山柰酚-3-O-蕓香糖苷、茵陳色原酮、補骨脂二氫黃酮甲醚、鳶尾黃素-7-O-木糖基葡萄糖苷、異水飛薊賓、沒食子兒茶素、苦參醇F、柳杉雙黃酮A、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷、落新婦苷、木犀草素、草質素、水飛薊賓、去甲升麻素、4-羥基香豆素、二氫楊梅素、二氫桑色素、飛燕草素半乳糖苷、黃酮榕堿、葛根素-6’’-O-木糖苷、麥芽酚、光甘草酮、山奈酚、鬼臼毒醇、4’-O-甲基葛根素、木樨草素3’，7-二-O-葡糖苷酸、槲皮苷、2’’-O-p-香豆?；登G素、桑根酮C、槲皮素-3-龍膽二糖苷、山柰酚-3-O-槐二糖-7-O-葡萄糖苷、Corylifol A、二氫槲皮素、楊梅素、槲皮素-7-O-葡萄糖苷、（+）-沒食子兒茶素。

2.2 黃果枸杞果實中黃酮組分差異性比較

從表2可以看出，7個品種（系）的黃果枸杞共檢測出了5種黃酮組分，且不同品種（系）的含量互相之間存在差異。其中僅有寧夏黃果枸杞果實中含有黃酮榕堿這一成分，其它品種（系）的黃果枸杞果實中均不包含。此外，寧農杞4號枸杞果實中的木犀草素、木樨草素 3’，7-二-O-葡糖苷酸和2’’-O-p-香豆?；登G素的含量均為最大，分別為1.32%，0.69%和0.63%，與其他品種（系）之間存在顯著差異（p＜0.05）；W-13-26枸杞果實中的柳杉雙黃酮A含量顯著高于其他黃果枸杞品種（系）的含量（p＜0.05）。

圖1 枸杞果實提取物正離子模式下與空白對照總離子流圖

圖2 枸杞果實提取物負離子模式下與空白對照總離子流圖

表2 不同種質黃果枸杞黃酮組分差異

從表3可以看出，7個品種（系）的黃果枸杞共檢測出了14種黃酮醇組分，且不同品種（系）的含量互相之間存在差異。其中異鼠李素-3-O-葡萄糖苷、草質素以及槲皮素-3-龍膽二糖苷的含量在7個品種（系）的黃果枸杞之間不具有顯著差異（p＞0.05），其它組分在品種間均具有差異。寧農杞4號在異水飛薊賓、山奈酚、槲皮苷、山柰酚-3-O-槐二糖-7-O-葡萄糖苷以及槲皮素-7-O-葡萄糖苷5種含量上均顯著高于其它品種（系）黃果枸杞果實的含量（p＜0.05），顯示出了明顯的優(yōu)越性；W-13-26在異槲皮苷、6-甲氧基山柰酚-3-O-蕓香糖苷、水飛薊賓含量方面顯著大于其他品種（系）的黃果枸杞；寧夏黃果中蘆丁及槲皮素含量顯著高于其他品種（系）（p＜0.05），寧農杞5號中楊梅素的含量顯著高于其它品種（系）（p＜0.05）。

從表4可以看出，7個品種（系）的黃果枸杞共檢測出了6種異黃酮組分。其中光甘草酮含量互相之間不存在顯著差異（p＞0.05），但僅有寧農杞5號、寧農杞4號和寧夏黃果三個品種果實中含有該組分，其余黃果枸杞品種（系）中未檢出該成分。葛根素-6’’-O-木糖苷在寧農杞5號及W-11-14枸杞果實中的含量較高，在W-H-15-03枸杞果實中的含量較低，同樣在其余黃果枸杞品種（系）中未檢出。其余4種異黃酮組分中，寧農杞4號果實中的異黃酮素含量最高（8.26%），W-H-15-03果實中的4’-O-甲基葛根素含量最高（0.66%），寧農杞5號果實中的Corylifol A含量最高（0.48%），而鳶尾黃素-7-O-木糖基葡萄糖苷在除W-13-26枸杞果實中的其他品種枸杞果實中的含量基本上相同，且不具有顯著差異（p＞0.05）。

從表5可以看出，7個品種（系）的黃果枸杞共檢測出了7種二氫黃酮醇組分。其中二氫桑色素含量在7個枸杞品種（系）中不存在顯著差異（p＞0.05），而其他6種組分在品種（系）間均存在差異?？鄥⒋糏、苦參醇F、落新婦苷、二氫楊梅素C15H12O8及桑根酮C的含量分別在W-13-26、HZ-13-01、W-13-26、W-11-14及寧農杞4號枸杞果實中最高，二氫楊梅素的含量則在寧農杞5號、HZ-13-01及W-11-14中最高，且彼此之間不存在顯著性差異。

表3 不同種質黃果枸杞黃酮醇組分差異

表4 不同種質黃果枸杞異黃酮組分差異

表5 不同種質黃果枸杞二氫黃酮醇組分差異

從表6可以看出，7個品種（系）的黃果枸杞共檢測出了1種二氫黃酮醇組分，即補骨脂二氫黃酮甲醚，其中W-13-26枸杞果實中的含量顯著高于其他枸杞品種系（3.41%）（p＜0.05），其他品種系枸杞果實中的補骨脂二氫黃酮甲醚含量不存在顯著差異（p＞0.05）。在黃烷醇方面，7個品種（系）的黃果枸杞共檢測出了3種組分，分別是沒食子兒茶素、飛燕草素半乳糖苷及（+）-沒食子兒茶素。其中（+）-沒食子兒茶素這一組分僅存在于寧夏黃果中（0.40%），其他黃果枸杞品種（系）中不存在該成分；飛燕草素半乳糖苷這一成分在7種黃果枸杞品種（系）中不存在顯著差異；在沒食子兒茶素含量方面，僅W-13-26黃果品系顯著低于其他黃果枸杞品種（系）（p＜0.05），其他6個品種（系）的黃果枸杞中該含量互相之間不具有顯著差異（p＞0.05）。

從表7可以看出，7個品種（系）的黃果枸杞共檢測出了6種類黃酮的其他物質，其中僅有2種物質（去甲丁香色原酮、去甲升麻素）在7份黃果枸杞材料中均有檢出，其它檢出物質中茵陳色原酮僅存在于寧夏黃果和W-11-14枸杞果實中，且互相之間不存在顯著差異（p＞0.05）；4-羥基香豆素存在于寧農杞4號、W-13-26、HZ-13-01及W-H-15-03四個黃果枸杞品種（系）中，且寧農杞4號枸杞果實中的含量（1.32%）顯著高于其他品種（系）；麥芽酚及鬼臼毒醇則分別在寧農杞5號（0.76%）及寧農杞4號（0.92%）枸杞果實中含量最高。

表6 不同種質黃果枸杞二氫黃酮及黃烷醇組分差異

表7 不同種質黃果枸杞其他物質差異

3 結論

首次采用超高效液相色譜-飛行時間高分辨質譜聯(lián)用技術對7份黃果枸杞種質材料的黃酮組分進行了測定，并對各組分含量進行了差異性分析。結果表明：黃果枸杞含有7大類42個黃酮組分；其中23個是7份黃果枸杞材料共有的，19個組分僅存在于個別黃果枸杞材料中；在種類方面，寧夏黃果中黃酮組分最多，為35種，且黃酮榕堿和（+）-沒食子兒茶素為其獨有；在含量方面，寧農杞4號表現出了明顯的優(yōu)勢，有16種組分均顯著高于其他黃果枸杞材料（p＜0.05）。此次試驗明確了有代表性的黃果枸杞種質材料中黃酮的組成特性，為進一步研究黃果枸杞黃酮類化合物的活性及深加工產品的開發(fā)利用奠定了基礎。